Name: Kwantitatieve analyse van alternatieve Pre-mRNA-Splicing in muis hersenen secties met behulp van RNA In Situ hybridisatie Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Leer kwantitatieve analyse van alternatieve pre-mRNA-splicing in muizenhersenen met RNA in situ hybridisatie. Deze methode detecteert isoform-specifieke signalen en berekent splicing-percentages in verschillende anatomische gebieden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door de American Heart Association [Grant-in-Aid 0365274B naar H.L.], National Cancer Institute [GI SPORE P50CA150964 aan Z.W.], National Institutes of Health [Office van onderzoek infrastructuur gedeeld Instrumentation Grant S10RR031845 aan de lichte microscopie Imaging faciliteit aan de Case Western Reserve University], en China Scholarship Raad [X.G.]. De auteurs danken Richard Lee in de lichte microscopie Imaging Core voor zijn hulp met dia scannen.

Alle van de experimenten die hier beschreven die betrekking hebben op muizen zijn door de Case Western Reserve University institutionele Animal Care en gebruik Comité goedgekeurd. De titel van het protocol 2016-0068 (PI: Hua Lou) is "Rol van alternatieve pre-mRNA-splicing in gewervelde ontwikkeling".
Opmerking: Informatie van alle apparatuur, reagentia en toebehoren gebruikt in dit protocol is opgenomen in Tabel van materialen.
1. Prepareer formaline vaste paraffine-ingebedde secties (FFPE)
<ol><li>
Euthanaseren 1 CD1 mouse en 1 C57BL/6J mouse door cervicale dislocatie. Zorgvuldig opengesneden de schedel met een chirurgische schaar en pincet. Verwijder de hersenen met een primeur. Opmerking: 5-maand-oude CD1 mannelijke muizen en 3-maand-oude C57BL/6J mannelijke muizen werden gebruikt en vergelijkbare resultaten toonde.<ol>
<li>Wassen van de hersenen met PBS. Fix de hele hersenen met een oplossing die 10% formaline bij kamertemperatuur (RT) voor 30 h door de gehele hersenen aanbrengend 50 mL van de oplossing van formaline.</li>
		<li>Wijzig de fixing oplossing PBS en Incubeer de hersenen in PBS's nachts bij 4 ° C. Dehydrateren en inbedden van de hersenen met xyleen en paraffine met behulp van standaardprocedures18.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gebruik een microtoom te snijden ingesloten weefsel in 5 µm delen. Zet de paraffine lint in een waterbad RT eerste, en vervolgens in een waterbad van 45 ° C te verspreiden het lint.
	<ol>
<li>Wanneer de rimpels en plooien in het lint verdwijnen, moet u onmiddellijk secties op glas dia's koppelen. Lucht droog dia's 's nachts op RT. Bake-dia's gedurende 1 uur bij 60 ° C vóór gebruik.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. voorbeeld voorbehandeling
<ol><li>
Deparaffinize weefselsecties. Uitvoeren van deze stappen in een zuurkast.
	<ol>
<li>Vul twee afwassen (figuur 1A) met 250 mL verse xyleen en twee met 250 mL ethanol 100%. Weefsel dia's invoegen in een wassen rack (figuur 1A) en plaats het wassen rack in afwassen na de bestelling en incubatie tijd aangegeven in tabel 1.</li>
		<li>Tijdens elke incubatie, til het wassen rek op en neer meer dan 3 keer in de schotel wassen. Na elke incubatie, verplaatsen snel het wassen rek in de volgende wassen schotel om te voorkomen dat de weefselsecties uitdrogen.</li>
		<li>Na het voltooien van de stappen van de incubatie, door het wassen rek met dia's te verwijderen door de schotel wassen. Plaats het rek in een incubator van 60 ° C gedurende 5 minuten of totdat de dia's volledig droog zijn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Teken een 0,75 '' x 0,75 '' barrière rond de weefselsectie met een hydrofobe barrière-pen. Lucht drogen de barrière voor 3 min op RT.</li>
	<li>
Voorbehandeling van de segmenten
	<ol>
<li>Bereiden van reagentia en apparatuur<ol>
<li>Zet de oven hybridisatie (figuur 1B) en selecteer temperatuur tot 40 ° C 30 min vóór gebruik.</li>
			<li>NAT de luchtbevochtiging papier (figuur 1E) volledig met gedestilleerd water en zet het in dienblad (Figuur 1 d, links) van de controle van de vochtigheid. Houd de lade van de control vochtigheid in de kruising oven.</li>
			<li>700 mL vers 1 x Target ophalen reagentia voor te bereiden door toevoeging van 630 mL dH2O 70 ml 10 x Target ophalen reagentia.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Toepassing van waterstofperoxide.<ol>
<li>De deparaffinized van de dia's op de bank zetten. Voeg 5-8 druppels waterstofperoxide naar een sectie voor het volledig bedekt het weefsel. Incubeer gedurende 10 min op RT.</li>
			<li>Tik op de dia's op een stuk van absorberend papier de waterstofperoxide-oplossing, één dia tegelijk verwijderen. Onmiddellijk de dia invoegt in een rack van het wassen en het rack naar een wassen schotel gevuld met dH2O.</li>
