Name: Een Microphysiologic Platform voor menselijk vet: ingeklemd wit vetweefsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Leer een microfysiologisch platform voor wit vetweefselcultuur met behulp van ingeklemd wit vetweefsel. Deze methode houdt weefsel acht weken levensvatbaar voor metabool onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs wil erkennen de institutionele steun van LSU Health Sciences Center, dat het project gefinancierd.

Alle taken werden uitgevoerd in naleving protocollen #8759 en #9189, zoals goedgekeurd door de IRB Office van LSUHSC-NO. Alle dierlijke werk werd uitgevoerd in naleving van protocol #3285 goedgekeurd door het Bureau van de IACUC op LSUHSC-nr.
1. zaaien van sodat cel bladen
Opmerking: Zie Figuur 1.
<ol><li>Zaad ADSCs op ongeveer 80% confluentie in weefselkweek platen (6 cm of 6-Wells-platen). Voor elk putje van SWAT gewenst, seed 1 conventionele weefselkweek goed en 1 putje van de grootte van de bijbehorende op poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm) beklede weefselkweek kunststof plaat. Opmerking: Dienovereenkomstig, een 6-well-plate voor SWAT vergt seeding cellen op één standaard 6-well weefselkweek plaat (basislaag) en één weefselkweek 6-well pNIPAAm beklede plaat (bovenste laag). pNIPAAm-gecoate platen commercieel kunnen worden gekocht of geproduceerd in-lab12,13,14.</li>
	<li>Handhaven van ADSCs bij 37 ° C en 5% CO2 in de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% FBS en 1 x penicilline/streptomycine. Media elke 2 dagen wijzigen.</li>
	<li>Cellen naar samensmelten tot ze 100% heuvels worden en op een gestreept patroon (ongeveer 6-8 dagen nemen) toestaan. Opmerking: Deze cellen zal moeten functioneren als een intact eencellige vel om te stabiliseren van de uitbundige adipeus weefsel. Onvoldoende confluente cellen zal fragment bij zaaien met WAT.</li>
</ol>2. voorbereiding voor SWAT levert
<ol><li>Bereiden van verschillende 10 mL aliquots van 1 x Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS); genoeg voor het gewenste aantal platen met volume te sparen voor te bereiden.</li>
	<li>
Voorbereiden op het apparaat van de plunjer SWAT zaaien. Construeer de plunjer gebruik van eenvoudige acryl plastic, bestaat uit een stam die is gekoppeld aan een ronde schijf. Zorgen dat het past binnen de omtrek van de weefselkweek putten (diameter: < 6 cm voor 6 cm schotel, < 3.5 cm voor 6-well plaat; geschatte massa: 6,7 g voor een 6 cm schotel, 5.1 g voor een 6-well-plate).
	<ol>
<li>Extra plunjers om ervoor te zorgen dat de procedure zal verlopen in geval zich een probleem voordoet met elke individuele plunjer voor te bereiden.</li>
		<li>Wikkel lab tape rond de rand van de schijf van de plunjer, minstens 2 x, om te voorkomen lekkage van gelatine oplossing.</li>
		<li>Spray een bioveiligheid kabinet (BSC) met 70% EtOH. Spray beneden een rack conische buis 15 mL binnen het BSC met lege, afgetopte 15 mL conische buizen; buizen zal de plaatsing van de gelatine plunjers beveiligen.</li>
		<li>Spray elke tape gewikkeld plunjer grondig met 70% EtOH en plaats in een conische tube van 15mL op het rek. Spuiten metalen sluitringen (geschatte massa 6.3 g) en leg ze op het rek samen met een paar van verslaafd verlostang; de sluitringen zal toevoegen gewicht aan de plunjers tijdens SWAT zaaien.</li>
		<li>Sluit de BSC raamvleugel en zet het UV licht te vergemakkelijken drogen en sterilisatie. Opmerking: in het ideale geval voeren deze stap 24 h vóór SWAT zaaien. U kunt ook het proces te voeren op de dag van het weefsel collectie/SWAT zaaien; evenwel toestaan in dit geval 15-45 min voor UV drogen/sterilisatie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. voorbereiding van de gelatine plunjers — toepassing naar bovenste cel bladen
<ol><li>Verwarm een waterbad tot 75 ° C.</li>
	<li>
Bereid de gelatine-oplossing door het toevoegen van 0,75 gram gelatine poeder 10 mL-voorraad 1 x HBSS. Voeg 100 µL van 1 M NaOH aan het balanceren van de pH van de oplossing onder een zuurkast.
	<ol>
<li>De 10 mL-bestanden toevoegen aan het waterbad en schud krachtig om 5 min tot het poeder in oplossing oplost. Doel te ontbinden de poedervorm gelatine kort na toe te voegen aan het verwarmd waterbad.</li>
