Kwantitatieve analyse van alternatieve Pre-mRNA-Splicing in muis hersenen secties met behulp van RNA In Situ hybridisatie Assay
26 augustus 2018
Een in situ hybridisatie (ISH) protocol dat gebruikmaakt van korte antisense oligonucleotides voor alternatieve pre-mRNA-splicing patronen kunt ontdekken in muis hersenen secties wordt beschreven.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van alternatieve pre-mRNA-splicing. Specifiek biedt het een robuust, gevoelig assaysysteem om alternatieve splicingpatronen in situ in weefselsneden te onderzoeken. Met deze methode kan alternatieve splicing gelijktijdig worden geanalyseerd in veel subtypen die zijn opgenomen in complexe biologische structuren, zoals een muizenhersenen.
Het grootste voordeel van deze techniek is dat het shock-antistatische exon-junctieprobes in mRNA in situ-hybridisatie gebruikt om isoform-specifieke hybridisatiesignalen te produceren. De technologie voor signaalversterking verhoogt de gevoeligheid van de detectie om robuuste hybridisatiesignalen te bieden. De signalen die werden gedetecteerd, waren specifieke exon-inclusie-ontsnappingsprobes die werden gebruikt om het percentage splicing in vitale gebieden te berekenen in verschillende anatomische delen van een muizenhersenen.
In deze studie wordt NF1-exon 23a gebruikt als voorbeeld om het gebruik van het assaysysteem te illustreren. De systeem kan echter worden aangepast voor het analyseren van expressiepatronen van veel alternatieve exons. Om de muizenhersened in paraffine te zetten, vult u twee wasbakken met 250 milliliter xyleen.
En nog twee met 250 milliliter 100% ethanol in een afzuigkap. Plaats de weefselsneden in een wasrek. Plaats vervolgens het wasrek in een xyleenhoudende schaal en incubeer gedurende vijf minuten terwijl u het rek minimaal drie keer op en neer beweegt en herhaalt met de tweede xyleenschaal.
Plaats vervolgens het rek in een ethanolhoudende schaal en incubeer gedurende twee minuten met dezelfde op- en neerwaartse bewegingen en herhaalt met de tweede ethanolschaal. Om de sneden te drogen, verplaatst u het rek van de tweede ethanolschaal en plaatst u het in een incubator bij 60 graden Celsius gedurende vijf minuten. Gebruik een hydrofobe barrièrepen om een barrière van 0,75 inch bij 0,75 inch rond de weefselsectie te tekenen en laat hem drie minuten bij kamertemperatuur drogen.
Zet de hybridisatieoven aan en stel de temperatuur in op 40 graden Celsius. Nadat u het bevochtigingspapier volledig heeft bevochtigd met gedestilleerd water, plaatst u het in een bevochtigingscontrolebakken. Plaats vervolgens de bevochtigingscontrolebakken in de hybridisatieoven.
Nadat u de gedroogd sneden op een werkblad heeft geplaatst, bedekt u de weefselsecties op elke snede volledig met vijf tot acht druppels waterstofperoxideoplossing. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Tik de sneden op een absorberend papier, één voor één, om de waterstofperoxideoplossing te verwijderen en plaats de sneden in een wasrek.
Dompel het rek in een wasbak met water terwijl u het drie tot vijf keer op en neer beweegt om de sneden te wassen. Vul een glazen beker van één liter op een hotplate geplaatst met 700 milliliter 1X doelverwijderingsbehandeling en bedek deze met folie. Steek een thermometer door de foliedekking en zet de hotplate aan, ingesteld op hoge temperatuur gedurende 10 tot 15 minuten.
Zodra de temperatuur van het ophaalmiddel 98 graden Celsius bereikt, stelt u de hotplate in op lage temperatuur om een lichte kookconditie te behouden. Verwijder vervolgens voorzichtig de folie en plaats het rek in de beker. Bedek de beker met folie en incubeer gedurende 15 minuten.
Gebruik een pincet om het rek over te brengen van de beker naar een wasbak met 200 milliliter gedistilleerd water en incubeer gedurende 15 seconden. Plaats na 15 seconden het rek in een wasbak met 100% ethanol en incubeer gedurende drie minuten. Verwijder het rek uit de bak en droog het gedurende 10 minuten bij 60 graden Celsius.
Nadat u de sneden op een kleurraak hebt geplaatst, bedekt u de weefselsecties met vijf druppels protease 3 per snede. Plaats de rek voorzichtig in de bevochtigingscontrolebakken en plaats de bak in de hybridisatieoven en incubeer gedurende 30 minuten bij 40 graden Celsius. Nadat u de rek uit de bak hebt verwijderd, tikt u op de sneden om overtollig vocht te verwijderen en plaatst u ze in een wasrek.