			<li>Wassen van de dia's door het rek omhoog en omlaag te verplaatsen in gedestilleerd water gedurende 3-5 keer. Verplaats het wassen rek naar een wassen schotel gevuld met vers gedestilleerd water en wassen dia's nog een keer.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Uitvoeren van doel ophalen<ol>
<li>Plaats een bekerglas van 1000 mL glas op een hete plaat. Voeg 700 mL vers 1 x Target ophalen reagentia af in het bekerglas en bedek het met folie. Plaats een thermometer in het bekerglas door de folie cover (Figuur 1 c). Zet de verwarmingsplaat en selecteer op hoog voor 10-15 min.</li>
			<li>Wanneer de temperatuur van ophalen reagentia 98 ° C bereikt, schakelt u de temperatuurcontrole van de hete plaat van hoog tot laag om een milde kook. Kook niet meer dan 15 min.</li>
			<li>Ondertussen, zorgvuldig de folie open en zetten van het rek wassen met segmenten binnen de regent ophalen. Dek het bekerglas af opnieuw en incubeer gedurende 15 minuten.</li>
			<li>Gebruik pincet te verwijderen van het rek van het bekerglas naar een wassen schotel gevuld met 200 mL dH2O en spoelen voor 15 s.</li>
			<li>Het rack naar een wassen-schotel met 100% verse ethanol en laat zitten voor 3 min. dia's te verwijderen en hen te drogen in een incubator 60 ° C gedurende 10 minuten.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Toepassen van Protease III<ol>
<li>Plaats de dia's op de vlek rek (Figuur 1 d, rechts). Voeg 5 druppels Protease III ter dekking van het weefsel. Voorzichtig zetten van het rek in de vochtigheid controle lade (Figuur 1 d, links) en schuif de lade in de oven 40 ° C hybridisatie. Incubeer gedurende 30 min.</li>
			<li>Verwijder het dia-rek en zet het Dienblad terug in de oven. Tik op de dia's als u wilt verwijderen van de overtollige vloeistof, één dia tegelijk. De dia invoegt in een rack wassen en plaats het rek in een wassen schotel gevuld met dH2O. zet het rek op en neer om te wassen van de dia's voor 3 - 5 keer.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ISH Assay
<ol><li>
Bereiden van materialen
	<ol>
<li>Vooraf warm 50 x was buffer in een 40 ° C incubator voor 20 min. Mix 2,94 L van dH2O en 60 mL 50 x was buffer te maken 1 x wassen buffer.</li>
		<li>Voorbereiding 50% Haematoxyline kleurstofoplossing door toevoeging van 100 mL Gill Haematoxyline I tot en met 100 mL dH2O. voorbereiden 0,02% (m/v) ammoniak water door toevoeging van 1,43 mL 1 N ammoniumhydroxideoplossing toe aan 250 mL dH2O. Mix goed in een container.</li>
		<li>De sondes en AMP 0 – 6 reagentia op RT 30 min vóór gebruik. Houd de lade van de control vochtigheid in de oven 40 ° C hybridisatie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ISH procedure Opmerking: Om te bekijken de expressie van de Nf1 splicing isoforms en bereken het percentage verbinding aan de randen (PSI) waarde voor exon 23a, drie verschillende ISH sondes die gericht zijn op exon 23a-inbegrepen isovorm, exon 23a-uitgesloten isovorm of beide isoforms zijn gebruikte (Figuur 2 ). De sondes worden gebruikt op adjacently gesneden weefselsecties. Om ervoor te zorgen de nauwkeurigheid van de berekening, is het van cruciaal belang dat de drie weefselsecties worden behandeld precies hetzelfde in de kruising, versterking en signaal detectie stappen.<ol>
<li>Sonde hybridisatie.<ol>
<li>De dia's te verwijderen uit het rek wassen en tik op de overtollige vloeistof uit de dia's. Plaats de dia's in de rek van de vlek.</li>
			<li>Gebruik een potlood op het etiket van de dia's met de naam van de sonde. Zet de drie adjacently gesneden hersenen weefsel dia's samen met drie verschillende Nf1 sondes (Figuur 2) worden gekruist. De opeenvolgende stappen in dezelfde volgorde van dia's uitvoeren.</li>
			<li>Voeg 4 druppels sonde ter dekking van het weefsel. Doe dit één dia tegelijk om te voorkomen dat de secties uitdrogen. Plaats de vlek rek in het Dienblad van de controle van vochtigheid en plaatst u deze in de oven 40 ° C gedurende 2 uur.</li>
			<li>Het wassen van de dia's tweemaal met het wassen van de buffer. Voor elke wassen, vul de kleuring schotel met 200 mL 1 x wassen buffer en plaats een rek wassen in het. Tik op overtollige vloeistof op een papieren handdoek één dia tegelijk en snel invoegen in het rack wassen. De rek van de dia omhoog en omlaag in de schotel voor 3-5 keer voor 2 min op RT.</li>
			<li>Gebruik voor de tweede wash, verse was buffer.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Signaal versterking.<ol>
<li>Tik op de overtollige was buffer van de dia's en plaats ze in de rek van de vlek. Voeg 4 druppels AMP 0 ter dekking van het weefsel. Plaats de vlek rek in het Dienblad van de controle van vochtigheid en plaats deze in de oven voor 30 min op 40 ° C.</li>
			<li>Het wassen van de dia's tweemaal met wassen buffer zoals hierboven beschreven.</li>