		<li>De BSC blazer inschakelen, uitschakelen van het UV-licht en verhogen van de vleugel. Spray de BSC oppervlak en bereiden het filter leveringen (5 mL luer-lock spuiten en 0,2 µm spuit filters). Meerdere filters om efficiënt stam voldoende hoeveelheden gelatine toe te passen op plunjers voor te bereiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wanneer de gelatine oplossing een homogene consistentie bereikt, filtreer de oplossing en het toepassen van de plunjers. Laden van de spuit met gelatine. De gelatine van toepassing op de plastic plunjers door het filter van de spuit (~2.5 mL voor een 6-well-plate, ~4.5 mL voor een schotel 6 cm) en laten stollen (~ 20 min).</li>
	<li>Zodra de gelatine solide is, uitpakken de tape van de rand van de plunjers. Met een verslaafd Tang, de gelatine te verwijderen van de buitenste rand van de zuiger (dat wil zeggen, de verhoogde randen van de meniscus). Zorg ervoor dat de resterende gelatine in het midden van de plunjer volledig niveau te maximaliseren contact met ADSC blad.</li>
	<li>Zodra overtollige gelatine is verwijderd, voorzichtig toepassing de plunjers van de gelatine aan de ADSC pNIPAAm beklede platen. Gebruik de metalen ringen om de plunjer terneerdrukken. Niet schuintrekken cel bladen tijdens het toepassen van de plunjers.</li>
	<li>
Laat de plunjers op de cel bladen gedurende 1,5 uur op kamertemperatuur. Incubeer de platen/plunjers in een bad met ijs water gedurende 1,5 uur te voltooien dissociatie van de cellaag van het oppervlak pNIPAAm beklede plaat.
	<ol>
<li>Wees voorzichtig tijdens het broeden in het ijsbad; het ijsbad te besmetten de mobiele media tijdens de incubatie niet toegestaan.</li>
		<li>Na incubatie, reinig de onderkant van de pNIPAAm-gecoate platen om niet-steriel water te verwijderen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. witte vetweefsel Processing
<ol><li>Bij het verzamelen van menselijke adipeus weefsel van de operatiekamer, houden alle monsters in een steriele container dat is op ijs totdat SWAT is om te worden ontpit. Steriele onderhoud media, zoals-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), toevoegen aan vetweefsel container voor weefsel stabiliteit.</li>
	<li>Voeg koude cel kweekmedium 1,5 mL microcentrifuge buizen voor elk goed/gerecht te worden ontpit (100 µL van een 6-well-plaat, 200 µL voor een 6 cm schotel).</li>
	<li>
Het blad van het vetweefsel.
	<ol>
<li>Voor solide adipeus weefsel segmenten, gaat u als volgt.<ol>
<li>Wassen grote segmenten van vetweefsel 3 x in steriele PBS en verwijder zoveel PBS mogelijk.</li>
			<li>Grof gehakt weefsel met pincet en steriele scheermes en Verwijder zo veel therapieën en fascia mogelijk (zie bespreking voor meer detail).</li>
			<li>Fijn gehakt vet met scheermes totdat gehakt weefsel overneemt van dik, vloeibare consistentie. Opmerking: Een ideale weefsel verschijnt homogene met geen zichtbare afzonderlijke segmenten van WAT hoewel dit niet altijd mogelijk is.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Lipoaspirate als volgt verwerken.<ol>
<li>Onder de BSC, tape steriel gaas over de bovenkant van een bekerglas en plaats deze bekerglas in een grotere bekerglas te verzamelen alle overtollige vocht.</li>
			<li>Met behulp van serologische Pipetteer 25 mL, trekken zoveel lipoaspirate als nodig en toe te passen op het oppervlak van de steriel gaas. PBS rechtstreeks toepassen op dit oppervlak te wassen lipoaspirated vet en overtollige bloed en lipide residu te verwijderen.</li>
			<li>Gebruik pincet gedraineerde weefsel herstellen, over te brengen naar een steriele hakken oppervlak en gehakt van de lipoaspirate.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gebruik een steriele scheermes afgesneden van het distale einde van p1000 Pipetteer tips voor het overbrengen van gehakt weefsel; Dit zal het minimaliseren van shear stress die tot lysis van de adipocyte leiden kunnen. Het gewenste volume van gehakt weefsel overbrengen elke 1,5 mL-buis (300 – 400 µL voor 6-well plaat, 500-600 µL voor 6 cm schotel) zodra een goede weefsel consistentie is bereikt. Meng gehakt WAT en media kort in de buizen.</li>
	<li>
Neem de ADSC grondplaten en decanteren/aspirate de media. De media wordt vervangen door het mengsel WAT/media uit elke 1,5 mL-buis.
	<ol>