Plaats de rek in een wasbak met gedistilleerd water en beweeg de rek op en neer drie tot vijf keer om de sneden te wassen. Om voor in situ-hybridisatie voor te bereiden, incubeert u de probes en AMP-reagentia bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Plaats de bevochtigingscontrolebakken in de hybridisatieoven en stel deze in op 40 graden Celsius.
Voor probe-hybridisatie, verwijdert u de sneden uit het wasrek en tikt u op ze om overtollig vocht te verwijderen. Plaats de sneden op een kleurraak. Gebruik een potlood om de sneden te labelen met de naam van de probe.
Plaats drie aangrenzend gesneden hersenweefselsneden om te worden gehybridiseerd met drie verschillende neurale vezel mitose type een probes samen. Omdat er zeer verschillende isoform-specifieke probes zijn, gebruik ik aangrenzend gesneden weefselsecties. Het is van cruciaal belang dat deze secties exact hetzelfde worden behandeld in hybridisatie, amplificatie en signaalverwerking om de nauwkeurigheid van de berekening van het percentage splicing te waarborgen.
Bedek de weefselsecties met vier druppels probe per sectie, één snede per keer om uitdroging van de secties te voorkomen. Plaats vervolgens de kleurraak in de bevochtigingscontrolebakken en plaats deze gedurende twee uur in de 40 graden Celsius oven. Plaats vervolgens een wasrek in een wasbak gevuld met 200 milliliter 1X wasbuffer.
Tik vervolgens op elke snede, één voor één op een papieren handdoek om overtollig vocht te verwijderen. Plaats vervolgens elke snede onmiddellijk in het wasrek. Incubeer gedurende twee minuten bij kamertemperatuur in een bak gevuld met verse wasbuffer terwijl u de rek op en neer beweegt drie tot vijf keer en herhaalt de was in een nieuwe bak.
Voor sign
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een in situ hybridisatie- (ISH) protocol waarbij korte antisense-oligonucleotiden worden gebruikt om alternatieve pre-mRNA-splicingpatronen in hersensecties van muizen te detecteren. Deze methode maakt een simultane analyse mogelijk van splicingpatronen in verschillende subtypen binnen complexe biologische structuren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Genetica
- Moleculaire biologie
Achtergrond
- Alternatieve splicing van pre-mRNA is essentieel voor het genereren van eiwitdiversiteit.
- Kennis van splicingpatronen kan inzicht bieden in hersenfuncties en -stoornissen.
- In situ hybridisatietechnieken zijn onontbeerlijk voor het bestuderen van splicing in weefselcontexten.
- Deze studie richt zich op secties van het muizenbrein om splicingvariaties te onderzoeken.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een gevoelige assay voor het detecteren van alternatieve splicing in situ.
- Het analyseren van splicingpatronen in verschillende hersengebieden.
- Het verdiepen van het begrip van splicingmechanismen in de hersenen.
Gebruikte methoden
- In situ hybridisatie met behulp van korte antisense-oligonucleotiden.
- Anti-statische exon-junction-probes voor isoform-specifieke signalen.
- Signaalversterkingstechnologie om de detectiegevoeligheid te verhogen.
- Analyse van exon-inclusie en splicing-percentages in diverse anatomische gebieden.
Belangrijkste resultaten
- Met de ontwikkelde methode werden robuuste hybridisatiesignalen behaald.
- Alternatieve splicingpatronen werden succesvol gedetecteerd in hersensecties van muizen.
- De techniek maakt gelijktijdige analyse van meerdere splicinggebeurtenissen mogelijk.
- De resultaten dragen bij aan het begrip van de complexiteit van splicing in neurale weefsels.
Conclusies
- Het ISH-protocol biedt een waardevolle tool voor het bestuderen van alternatieve splicing.
- De bevindingen vergroten de kennis over splicing-mechanismen in de hersenen.
- Deze methode kan verder onderzoek naar splicing-gerelateerde neurologische aandoeningen faciliteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Deze methode maakt ruimtelijk opgeloste kwantificering van alternatieve splicing-gebeurtenissen in complexe weefsels mogelijk, waardoor een kritische leemte in targetvalidatie wordt opgevuld waarbij bulk RNA-benaderingen de cellulaire heterogeniteit maskeren. Door isoform-specifieke signalen op single-cell resolutie te leveren in anatomisch gedefinieerde hersenregio's, ondersteunt het de mechanistische risicoreductie van splicing-afhankelijke targets in de drug discovery voor neurowetenschappen. De mogelijkheid om percent spliced in (PSI)-waarden te berekenen op basis van exon-inclusie- en skipping-signalen biedt een kwantitatieve, reproduceerbare metriek voor het beoordelen van target-engagement en padmodulatie in preklinische modellen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken door specifieke splice-isoformen te koppelen aan celtype-specifieke expressiepatronen in ziekterelevante hersenregio's.