			<li>Herhaal deze stap met AMP 1 – 6 na de bestelling en de conditie van tabel 2. Het wassen van de dia's tweemaal na elke stap van de kruising.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Signaal detectie<ol>
<li>Tik op de overtollige was buffer van de dia's en plaats ze in vlek rek. Voeg 2 µL van snel rood B naar 120 µL van snel rood een (1:60-verhouding) in een microcentrifuge buis. Meng goed en voeg toe aan de weefselsectie volledig te dekken. Opmerking: Het totale volume van rode A / B mix is gebaseerd op het aantal en de grootte van weefselsecties. 120 µL is voor een 0,75 '' x 0,75 '' gebied, genoeg voor één sectie. Gebruik het mengsel binnen 5 min en Vermijd blootstelling van de mix aan direct zonlicht of UV-licht.</li>
			<li>Sluit de lade en incubeer gedurende 10 minuten verwijderd van de RT. de oplossing voor een afval container en onmiddellijk de dia's invoegen in een rack wassen en plaats het rek in een wassen schotel gevuld met leidingwater. Weer afspoelen met vers leidingwater.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Counterstaining van de dia 's
	<ol>
<li>Verwijder het wassen rek uit leidingwater en snel kraan op absorberend papier om extra water te verwijderen. Zet het rek in een 50% Haematoxyline kleurstofoplossing en onmiddellijk het rek op en neer meerdere malen verplaatsen. Incubeer gedurende 2 min op RT.</li>
		<li>Breng het dia-rek terug in de schotel van leidingwater. 3-5 keer wassen door het rek op en neer bewegen en vers leidingwater te wijzigen totdat de dia's duidelijk, terwijl de hersenen weefsels paars blijven geworden.</li>
		<li>Het rack naar een schotel met 0,02% ammoniak water verplaatsen. Het rek omhoog en omlaag 2 tot 3 keer totdat de weefsels blauw. Wassen van de dia's 3 tot 5 keer met vers leidingwater in een kleuring schotel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montage van de monsters
	<ol>
<li>De rek van de dia uit de kleuring schotel naar een 60 ° C incubator en incubeer gedurende minstens 15 minuten totdat de dia's volledig droog zijn.</li>
		<li>Plaats 40 µL medium op de dia en zorgvuldig te monteren plaats een dekglaasje 24 x 50 mm aan over de weefselsectie. Lucht droog dia's voor 30 min op RT.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. de gegevensverzameling en analyse
Opmerking: Gebruik een dia scanner voor het scannen van de beelden op de 40 X vergroting.
<ol><li>
Positieve en negatieve controles
	<ol>
<li>Voor elk experiment, zijn positieve en negatieve controles (Figuur 3). Als een goede positieve controle, moet signaal worden zichtbaar als punctate stippen bij 20-40 X vergroting.</li>
		<li>Gebruik de muis (Mm) - PPIB - 1ZZ als positieve controle. Deze sonde is gericht op een gemeenschappelijke huishouding gen PPIB. Voor de negatieve controle is één stip naar elke 20 cellen weergeven achtergrond kleuring per 20 X Microscoop veld aanvaardbaar.</li>
		<li>Gebruik de DapB-1ZZ sonde als een negatieve controle. Deze sonde richt zich op de bacteriële gene dapB. Deze controle-sondes zijn gebruikt in vele ISH assays19.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Signaal detectie en analyse van als expressiepatronen van Nf1 exon 23a
	<ol>
<li>Zoals de kruising signalen zijn aangegeven als punctate stippen, tellen de punten handmatig. Het aantal dots is gecorreleerd met het niveau van de afschriften die door een specifieke sonde is gedetecteerd. Merk op dat het aantal stippen kan ook door ImageJ of SpotStudio software worden geanalyseerd.</li>
		<li>Gebruik drie sondes te kruisen exon 23a-bevattende, exon 23a-ontbreekt isoforms of totale Nf1 afschriften (Figuur 2). Zoals de drie sondes kunnen niet gelijktijdig worden gebruikt, kunt drie aangrenzende hersenen weefselsecties elke sonde te vermengen.<ol>
<li>Als u wilt berekenen procent voor exon 23a verbinding aan de randen in (PSI), het aantal cellen en stippen in verschillende hersengebieden. Voor elk gebied van belang, door meer dan 400 cellen van verschillende subregio's zoals aangegeven in Figuur 4te tellen.</li>
			<li>Gegevens verzamelen van de dezelfde subregio's voor elk van de drie sondes. PSI berekenen als het aantal beeldpunten per cel met de exon 23a opneming sonde / (aantal puntjes per cel met de exon 23a opneming sonde + aantal dot per cel met het exon23a overslaan van de sonde) x 100%.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).</li>
<li>Cieply, B., Carstens, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+alternative+splicing+factors+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Functional roles of alternative splicing factors in human disease.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).</li>
<li>Xiong, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+splicing.+The+human+splicing+code+reveals+new+insights+into+the+genetic+determinants+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease.</a> Science. 347, 1254806(2015).</li>