<li>Zachtjes de gelatine plunjers verwijderen uit de pNIPAAm-gecoate platen en deze toepassen op het mengsel WAT op de ADSC grondplaten. Onderzoeken de enkelgelaagde van de pNIPAAm-gecoate platen onder een microscoop te bevestigen van cellulaire detachement.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stel een warmte-blok op ongeveer 37-40 ° C onder de BSC. Met de plunjers nog op zijn plaats, de platen naar de warmte blok's oppervlak te verplaatsen. Voeg 2-3 mL verwarmde voedingsbodems Incubeer de cellen te vergemakkelijken gelatine smelten.</li>
	<li>Na ~ 30 min, zachtjes de plunjers van het oppervlak van de plaat te verwijderen. Vervang de deksels van de base weefselkweek platen en verplaatsen naar een cel cultuur incubator. Zodra de gelatine heeft volledig vloeibaar bij 37 ° C, gecombineerd en cel voedingsbodems vervangen.</li>
	<li>Handhaven van SWAT op 37 ° C en 5% CO2 in fenol rood-vrije M199 medium met 7 µM insuline, 30 µM dexamethason, 1 x penicilline/streptomycine. In ongeveer 2 mL media voor 6-Wells-platen en 3 mL voor 6 cm gerechten handhaven. Media elke 2 dagen wijzigen.</li>
</ol>5. SWAT oogst
<ol><li>Bereiden van collagenase (0,5 mg/mL collagenase, 500 nM adenosine, in PBS) aliquots in 15 mL conische buisjes (benaderend volume van 10 mL). Bevriezen van de buizen en bewaar ze bij-20 ° C.</li>
	<li>Iedere voedingsbodem uit cellen gecombineerd, 1 x met PBS wassen en vervolgens gecombineerd PBS. Prep het collagenase aliquots door hen in een waterbad 37 ° C te ontdooien. Opmerking: in het ideale geval de collagenase oplossing zal bereiken 37 ° C; onmiddellijk daarna, voeg weefsel.</li>
	<li>
Alle weefsel van de SWAT-plaat aan de individuele aliquots toevoegen. SWAT met behulp van een steriele cel scrapper oogst en overbrengen naar de collagenase aliquots met een licht-donkerscheiding p1000 pipette uiteinde. Weefsel rechtstreeks toevoegen aan de 15 mL conische buisjes met collagenase oplossing.
	<ol>
<li>Als alternatief, Incubeer het weefsel/collagenase mengsel in een conische tube van 50 mL; de grotere oppervlakte zal verder enzymatische spijsvertering te vergemakkelijken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schakel Monster buizen in een bebroede roteerschudapparaat onder een hoek van 45°. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30-60 min-200 rpm.</li>
	<li>Plaats een 250 µm fijnmazige filter in een nieuwe conische tube van 15 mL voor collectie. Giet de oplossing verteerd adipocyte door het filter. Opmerking: Dit zal alle cellen te passeren, terwijl filteren op vezelig weefsel toestaan.</li>
	<li>Toestaan doorstroomtest om te zitten voor 5 minuten bij kamertemperatuur te voorzien van fase-separatie zichtbaar. Opmerking: De adipocytes wordt een zwevende werkbalk naar de bovenkant van de oplossing terwijl de obesitas stromale cellen (ASC's) in de lagere fasen zal regelen. Centrifugeren voor 5 min op 500 x g kan ook maximaliseren cel scheiding of omringende ADSCs in de pellet van de oogst.</li>
	<li>
Met behulp van een licht-donkerscheiding p1000 pipette uiteinde, overbrengen in de adipocytes (de drijvende laag boven aan collagenase oplossing) een tube van 1,5 mL microcentrifuge collectie. ~ 250 µL nemen op een moment, Pipetteer langzaam langs de rand van de buis te verzamelen van de adipocytes.
	<ol>
<li>De buis langzaam draaien terwijl het verzamelen van de adipocytes om te maximaliseren van het herstel van cellen vast te houden aan de binnenkant. Houd meer cellen tekenen totdat de 1,5 mL microcentrifuge buis vol is.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwijder overtollige vocht uit de geïsoleerde adipocytes met behulp van een injectiespuit gekoppeld aan een naald (~ 21 G). Het onderdompelen van de naald onder de drijvende laag van de adipocyte. De naald kort als u wilt verjagen cellen vast te houden aan de schacht van de naald doorroeren en dan wachten op de dislodged adipocytes te zweven naar de top.</li>
	<li>Langzaam trekken de overtollige vloeistof, voorzichtig om te voorkomen dat onbedoelde verwijdering van adipocytes. Gebruik microcentrifuge buis afstudeerders consequent isoleren monster volumes (bijv. 0,1 mL voor elk monster).</li>
	<li>De geïsoleerde cellen gebruiken voor de DNA/RNA extractie, glucose opname assay, lipolyse assay, enz.
</li>
</ol>