- Operationele waarde: Biedt een robuust en gevoelig assaysysteem voor het bestuderen van alternatieve splicingpatronen in situ binnen weefselcoupes, waardoor de afhankelijkheid van gedissocieerde celmodellen die de ruimtelijke context verliezen, wordt verminderd.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Maakt gebruik van schok-antistatische exon-junction-probes om isoform-specifieke hybridisatiesignalen te genereren, waardoor gelijktijdige analyse van meerdere subtypes binnen complexe biologische structuren mogelijk wordt.
- Operationele waarde: Signaalversterkingstechnologie verhoogt de detectiesensitiviteit, wat resulteert in robuuste signalen die geschikt zijn voor kwantitatieve beeldvorming en geautomatiseerde analyse-workflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert ziekterelatere systeemanalyses door splicingpatronen in kaart te brengen over anatomische gebieden zoals de cortex en hippocampus, wat de ontdekking van biomarkers voor neuropsychiatrische indicaties ondersteunt.
- Operationele waarde: Maakt parallelle verwerking van aangrenzende weefseldoorsneden onder identieke omstandigheden mogelijk, waardoor de nauwkeurigheid van de gegevens voor dwarsdoorsnedevergelijkingen in preklinische studies wordt gewaarborgd.
Integratie van pipeline en workflow
De methode past binnen de fase van discovery biology, waarbij ruimtelijk opgeloste splicing-gegevens bijdragen aan de selectie van targets en het mechanistische begrip voorafgaand aan de ontwikkeling van assays voor high-throughput screening.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door celtype-specifieke patronen van alternatieve splicing te onthullen die in bulkweefselanalyses mogelijk verborgen blijven.
- Screening: Genereert kwantitatieve, ruimtelijk opgeloste read-outs (bijv. PSI-waarden) die kunnen dienen als basis voor het ontwerp van assays voor splicing-modulerende verbindingen.
- Analytica: Maakt de berekening van het percentage spliced in mogelijk op basis van signaalcounts van exon-inclusie en -skipping, wat een genormaliseerde metriek biedt voor het vergelijken van condities over verschillende hersenregio's.
- Translationeel onderzoek: Verbindt ontdekkingsbevindingen met preklinische continuïteit door splicing-veranderingen te valideren in anatomisch gedefinieerde regio's die relevant zijn voor ziektemodellen.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: De probe-gebaseerde aanpak is aanpasbaar voor meerdere alternatieve exonen, waardoor het een herbruikbaar platform vormt voor splicing-analyse over diverse targets en ziektegebieden.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door specifieke splice-isoformen te koppelen aan gedefinieerde anatomische locaties, waardoor het vertrouwen in target-ziekte-relaties toeneemt.
- Operationele waarde: Een gestandaardiseerd protocol met ingebouwde controles (bijv. opeenvolgend gesneden coupes, identieke verwerking) verbetert de reproduceerbaarheid tussen verschillende locaties en gebruikers.
- Strategische waarde: Ondersteunt betere go/no-go-beslissingen door in een vroeg stadium van de discovery-pipeline ruimtelijk opgeloste gegevens over werkzaamheid en mechanisme te verschaffen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van gevalideerde splicing-expressie in ziekte-relevante neurale circuits.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in RNA in situ hybridisatie, weefselcoupes en kwantitatieve beeldanalyse voor het tellen van punctate dots.
- Afhankelijk van hybridisatieovens, trays voor vochtigheidsregeling en reagentia-systemen voor probe-hybridisatie, signaalversterking en detectie (bijv. Fast Red).
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de preparatie van coupes, probe-incubatie en wasstappen om de vergelijkbaarheid van PSI-berekeningen te waarborgen.
- Aanpassing aan nieuwe exonen vereist het ontwerp en de validatie van probes die specifiek zijn voor exon-junctions, waarbij rekening moet worden gehouden met de toegankelijkheid van de doelsequentie.
- Praktische beperking: Multi-color labeling is momenteel niet beschikbaar, waardoor sequentiële analyse op afzonderlijke coupes nodig is, wat de eisen aan weefselcoupes en verwerking verhoogt.