<li>Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+splice+variants+in+the+5%27UTR+of+Gtf2i+expressed+in+the+rat+brain%3A+alternative+5%27UTRs+and+differential+expression+in+the+neuronal+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel splice variants in the 5'UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5'UTRs and differential expression in the neuronal dendrites.</a> Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).</li>
<li>Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+quantification%3A+in+situ+analysis+of+transcriptome+and+pre-mRNA+alternative+splicing+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li>
<li>Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamic+acid+decarboxylase+1+alternative+splicing+isoforms%3A+characterization%2C+expression+and+quantification+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain.</a> BMC Neuroscience. 15, 114(2014).</li>
<li>Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. R., Ast, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Are+Short+Exons+Flanked+by+Long+Introns+Defined+and+Committed+to+Splicing%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">How Are Short Exons Flanked by Long Introns Defined and Committed to Splicing?</a> Trends in Genetics. 32, 596-606 (2016).</li>
<li>Cassidy, A., Jones, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+in+situ+hybridisation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Developments in in situ hybridisation.</a> Methods. 70, 39-45 (2014).</li>
<li>Meshorer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+and+neuritic+mRNA+translocation+under+long-term+neuronal+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal hypersensitivity.</a> Science. 295, 508-512 (2002).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope+for+in+situ+detection+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li>
<li>Zhu, H., Hinman, M. N., Hasman, R. A., Mehta, P., Lou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neuron-specific+alternative+splicing+of+neurofibromatosis+type+1+pre-mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of neuron-specific alternative splicing of neurofibromatosis type 1 pre-mRNA.</a> Molecular and Cellular Biology. 28, 1240-1251 (2008).</li>
<li>Hinman, M. N., Sharma, A., Luo, G., Lou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromatosis+type+1+alternative+splicing+is+a+key+regulator+of+Ras+signaling+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras signaling in neurons.</a> Molecular and Cellular Biology. 34, 2188-2197 (2014).</li>
<li>Nguyen, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromatosis+type+1+alternative+splicing+is+a+key+regulator+of+Ras%2FERK+signaling+and+learning+behaviors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice.</a> Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).</li>
<li>Zhou, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hu+proteins+regulate+alternative+splicing+by+inducing+localized+histone+hyperacetylation+in+an+RNA-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacetylation in an RNA-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, E627-E635 (2011).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-mediated+histone+modifications+regulate+alternative+splicing+in+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Calcium-mediated histone modifications regulate alternative splicing in cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, E4920-E4928 (2014).</li>
<li>Adzemovic, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+Analysis+in+the+Rat+Central+Nervous+System+and+Peripheral+Lymph+Node+Tissue+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2016).</li>
<li>Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+In+Situ+Hybridization+using+Oligonucleotide+Probes+on+Paraformaldehyde-prefixed+Brain+of+Rats+with+Serotonin+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li>
<li>Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Ultrasensitive+In+Situ+Hybridization+Approach+to+Detect+Short+Sequences+and+Splice+Variants+with+Cellular+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution.</a> Molecular Neurobiology. , (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Deze mededeling wordt verslag uitgebracht het gebruik van BaseScope RNA ISH te onderzoeken als uitdrukking patronen in muis hersenen secties. Het is aangetoond dat anti-zin exon-exon junction sondes korter dan 50 nucleotiden richten kunnen exon integratie en isoforms krachtig en specifiek overslaan. Bovendien kunnen de resulterende signalen worden gebruikt voor het berekenen van de PSI van een alternatieve exon.
Een paar variaties werden getest in de procedure. Bijvoorbeeld, werden bevroren we...