<ol><li>Cawley, J., Meyerhoefer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+medical+costs+of+obesity%3A+An+instrumental+variables+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Health+Economics%22%5BJournal%5D)">The medical costs of obesity: An instrumental variables approach.</a> Journal of Health Economics. 31 (1), 219-230 (2012).</li>
<li>Pi-Sunyer, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Medical+Risks+of+Obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Postgraduate+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Medical Risks of Obesity.</a> Postgraduate Medicine. 121 (6), 21-33 (2009).</li>
<li>Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+studies+of+human+subcutaneous+adipose+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Morphologic studies of human subcutaneous adipose tissue in vitro.</a> Anatomical Record. 169 (1), 97-104 (1971).</li>
<li>Sugihara, H., Yonemitsu, N., Miyabara, S., Yun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cultures+of+unilocular+fat+cells%3A+characteristics+of+growth+in+vitro+and+changes+in+differentiation+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Primary cultures of unilocular fat cells: characteristics of growth in vitro and changes in differentiation properties.</a> Differentiation. 31 (1), 42-49 (1986).</li>
<li>Sugihara, H., Yonemitsu, N., Toda, S., Miyabara, S., Funatsumaru, S., Matsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilocular+fat+cells+in+three-dimensional+collagen+gel+matrix+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Unilocular fat cells in three-dimensional collagen gel matrix culture.</a> The Journal of Lipid Research. 29, 691-697 (1988).</li>
<li>Hazen, S. A., Rowe, W. A., Lynch, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+cell+culture+of+freshly+isolated+adipocytes+using+extracellular+basement+membrane+components%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Monolayer cell culture of freshly isolated adipocytes using extracellular basement membrane components.</a> The Journal of Lipid Research. 36, 868-875 (1995).</li>
<li>Fried, S. K., Kral, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+regional+distribution+of+fat+cell+size+and+lipoprotein+lipase+activity+in+morbidly+obese+patients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Obesity%22%5BJournal%5D)">Sex differences in regional distribution of fat cell size and lipoprotein lipase activity in morbidly obese patients.</a> International Journal of Obesity. 11 (2), 129-140 (1987).</li>
<li>Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+National+Institutes+of+Health.+Microphysiological+Systems+Program+focuses+on+a+critical+challenge+in+the+drug+discovery+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">The National Institutes of Health. Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline.</a> Stem Cell Research and Therapy. 4, (2013).</li>
<li>Wikswo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+and+potential+roles+of+microphysiological+systems+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1061-1072 (2014).</li>
<li>National Institutes of Health. NIH-CASIS Coordinated Microphysiological Systems Program for Translational Research in Space (#RFA-TR-18-001). , Available from:
 <a target="_blank" href="https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html">https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html</a> (2017).</li>
<li>Lau, F. H., Vogel, K., Luckett, J. P., Hunt, M., Meyer, A., Rogers, C. L., Tessler, O., Dupin, C. L., St Hilaire, H., Islam, K. N., Frazier, T., Gimble, J. M., Scahill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sandwiched+White+Adipose+Tissue%3A+A+Microphysiological+System+of+Primary+Human+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Sandwiched White Adipose Tissue: A Microphysiological System of Primary Human Adipose Tissue.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (3), (2018).</li>
<li>Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0969806X07000795">Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers.</a> Radiation Physics and Chemistry. 76, 1409-1413 (2007).</li>
<li>Lin, J. B., Isenberg, B. C., Shen, Y., Schorsch, K., Sazonova, O. V., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermo-responsive+poly%28N-isopropylacrylamide%29+grafted+onto+microtextured+poly%28dimethylsiloxane%29+for+aligned+cell+sheet+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).</li>
<li>Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Engineering%3A+Construction+of+a+Multicellular+3D+Scaffold+for+the+Delivery+of+Layered+Cell+Sheets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51044(2014).</li>
<li>Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells%3A+Isolation%2C+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation.</a> Methods. 45 (2), 115-120 (2008).</li>
<li>Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+poly%28N-isopropylacrylamide%29+grafted+layer+on+polystyrene+surfaces+for+cell+adhesion%2Fdetachment+control%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control.</a> Langmuir. 20 (13), 5506-5511 (2004).</li>
<li>Fried, S. K., Russell, C. D., Grauso, N. L., Brolin, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoprotein+lipase+regulation+by+insulin+and+glucocorticoid+in+subcutaneous+and+omental+adipose+tissues+of+obese+women+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Lipoprotein lipase regulation by insulin and glucocorticoid in subcutaneous and omental adipose tissues of obese women and men.</a> Journal of Clinical Investigation. 92 (5), 2191-2198 (1993).</li>
<li>Keipert, S., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brite%2Fbeige+fat+and+UCP1+-+is+it+thermogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Brite/beige fat and UCP1 - is it thermogenesis?</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (7), 1075-1082 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol gegevens het gebruik van ADSCs om sandwich menselijke witte adipeus weefsel; menselijke ADSC cellijnen kunnen worden geïsoleerd via gevestigde protocollen15. Het systeem kan echter aangepast voor geïndividualiseerde onderzoek eisen (zoals het gebruik van sandwich muis WAT cellen 3T3L-1). Dit proces omvat de behandeling van primaire menselijk weefsel. Standaard voorzorgsmaatregelen moeten worden gebruikt; omgaan met menselijke weefsels als BSL-2 pathogenen (bijvoorbeeld HIV, H...

