Kwantitatieve analyse van alternatieve Pre-mRNA-Splicing in muis hersenen secties met behulp van RNA In Situ hybridisatie Assay
August 26th, 2018
Een in situ hybridisatie (ISH) protocol dat gebruikmaakt van korte antisense oligonucleotides voor alternatieve pre-mRNA-splicing patronen kunt ontdekken in muis hersenen secties wordt beschreven.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van alternatieve pre-mRNA-splicing. Specifiek biedt het een robuust, gevoelig assaysysteem om alternatieve splicingpatronen in situ in weefselsneden te onderzoeken. Met deze methode kan alternatieve splicing gelijktijdig worden geanalyseerd in veel subtypen die zijn opgenomen in complexe biologische structuren, zoals een muizenhersenen.
Het grootste voordeel van deze techniek is dat het shock-antistatische exon-junctieprobes in mRNA in situ-hybridisatie gebruikt om isoform-specifieke hybridisatiesignalen te produceren. De technologie voor signaalversterking verhoogt de gevoeligheid van de detectie om robuuste hybridisatiesignalen te bieden. De signalen die werden gedetecteerd, waren specifieke exon-inclusie-ontsnappingsprobes die werden gebruikt om het percentage splicing in vitale gebieden te berekenen in verschillende anatomische delen van een muizenhersenen.
In deze studie wordt NF1-exon 23a gebruikt als voorbeeld om het gebruik van het assaysysteem te illustreren. De systeem kan echter worden aangepast voor het analyseren van expressiepatronen van veel alternatieve exons. Om de muizenhersened in paraffine te zetten, vult u twee wasbakken met 250 milliliter xyleen.
En nog twee met 250 milliliter 100% ethanol in een afzuigkap. Plaats de weefselsneden in een wasrek. Plaats vervolgens het wasrek in een xyleenhoudende schaal en incubeer gedurende vijf minuten terwijl u het rek minimaal drie keer op en neer beweegt en herhaalt met de tweede xyleenschaal.
Plaats vervolgens het rek in een ethanolhoudende schaal en incubeer gedurende twee minuten met dezelfde op- en neerwaartse bewegingen en herhaalt met de tweede ethanolschaal. Om de sneden te drogen, verplaatst u het rek van de tweede ethanolschaal en plaatst u het in een incubator bij 60 graden Celsius gedurende vijf minuten. Gebruik een hydrofobe barrièrepen om een barrière van 0,75 inch bij 0,75 inch rond de weefselsectie te tekenen en laat hem drie minuten bij kamertemperatuur drogen.
Zet de hybridisatieoven aan en stel de temperatuur in op 40 graden Celsius. Nadat u het bevochtigingspapier volledig heeft bevochtigd met gedestilleerd water, plaatst u het in een bevochtigingscontrolebakken. Plaats vervolgens de bevochtigingscontrolebakken in de hybridisatieoven.
Nadat u de gedroogd sneden op een werkblad heeft geplaatst, bedekt u de weefselsecties op elke snede volledig met vijf tot acht druppels waterstofperoxideoplossing. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Tik de sneden op een absorberend papier, één voor één, om de waterstofperoxideoplossing te verwijderen en plaats de sneden in een wasrek.
Dompel het rek in een wasbak met water terwijl u het drie tot vijf keer op en neer beweegt om de sneden te wassen. Vul een glazen beker van één liter op een hotplate geplaatst met 700 milliliter 1X doelverwijderingsbehandeling en bedek deze met folie. Steek een thermometer door de foliedekking en zet de hotplate aan, ingesteld op hoge temperatuur gedurende 10 tot 15 minuten.
Zodra de temperatuur van het ophaalmiddel 98 graden Celsius bereikt, stelt u de hotplate in op lage temperatuur om een lichte kookconditie te behouden. Verwijder vervolgens voorzichtig de folie en plaats het rek in de beker. Bedek de beker met folie en incubeer gedurende 15 minuten.
Gebruik een pincet om het rek over te brengen van de beker naar een wasbak met 200 milliliter gedistilleerd water en incubeer gedurende 15 seconden. Plaats na 15 seconden het rek in een wasbak met 100% ethanol en incubeer gedurende drie minuten. Verwijder het rek uit de bak en droog het gedurende 10 minuten bij 60 graden Celsius.
Nadat u de sneden op een kleurraak hebt geplaatst, bedekt u de weefselsecties met vijf druppels protease 3 per snede. Plaats de rek voorzichtig in de bevochtigingscontrolebakken en plaats de bak in de hybridisatieoven en incubeer gedurende 30 minuten bij 40 graden Celsius. Nadat u de rek uit de bak hebt verwijderd, tikt u op de sneden om overtollig vocht te verwijderen en plaatst u ze in een wasrek.
Plaats de rek in een wasbak met gedistilleerd water en beweeg de rek op en neer drie tot vijf keer om de sneden te wassen. Om voor in situ-hybridisatie voor te bereiden, incubeert u de probes en AMP-reagentia bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Plaats de bevochtigingscontrolebakken in de hybridisatieoven en stel deze in op 40 graden Celsius.
Voor probe-hybridisatie, verwijdert u de sneden uit het wasrek en tikt u op ze om overtollig vocht te verwijderen. Plaats de sneden op een kleurraak. Gebruik een potlood om de sneden te labelen met de naam van de probe.
Plaats drie aangrenzend gesneden hersenweefselsneden om te worden gehybridiseerd met drie verschillende neurale vezel mitose type een probes samen. Omdat er zeer verschillende isoform-specifieke probes zijn, gebruik ik aangrenzend gesneden weefselsecties. Het is van cruciaal belang dat deze secties exact hetzelfde worden behandeld in hybridisatie, amplificatie en signaalverwerking om de nauwkeurigheid van de berekening van het percentage splicing te waarborgen.