Alternatieve splicing (AS) is een algemeen voorkomend proces dat zich tijdens de rijping van de pre-mRNA voordoet. In dit proces kan een exon differentieel worden opgenomen in volwassen mRNA. Dus, door middel van AS, één gen kunt vele mRNAs die code genereren voor verschillende eiwitproducten. Geschat wordt dat 92 – 94% van menselijke genen ondergaan alternatieve splicing1,2. Het gevolg van abnormale alternatieve splicing patronen van genetische mutaties zijn gekoppeld aan een groot aantal ziekten, waaronder kanker3,4, Amyotrofische laterale sclerose en myotone dystrofie. Het is dus van cruciaal belang om te onderzoeken en alternatieve splicing regulerende mechanismen in een poging om te vinden van nieuwe behandelingen van ziekten bij de mens beter te begrijpen.
ZOALS vaak in een cel type-specifieke manier wordt geregeld. Het is belangrijk om te bepalen van het AS-expressiepatroon van een specifiek gen in een bepaald biologisch systeem. Dit wordt echter ingewikkeld wanneer een complex orgaan dat veel verschillende soorten cellen, zoals de hersenen of het hart bevat, wordt bestudeerd. In dit geval is een ideale keuze van assay systeem RNA in situ hybridisatie (ISH) met behulp van weefsel secties zodat het AS-expressiepatroon van een specifiek gen kan worden opgespoord in veel celtypen tegelijk. Inderdaad, exon-specifieke sondes zijn gebruikt voor de beoordeling van de niveaus van de expressie van een alternatieve exon5,6,7. Deze aanpak is echter niet geschikt voor als patroon analyse om de volgende redenen. Eerste, conventionele ISH methoden gebruiken meestal langer dan 300 sondes bp, terwijl de gemiddelde grootte van gewervelde interne exons (niet eerste of laatste exon) 170 nucleotiden8,9 is. Ten tweede, wanneer een exon-specifieke sonde wordt gebruikt voor het onderzoeken van de splicing patroon van een interne alternatieve exon, de enige mRNA isovorm gedetecteerd door de sonde is degene die de exon, terwijl de isovorm van het mRNA bevat zonder de exon kan niet worden gedetecteerd. Berekening van het percentage verbinding aan de randen (PSI) waarde voor de alternatieve exon is zo ingewikkeld. Bovendien combineert conventionele TL ISH vaak ISH met immunokleuring, waardoor de detectie efficiëntie en robuustheid. Bijvoorbeeld, in een studie die de stress-geïnduceerde onderzocht splicing isovorm over te schakelen van de acetylcholinesterase (AChE) mRNA, heksenkruid werd opgenomen in de sonde ISH en gedetecteerd met behulp van anti-heksenkruid antilichaam. Als alternatief, Biotine-geëtiketteerden sonde werd ontdekt door een conjugaat alkalische fosfatase/daar en een substraat voor alkalische fosfatase10. Noch methode maakt gebruik van elke strategie versterking te verhogen van de gevoeligheid van detectie. Dientengevolge, is het uitdagend om te detecteren van mRNA afschriften die op een laag niveau worden uitgedrukt. Dus is een eenvoudiger en robuuster ISH assay systeem nodig om te analyseren als expressie patronen in situ.
BaseScope onlangs werd ontwikkeld op basis van het platform van RNAscope, een gevestigde en ISH assay systeem op grote schaal gebruikt. Beide assay-systemen gebruiken een doelgroepen gerichte versterking-technologie die een toename van de gevoeligheid van detectie11,12. Wat onderscheidt van elkaar, is de lengte van de reeks van de doelgroep, die zo 50 nucleotiden voor BaseScope en 300-1000 nucleotiden voor RNAscope kort. Het is dus mogelijk om ontwerp-sondes die gericht zijn op exon-exon kruispunten te sporen specifieke alternatieve mRNA isoforms. In de huidige studie, werd een procedure opgericht te onderzoeken zoals expressiepatronen van Neurofibromatose type 1 (Nf1) exon 23a, een alternatieve exon uitgebreid bestudeerd in de dezelfde laboratorium13,14,15 , 16 , 17, in muis hersenen secties. De resultaten tonen aan dat BaseScope is een ideaal systeem om te studeren-expressiepatronen van Nf1 exon 23a in situ. Zoals dit assay-systeem aangepast om te analyseren als expressiepatronen van vele alternatieve exons worden kan, vormt het een krachtige nieuwe tool in de studies van AS.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybridization Oven</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>241000ACD</td><td></td></tr><tr><td>Humidity Control Tray (met deksel)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310012</td><td></td></tr><tr><td>Stain Rack</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310017</td><td></td></tr><tr><td>Hot plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>1160049SH</td><td></td></tr><tr><td>Imperial III Algemeen Doel Incubator</td><td>Lab-Line</td><td>302</td><td></td></tr><tr><td>Slide Scanner</td><td>Leica</td><td>SCN400</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Voorbereidingskit</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>322381</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2000899</td><td></td></tr><tr><td>Protease