Adipeus weefsel is het belangrijkste orgaan van obesitas, dat bestemd is voor rechtstreekse jaarlijkse medische kosten tussen $147 miljard en 210 miljard dollar in de US1. De ophoping van vetweefsel draagt ook bij tot andere belangrijkste doodsoorzaken zoals hart-en vaatziekten, diabetes type II en bepaalde soorten kanker2. In vitro cultuur modellen zijn essentieel voor metabole studies en Geneesmiddelenontwikkeling, maar de huidige onderzoeksmodellen van vetweefsel hebben grote tekortkomingen. Adipocytes zijn kwetsbaar, veerkrachtige en terminaal gedifferentieerde cellen die niet voldoet aan de cel cultuur kunststoffen, en daarom niet kunnen worden gekweekt met behulp van conventionele cel kweekmethoden. Sinds de jaren 1970, hebben verschillende methoden gebruikt in pogingen om deze belemmeringen, waaronder het gebruik van glas coverslips, plafond cultuur, cultuur van de opschorting en extracellulaire matrices3,4,5, 6 , 7. echter, deze methoden werden gekenmerkt door celdood en dedifferentiation, en ze worden doorgaans gebruikt voor niet meer dan een twee weken durende studieperiode. Bovendien, deze modellen niet proberen de inheemse obesitas communicatie recapituleren als ze niet kunnen het intact ECM bewaren, de interacties tussen adipocytes en stromale cellen steunen, noch de cellen contractiele krachten op elkaar in in vivo uitoefenen WAT.
In de afwezigheid van een gouden standaard primaire obesitas cultuur-methode, heeft obesitas onderzoek ingeroepen voornamelijk gedifferentieerde pre adipocytes (diffAds). DiffAds zijn multilocular, aanhangend en metabolisch actief. Daarentegen, primaire witte adipocytes zijn unilocular, nonadherent, en getuigen van de relatief lage stofwisseling. Het falen van de huidige obesitas cultuur modellen te recapituleren de Fysiologie van gezonde volwassen adipeus weefsel is waarschijnlijk een belangrijke factor bij gebrek aan FDA-goedgekeurde medicijnen die rechtstreeks gericht zijn op adipocytes. In feite, is het gebrek aan fysiologische in vitro orgel modellen een groot probleem in de meeste organen en ziekte.
In haar stellingname aankondiging van de oprichting van het programma van de Microphysiological systemen (MPS), de National Institutes of Health (NIH) gemeld dat het slagingspercentage van 2013 over alle menselijke farmaceutische klinische proeven slechts 18% voor fase II en 50% voor fase III was klinische proeven8. Het MPS programma is ontworpen om direct het onvermogen van in vitro monocultuur te model menselijke fysiologie. De NIH definieert MPSs als cultuur systemen bestaat uit menselijke primaire of stamcellen in meercellige 3D constructies die orgel werking recapituleren. In tegenstelling tot reductionistische modellen van homogene, vereeuwigd celculturen, moet de MPSs nauwkeurig model cel, drug-cel, drug-drug en orgel-drug interacties9. In tegenstelling tot korte termijn primaire kweekmethoden dicteren NIH normen MPS duurzaamheid meer dan 4 weken in cultuur8. Verdere details van het MPS programma vindt u op de de NIH RFAs (#RFA-TR-18-001)10.
We hebben ontwikkeld, een eenvoudig, roman, flexibel, en goedkope obesitas MPS genoemd "ingeklemd witte vetweefsel" (SWAT)11. We overwinnen de natuurlijke drijfvermogen van adipocytes door "sodat" gehakt primaire adipeus weefsel tussen bladen van adipeus-afgeleide stromale cellen (ADSCs) (Figuur 1). De resulterende 3D constructie recapituleert de cel-cel-contact en de inheemse obesitas communicatie door omringende volwassen adipocytes met een natuurlijke adipocyte ondersteuning-celpopulatie. SWAT is gevalideerd door het tonen van de 8-weekse levensvatbaarheid, reactie op exogene signalering, de secretie van de adipokine en engraftment in een dierlijk model.