Bedek de weefselsecties met vier druppels probe per sectie, één snede per keer om uitdroging van de secties te voorkomen. Plaats vervolgens de kleurraak in de bevochtigingscontrolebakken en plaats deze gedurende twee uur in de 40 graden Celsius oven. Plaats vervolgens een wasrek in een wasbak gevuld met 200 milliliter 1X wasbuffer.
Tik vervolgens op elke snede, één voor één op een papieren handdoek om overtollig vocht te verwijderen. Plaats vervolgens elke snede onmiddellijk in het wasrek. Incubeer gedurende twee minuten bij kamertemperatuur in een bak gevuld met verse wasbuffer terwijl u de rek op en neer beweegt drie tot vijf keer en herhaalt de was in een nieuwe bak.
Voor sign
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een in situ hybridisatie (ISH) protocol dat gebruik maakt van korte antisense-oligonucleotiden om alternatieve pre-mRNA-splijspatronen in muisbreinsecties te detecteren. Deze methode maakt de gelijktijdige analyse van splijspatronen mogelijk in verschillende subtypen binnen complexe biologische structuren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Genetica
- Moleculairbiologie
Achtergrond
- Alternatieve pre-mRNA-splijsing is cruciaal voor het genereren van eiwitdiversiteit.
- Inzicht in splijspatronen kan inzicht geven in hersenfunctie en -stoornissen.
- In situ hybridisatietechnieken zijn essentieel voor het bestuderen van splijsen in weefselcontexten.
- Deze studie richt zich op muisbreinsecties om splijsvarianten te onderzoeken.
Doel van het onderzoek
- Om een gevoelige test te ontwikkelen voor het detecteren van alternatief splijzen in situ.
- Om splijspatronen te analyseren in verschillende hersengebieden.
- Om de kennis van splijsmechanismen in de hersenen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- In situ hybridisatie met behulp van korte antisense-oligonucleotiden.
- Shock anti-statische exon-junctie-probes voor isovorm-specifieke signalen.
- Signaalversterkingstechnologie om de detectiegevoeligheid te verhogen.
- Analyse van exon-inclusie en splijspercentages in verschillende anatomische gebieden.
Belangrijkste resultaten
- Robuuste hybridisatiesignalen werden bereikt met behulp van de ontwikkelde methode.
- Alternatieve splijspatronen werden met succes gedetecteerd in muisbreinsecties.
- De techniek maakt gelijktijdige analyse van meerdere splijsgebeurtenissen mogelijk.
- Resultaten dragen bij aan het begrip van de complexiteit van splijsen in neurale weefsels.
Conclusies
- Het ISH-protocol biedt een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van alternatief splijzen.
- Bevindingen verbeteren de kennis van splijsmechanismen in de hersenen.
- Deze methode kan verder onderzoek naar splijsgerelateerde neurologische aandoeningen faciliteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables spatially resolved quantification of alternative splicing events in complex tissues, addressing a critical gap in target validation where bulk RNA approaches mask cellular heterogeneity. By providing isoform-specific signals at single-cell resolution in anatomically defined brain regions, it supports mechanistic de-risking of splicing-dependent targets in neuroscience drug discovery. The ability to calculate percent spliced in (PSI) values from exon inclusion and skipping signals offers a quantitative, reproducible metric for assessing target engagement and pathway modulation in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking specific splice isoforms to cell-type-specific expression patterns in disease-relevant brain regions.
- Operational Value: Provides a robust, sensitive assay system for examining alternative splicing patterns in situ within tissue slices, reducing reliance on dissociated cell models that lose spatial context.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Uses shock anti-static exon junction probes to generate isoform-specific hybridization signals, enabling simultaneous analysis of multiple subtypes within complex biological structures.
- Operational Value: Signal amplification technology increases detection sensitivity, producing robust signals suitable for quantitative imaging and automated analysis workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system analysis by mapping splicing patterns across anatomical areas such as cortex and hippocampus, supporting biomarker discovery for neuropsychiatric indications.
- Operational Value: Enables parallel processing of adjacently cut tissue sections under identical conditions, ensuring data accuracy for cross-sectional comparisons in preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, where spatially resolved splicing data informs target selection and mechanistic understanding before assay development for high-throughput screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing cell-type-specific alternative splicing patterns that may be obscured in bulk tissue analyses.
- Screening: Generates quantitative, spatially resolved readouts (e.g., PSI values) that can inform assay design for splicing-modulating compounds.
- Analytics: Enables calculation of percent spliced in from exon inclusion and skipping signal counts, providing a normalized metric for comparing conditions across brain regions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by validating splicing changes in anatomically defined regions relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: The probe-based approach is adaptable to multiple alternative exons, positioning it as a reusable platform for splicing analysis across diverse targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking specific splice isoforms to defined anatomical locations, increasing confidence in target-disease relationships.
- Operational Value: Standardized protocol with built-in controls (e.g., adjacently cut slides, identical processing) enhances reproducibility across sites and users.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by providing spatially resolved efficacy and mechanism data early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated splicing expression in disease-relevant neural circuits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA in situ hybridization, tissue sectioning, and quantitative image analysis for punctate dot counting.
- Dependent on hybridization ovens, humidity control trays, and reagent systems for probe hybridization, signal amplification, and detection (e.g., Fast Red).
- Necessitates standardization across teams for slide preparation, probe incubation, and washing steps to ensure comparability of PSI calculations.
- Adaptation to new exons requires design and validation of exon junction-specific probes, with sensitivity to target sequence accessibility.
- Practical limitation: Multi-color labeling is not currently available, requiring sequential analysis on separate slides, which increases tissue sectioning and processing demands.