III*</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2000901</td><td></td></tr><tr><td>10x Target Retrieval</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2002555</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Detectiereagentkit</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>332910</td><td></td></tr><tr><td>AMP 0</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001814</td><td></td></tr><tr><td>AMP 1</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001815</td><td></td></tr><tr><td>AMP 2</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001816</td><td></td></tr><tr><td>AMP 3</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001817</td><td></td></tr><tr><td>AMP 4</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16229B</td><td></td></tr><tr><td>AMP 5-RED</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16229C</td><td></td></tr><tr><td>AMP 6-RED</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001820</td><td></td></tr><tr><td>Fast RED-A</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001821</td><td></td></tr><tr><td>Fast RED-B</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16230F</td><td></td></tr><tr><td>50x Wash Buffer</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310091</td><td></td></tr><tr><td>Negatieve Controle Probe- Mouse DapB-1ZZ</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>701021</td><td></td></tr><tr><td>Positieve Controle Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>701081</td><td></td></tr><tr><td>Controle slide-mouse 3T3 cell pellet</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310045</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Andere benodigdheden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bevochtigingspapier</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310015</td><td></td></tr><tr><td>Wasrek</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>9837976</td><td></td></tr><tr><td>Wasbakken</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>LWS20WH</td><td></td></tr><tr><td>Hydrofobe barrièrepen</td><td>Vector Laboratory</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Glijbanen</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Dekglas, 24 mm x 50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12--545-F</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Chemieën</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>002689</td><td></td></tr><tr><td>100% ethanol (EtOH)</td><td>Decon Labs</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>Formalde solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF94-4</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin I</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>17012359</td><td></td></tr><tr><td>Montagemedium</td><td>Vector Labs</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>Xyleen</td><td>Fisher Scientific</td><td>173942</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantitatieve analyse van alternatieve pre-mrna-splicing in muis hersenen secties met behulp van rna in situ hybridisatie assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternatieve splicing (AS) treedt op in meer dan 90% van menselijke genen. Het expressiepatroon van een alternatief afgesplitste exon wordt vaak geregeld in een cel type-specifieke mode. Als expressie patronen zijn doorgaans geanalyseerd door RT-PCR en RNA-seq geïsoleerd met behulp van RNA monsters van een bevolking van cellen. In situ als voor een bepaalde biologische structuur-expressiepatronen kunnen worden onderzocht door RNA in situ hybridisatie (ISH) met behulp van de exon-specifieke sondes. Echter, dit bepaald gebruik van ISH beperkt gebleven omdat alternatieve exons zijn over het algemeen te kort om te ontwerpen exon-specifieke sondes. In dit verslag is het gebruik van BaseScope, een onlangs ontwikkelde technologie die gebruikmaakt van korte antisense oligonucleotides in RNA ISH, om te analyseren als expressiepatronen in muis hersenen secties beschreven. Exon 23a van Neurofibromatose type 1 (Nf1) wordt gebruikt als een voorbeeld om te illustreren dat korte exon-exon junction sondes robuuste hybridisatie signalen met hoge specificiteit in RNA ISH analyse op muis hersenen secties exposeren. Nog belangrijker, kunnen signalen gedetecteerd met exon integratie - en overslaan-specifieke sondes worden gebruikt voor het op betrouwbare wijze berekenen van het percentage verbinding aan de randen in waarden van Nf1 exon 23a expressie in verschillende anatomische gebieden van de hersenen van een muis. De experimentele protocol en de methode voor de berekening als analyse worden gepresenteerd. De resultaten wijzen erop dat BaseScope biedt een krachtige nieuwe tool om te beoordelen als expressie patronen in situ.