<table><tbody><tr><td>10x HBSS</td><td>Thermofisher</td><td>14185052</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A9251</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>M199 Media</td><td>Thermofisher</td><td>11043023</td><td>Phenol red-free&nbsp;</td></tr><tr><td>250 &micro;m Mesh Filter</td><td>Pierce</td><td>87791</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &micro;m Syringe Filter</td><td>Celltreat</td><td>229747</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Luer-Lok syringes&nbsp;</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Metal Washers</td><td></td><td></td><td>Deze zijn eenvoudige metalen ringen en kunnen worden gekocht in elke ijzerwarenwinkel. Ze voegen simpelweg lichtgewicht toe aan de achterkant van de plugers om een gelijkmatige contact tussen cellen en gelatine te garanderen, terwijl ze gemakkelijk te voorraadvoeren en te steriliseren zijn. Geschatte massa: 6,3 g&nbsp;</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Verwarmde apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubeerde Orbitale Shaker</td><td>VWR</td><td>10020-988</td><td>Steekproeven moeten worden geplaatst onder een hoek van 45&deg; om collageenase-vertering te vergemakkelijken</td></tr><tr><td>Heat Block</td><td></td><td></td><td>Instellen op 37-40 &deg;C en onder Biosafety Cabinet plaatsen</td></tr><tr><td>Water Bath</td><td></td><td></td><td>Instellen op ~75 &deg;C</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Speciale kunststoffen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Upcell Dishes 6cm van 6-multiwell</td><td>Nunc</td><td>174902&nbsp; of 174901</td><td>Dit zijn commercieel verkrijgbare pNIPAAm-gecoate schalen die kunnen worden gebruikt om de bovenste laag ADSCs te laten groeien. Alternatief kunnen pNIPAAm-gecoate platen in het lab worden geproduceerd. diameter: &lt;6 cm voor 6 cm schaal, &lt;3,5 cm voor 6-well plate; geschatte massa: 6,7g voor 6 cm schaal, 5,1 g voor 6-well plate</td></tr><tr><td>Kunststof Plunger Apparaat</td><td></td><td></td><td>Deze kunnen worden gemaakt om te passen in gewenste pNIPAAm-gecoate kunststoffen (multiwell platen, petrischalen). Ze bestaan uit een eenvoudige steel die aan een cirkelvormige schijf is bevestigd. Ze kunnen in het lab worden geproduceerd of door een faciliteit die acryl kunststoffen kan maken</td></tr></tbody></table>

