Een Microphysiologic Platform voor menselijk vet: ingeklemd wit vetweefsel

Deze baanbrekende methode stelt ons voor het eerst in staat om vet gedurende meerdere opeenvolgende weken ex vivo gezond en levend te houden voor de studie van de vetbiobiologie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het weefsel gedurende acht weken stabiel blijft in de cultuur terwijl het het vetmicro-omgeving inclusief de omringende inheemse vetstroma-ondersteunende cellen nabootst. Begin met het zaaien van ASC bij een confluency van ongeveer 80% in weefselkweekplaten.

Voor elke wenselijke SWAT-well, zaai één conventionele weefselkweekwell en één well van overeenkomstige grootte op een PNIPAAm-gecoate weefselkweek-plastic plaat. Houd de ASC in compleet kweekmedium bij 37 graden Celsius en 5%CO2 gedurende zes tot acht dagen, waarbij het medium om de twee dagen wordt ververst. Vierentwintig uur voor het zaaien van SWAT, wikkel de rand van de plunjer schijf van elke plunjer voor de SWAT zaai-apparatuur minstens twee keer af met lab tape om lekkage van de gelatine oplossing te voorkomen.

In een met ethanol gedesinfecteerde bioveiligheids kast, spuit een rek met 15 milliliter conische buizen met lege, ongekapte 15 milliliter conische buizen, evenals elke tape omwikkelde plunjer met 70% ethanol, en plaats elke plunjer in een lege buis zodra deze gedesinfecteerd is. Spuit ongeveer 6,3 gram metalen ringen en plaats ze op de rek samen met een paar haakjes. Sluit vervolgens de kast deur en zet het UV-licht aan om de overnacht droging en sterilisatie van de zaai-apparatuur materialen te vergemakkelijken.

Wanneer de cellen 100%confluency bereiken en een gestreept patroon vertonen, voeg 0,75 gram gelatine poeder toe aan 10 milliliter HBSS. En balanceer de pH van de oplossing met 100 microliters natriumhydroxide. Voeg de gelatine toe aan een 75 graden Celsius waterbad en schud de buis krachtig om de vijf minuten totdat het poeder zich in de oplossing oplost.

Zeef de homogene gelatine oplossing door een spuitfilter en breng de gelatine aan op de plunjers. De afgeplakte randen van de plunjers zullen dienen als een mal terwijl de gelatine stolt. Wanneer de gelatine is gestold, wikkel de tape los en gebruik de haakjes om de gelatine van de buitenrand van de plunjer te verwijderen, waarbij moet worden gelet op de gelijkmatigheid van de resterende gelatine in het midden van de plunjer, om het contact met de ASC-sheet te maximaliseren.

Zodra de gelatine van alle plunjers is verwijderd, plaats je voorzichtig elke plunjer op een PNIPAAm gecoate ASC-plaat met behulp van de metalen ringen om de plunjers te verzwaren. Na een incubatie van 1,5 uur bij kamertemperatuur, breng je de platen over naar een ijs-waterbad voor nog eens 1,5 uur om de dissociatie van de cel sheet van het PNIPAAm gecoate plaatoppervlak te voltooien. Reinig vervolgens de bodem van de PNIPAAm gecoate platen om alle niet-steriele water te verwijderen.

Bij ontvangst van het menselijke vetweefsel, voeg je koud kweekmedium toe aan één 1,5 milliliter microcentrifugebuis per kweek die gezaaid zal worden. En was grote segmenten van het vetweefsel drie keer in steriele PBS, verwijder zoveel mogelijk PBS tussen de wasbeurten. Na de laatste was, gebruik je een pincet en een steriele scheermes om het weefsel grof te snijden, waarbij zoveel mogelijk vaat en fascia wordt verwijderd totdat de oplossing een dikke vloeibare consistentie krijgt met zo min mogelijk zichtbare afzonderlijke segmenten van wit vetweefsel.

Zodra een goede weefselconsistentie is bereikt, gebruik je een aangepaste P1000 micro-pipet tip om het juiste volume gesneden weefsel over te brengen naar elke eerder voorbereide 1,5 milliliter buis en meng kort het gesneden weefsel met het medium in de buizen. Vervolgens vervang je het medium in elke ASC-kweek met één volume wit vetweefsel oplossing, en breng je de gelatine plunjers voorzichtig over naar het wit vetweefsel mengsel op de basis ASC-platen. Bekijk de monolayers in de PNIPAAm gecoate platen onder een microscoop om cellulaire loslating te bevestigen en verplaats de platen naar het oppervlak van een 37 tot 40 graden Celsius hitteblok in de bioveiligheidskast.

Voeg vervolgens twee tot drie milliliter verwarmd kweekmedium toe om de cellen te incuberen en om het smelten van gelatine te vergemakkelijken. Na 30 minuten verwijder je voorzichtig de plunjers van het plaatoppervlak, dek de culturen af met de juiste plaatdeksels en plaats de platen in de celkweek incubator. Wanneer de gelatine volledig is gesmolten, aspireer en vervang je het celkweekmedium met het juiste volume fenolrode vrije M199 medium gesupplementeerd met insuline, dexamethason en antibiotica.

Gedurende 7,5 weken kweek, blijven de SWAT clusters op de monolayer op hun plaats bevestigd met slechts lichte morfologische veranderingen waargenomen in individuele adipocyten. Duidelijke Nile rood kleuring van uniloculaire adipocyten clusters na twee weken kweek toont aan dat de cellen inderdaad adipocyten zijn met intacte membranen, in plaats van artefact, cysten of dode adipocyten. Propidium jodide kleuring van 53-daagse SWAT en Oil Red O kleuring van 51-daagse SWAT culturen bevestigen dat de adipocyten zelfs op gevorderde tijdstippen levensvatbaar blijven.

Immunoccytochemie toont de juiste verwachte eiwitexpressie en lokalisatie van rijpe adipocyten markers binnen de SWAT en kwantitatieve PCR geeft de expressie van belangrijke adipocyten genen op transcriptioneel niveau aan. De evaluatie van de basilaire endocriene functie geeft basilaire leptine secretie van de SWAT culturen aan zoals gedetecteerd door ELISA, en glycerol afgifte kan ook worden geïnduceerd in reactie op chemische stimulatie. Xenotransplantatie van SWAT-gecultiveerde adipocyten onthult duidelijk zichtbare en gemakkelijk te herstellen vetafzettingen 10 dagen na transplantatie die kleuren voor humane maar niet muis adipocyten markers.

Eenmaal beheerst, kan deze techniek in ongeveer vijf uur worden voltooid als deze goed wordt uitgevoerd. Het is belangrijk om te onthouden om het primaire weefsel snel te verwerken om celdood te minimaliseren. Na deze procedure kunnen andere methoden zo