BaseScope ISH werd uitgevoerd met behulp van de drie stammen van de muis: CD1 wild type muizen, C57BL/6J wild type muizen en de mutant muizen Nf123aIN/23aIN in de C57BL/6J achtergrond, in welke exon 23a is opgenomen in alle celtypes als gevolg van gemanipuleerde splice site mutaties14,15.
Als een eerste stap, het ISH assay systeem werd getest met beh...

Een in situ hybridisatie (ISH) protocol dat gebruikmaakt van korte antisense oligonucleotides voor alternatieve pre-mRNA-splicing patronen kunt ontdekken in muis hersenen secties wordt beschreven.

Kwantitatieve analyse van alternatieve Pre-mRNA-Splicing in muis hersenen secties met behulp van RNA In Situ hybridisatie Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van alternatieve pre-mRNA-splicing. Specifiek biedt het een robuust, gevoelig assaysysteem om alternatieve splicingpatronen in situ in weefselsneden te onderzoeken. Met deze methode kan alternatieve splicing gelijktijdig worden geanalyseerd in veel subtypen die zijn opgenomen in complexe biologische structuren, zoals een muizenhersenen.Het grootste voordeel van deze techniek is dat het shock-antistatische exon-junctieprobes in mRNA in situ-hybridisatie gebruikt om isoform-specifieke hybridisatiesignalen te produceren. De technologie voor signaalversterking verhoogt de gevoeligheid van de detectie om robuuste hybridisatiesignalen te bieden. De signalen die werden gedetecteerd, waren specifieke exon-inclusie-ontsnappingsprobes die werden gebruikt om het percentage splicing in vitale gebieden te berekenen in verschillende anatomische delen van een muizenhersenen.In deze studie wordt NF1-exon 23a gebruikt als voorbeeld om het gebruik van het assaysysteem te illustreren. De systeem kan echter worden aangepast voor het analyseren van expressiepatronen van veel alternatieve exons. Om de muizenhersened in paraffin