een microphysiologic platform voor menselijk vet: ingeklemd wit vetweefsel

A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue

Witte vetweefsel (WAT) speelt een cruciale rol bij het reguleren van gewicht en dagelijks gezondheid. Er zijn echter belangrijke beperkingen aan beschikbaar primaire cultuur modellen, die allemaal gelukt te trouw de obesitas communicatie recapituleren of WAT levensvatbaarheid na twee weken uit te breiden. Het gebrek aan een betrouwbare primaire cultuur model belemmert ernstig onderzoek in WAT metabolisme en Geneesmiddelenontwikkeling. Daartoe hebben we de NIH normen van een microphysiologic systeem voor de ontwikkeling van een nieuw platform voor primaire cultuur WAT genaamd 'SWAT' (ingeklemd witte vetweefsel) gebruikt. We overwinnen de natuurlijke drijfvermogen van adipocytes door sodat gehakt WAT clusters tussen bladen van adipeus-afgeleide stromale cellen. In deze constructie zijn WAT monsters levensvatbaar meer dan acht weken in cultuur. SWAT onderhoudt de intact ECM, cel-naar-cel contactpersonen en fysieke druk van in vivo WAT voorwaarden; Daarnaast onderhoudt SWAT een robuuste transcriptionele profiel, gevoeligheid voor exogene chemische signalen, en hele weefsel functie. SWAT vertegenwoordigt een effectieve, eenvoudige en reproduceerbare methode van primaire obesitas cultuur. Potentieel, is het een breed toepasbare platform voor onderzoek in WAT fysiologie, pathofysiologie, metabolisme en farmaceutische ontwikkeling.

Levensvatbaarheid van SWAT was in eerste instantie beoordeeld door seriële helderveld beeldvorming van individuele WAT clusters (n = 12) ongeveer 7,6 weken. Clusters bleef beveiligde in plaats op de enkelgelaagde gedurende deze tijd. Lichte morfologische veranderingen werden waargenomen met individuele adipocytes iets kromtrekken of posities verschuiven. Maar, adipocytes evenmin worden multilocular na verloop van tijd, met vermelding van een gebrek aan dedifferentiation, noch deed ze vert...

Witte vetweefsel (WAT) heeft kritieke tekortkomingen in de huidige primaire cultuur modellen, belemmeren farmacologische ontwikkeling en metabole studies. Hier presenteren we een protocol voor de productie van een systeem van de obesitas microphysiological door klemmen WAT tussen bladen van stromale cellen. Deze constructie biedt een stabiele en flexibele platform voor primaire WAT cultuur.

Een Microphysiologic Platform voor menselijk vet: ingeklemd wit vetweefsel

White adipose tissue (WAT) plays a crucial role in regulating weight and everyday health.  Still, there are significant limitations to available primary ...

Deze baanbrekende methode stelt ons voor het eerst in staat om vet gedurende meerdere opeenvolgende weken ex vivo gezond en levend te houden voor de studie van de vetbiobiologie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het weefsel gedurende acht weken stabiel blijft in de cultuur terwijl het het vetmicro-omgeving inclusief de omringende inheemse vetstroma-ondersteunende cellen nabootst. Begin met het zaaien van ASC bij een confluency van ongeveer 80% in weefselkweekplaten.Voor elke wenselijke SWAT-well, zaai één conventionele weefselkweekwell en één well van overeenkomstige grootte op een PNIPAAm-gecoate weefselkweek-plastic plaat. Houd de ASC in compleet kweekmedium bij 37 graden Celsius en 5%CO2 gedurende zes tot acht dagen, waarbij het medium om de twee dagen wordt ververst. Vierentwintig uur voor het zaaien van SWAT, wikkel de rand van de plunjer schijf van elke plunjer voor de SWAT zaai-apparatuur minstens twee keer af met lab tape om lekkage van de gelatine oplossing te voorkomen.In een met ethanol gedesinfecteerde bioveiligheids kast, spuit een rek met 15 milliliter conische buizen met lege, ongekapte 15 milliliter conische buizen, evenals elke tape omwikkelde pl

a-microphysiologic-platform-for-human-fat-sandwiched-white-adipose

Research

JoVE Journal

Behavior

Gedrag

Als gevolg van de drastische en negatieve verband tussen obesitas en andere comorbiditeiten, onderzoek naar de rol vetweefsel speelt bij de ziekte en de algehele gezondheid gerechtvaardigd is. We presenteren een protocol voor isolatie en excisie van vet depots waardoor de studie van adipose gebruik in situ en in vitro methoden.