quantitative-analysis-alternative-pre-mrna-splicing-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Vanwege het tijdelijke karakter van de pre-mRNA, kan het moeilijk zijn te isoleren en te...

Een snelle High-throughput Methode voor Mapping Ribonucleoproteins (RNP&#39;s) op de menselijke pre-mRNA

This video demonstrates the detection of serotonin receptor RNA synthesis using oligonucleotide probes in rat brain tissue affected by serotonin syndrome. The protocol includes tissue pretreatment, probe hybridization, and enzymatic detection to visualize and quantify serotonin receptor RNA expression under a microscope.

In Situ Hybridization Using Oligonucleotide Probes to Study RNA Expression in Rat Brain Sections

Het is aangetoond dat de regulatie van alternatieve splicing bijdraagt aan de epitheel-mesenchymale overgang (EMT), een essentieel cellulair programma in verschillende fysiologische en pathologische processen. Hier beschrijven we een methode die gebruikmaakt van een induceerbaar EMT-model voor de detectie van alternatieve splicing tijdens EMT.

Detectie van alternatieve splicing Tijdens-mesenchymale transitie

RNA in situ hybridisatie (ISH) maakt de visualisatie van RNA's in cellen en weefsels mogelijk. Hier laten we zien hoe combinatie van RNAscope ISH met immunohistochemie of histologische kleurstoffen met succes kan worden gebruikt om mRNA's te detecteren die gelokaliseerd zijn in axonen in secties van muis- en menselijke hersenen.

Detectie van Axonally Gelokaliseerde mRNA in Brain secties met behulp van High-Resolution<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie

Het lokaliseren van genexpressie naar specifieke celtypen kan een uitdaging zijn vanwege het ontbreken van specifieke antilichamen. Hier beschrijven we een protocol voor gelijktijdige driedubbele detectie van genexpressie door dubbele fluorescentie RNA in situ hybridisatie te combineren met immunokleuring.

De combinatie van Double Fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie met immunolabel voor detectie van de expressie van drie genen in de hersenen van muizen Secties

Hier beschrijven we een protocol gericht op onderzoek naar de gevolgen van afwijkende splicing op resistentie in solide tumoren en hematologische maligniteiten. Om dit doel te bereiken, analyseerden we het transcriptoom profielen van de ouders en bestand in vitro modellen door middel van RNA-seq en vestigde een qRT-PCR-methode om kandidaatgenen te valideren.

Met behulp van RNA-sequencing te detecteren Novel Splice varianten Gerelateerd aan Drug Resistance in<em&gt; In Vitro</em&gt; Cancer Models

Alternatieve splicing (AS) en alternatieve polyadenylation (APA) vergroten de diversiteit van transcriptisovormen en hun producten. Hier beschrijven we bioinformatische protocollen om bulk RNA-seq en 3'-eindsequencingtests te analyseren om AS en APA te detecteren en te visualiseren, variërend tussen experimentele omstandigheden.

Identificatie van alternatieve splicing en polyadenylation in RNA-seq-gegevens

We hebben een Duplex in situ hybridisatietest opgezet om insulinereceptorisovormen IR-A en IR-B in de plexus choroid muizen in kaart te brengen, waardoor de beperkingen van traditionele methoden worden overwonnen. Deze benadering met hoge resolutie onthult isovormspecifieke expressie en biedt nieuwe inzichten in insulinesignalering in de hersenen en mogelijke isovormgerichte therapieën voor neurologische aandoeningen.

Nauwkeurige visualisatie van insulinereceptoren A en B in de hersenen van muizen met een RNA in situ hybridisatietest

Dit protocol biedt een gestroomlijnde computationele pijplijn voor het kwantificeren van ontluikende enhancer-transcripties. Door de toegankelijkheid van chromatine, de chromatinefunctie en transcriptiegegevens te integreren, maakt het nauwkeurige detectie en strengspecifieke analyse van de enhancer-activiteit in complexe intragene regio's mogelijk, terwijl het toegankelijk blijft voor onderzoekers zonder uitgebreide bio-informaticatraining.

Een computationele pijplijn voor intergene/intragene enhancer RNA-kwantificering in embryonale stamcellen van muizen

Dit rapport beschrijft een werkwijze biotechnologie ontwerpen en bouwen van nieuwe kunstmatige splicingfactoren (ASFS) die specifiek de splitsing van doelgenen te moduleren in zoogdiercellen. Deze werkwijze kan verder worden uitgebreid met verschillende kunstmatige engineering factoren andere aspecten RNA metabolisme manipuleren.

Engineering Kunstmatige Factoren om specifiek manipuleren alternatieve splitsing in menselijke cellen

Leer kwantitatieve analyse van alternatieve pre-mRNA-splicing in muizenhersenen met RNA in situ hybridisatie. Deze methode detecteert isoform-specifieke signalen en berekent splicing-percentages in verschillende anatomische gebieden.

Kwantitatieve analyse van alternatieve Pre-mRNA-Splicing in muis hersenen secties met behulp van RNA In Situ hybridisatie Assay

Meer video's verkennen