Lokalisatie, identificatie, en Excisie van Muriene Adipose Depots

De hier gepresenteerde methode gebruikt 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) positron emissie tomografie / computertomografie (PET-CT) en vet-water gescheiden magnetische resonantie beeldvorming (MRI), elk afgetast na 2 uur blootstelling aan thermisch (24 ° C ) en koude omstandigheden (17 ° C) om bruin vetweefsel (BAT) bij volwassen proefpersonen kaart.

Human Brown VetWeefsel Depots automatisch gesegmenteerd op basis van Positron Emissie Tomografie / Computed Tomography en geregistreerde Magnetic Resonance Images

Als gevolg van het hoge vetgehalte, heeft adipeus weefsel is uitdagend om te visualiseren met behulp van traditionele histologische methoden. Adipo-Clear is een weefsel clearing techniek waarmee robuuste labeling en hoge resolutie volumetrische fluorescerende beeldvorming van vetweefsel. Hier beschrijven we de methoden voor de bereiding van de monsters, voorbehandeling, kleuring, clearing en montage voor imaging.

Adipo-Clear: Een weefsel Clearing methode voor driedimensionale beeldvorming van vetweefsel

Hier presenteren we menselijke vetweefsel enzym-vrije micro-fragmentatie met behulp van een gesloten systeem apparaat. Deze nieuwe methode maakt het verkrijgen van sub-millimeter clusters van vetweefsel geschikt voor in vivo transplantatie, in vitro cultuur, en verdere celisolatie en karakterisering.

Menselijke vetweefsel micro-fragmentatie voor Celfenotyping en Secretome karakterisatie

Dit protocol beschrijft de technische benadering om adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties te isoleren uit intra-abdominale witte vetweefseldepots (WAT) van muizen door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering of immunomagnetische parelscheiding.

Isolatie van adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties uit intra-abdominale vetdepots van muizen

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol dat het gebruik van microvasculaire fragmenten geïsoleerd uit knaagdier- of menselijk vetweefsel schetst als een eenvoudige benadering om functioneel, gevasculariseerd beige vetweefsel te engineeren.

Driedimensionale kweek van gevasculariseerd thermogeen vetweefsel uit microvasculaire fragmenten

Dit protocol beschrijft de semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit muizenvetweefsel om preadipocyten te verkrijgen en adipocytendifferentiatie in vitro te bereiken. Het gebruik van een weefseldissociator voor collagenasevertering vermindert experimentele variatie en verhoogt de reproduceerbaarheid.

Semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie uit muizenwit vetweefsel met behulp van een weefseldissociator

Hier beschrijven we een protocol voor het isoleren, kweken en fenotyperen van microvasculaire endotheelcellen uit menselijk onderhuids vetweefsel (hSATMVEC's). Daarnaast beschrijven we een experimenteel model van hSATMVEC-adipocyte overspraak.

Bestudering van overspraak van vet-endotheelcellen en adipocyten in menselijk onderhuids vetweefsel

Hier presenteren we een protocol dat autoloog vetweefsel kan transformeren in verschillende vetbestanddelen met verschillende fysisch-chemische eigenschappen en functies.

Innovatieve fractionering van vetweefsel voor het omzetten van vet in gespecialiseerde componenten

Met een ex vivo explant-model worden kleine stukjes van het rostrale deel van visceraal wit vetweefsel van magere muizen 7–10 dagen gekweekt, waardoor ontsteking in vetweefsel tijdens vetrijke voeding kan worden geïnduceerd en bestudeerd.

Een ex vivo muismodel voor vetrijke vetachtige vetweefselontsteking

Leer een microfysiologisch platform voor wit vetweefselcultuur met behulp van ingeklemd wit vetweefsel. Deze methode houdt weefsel acht weken levensvatbaar voor metabool onderzoek.

Een Microphysiologic Platform voor menselijk vet: ingeklemd wit vetweefsel

Meer video's verkennen