Name: Opsporen van Eiwit Subcellular Localisatie door Green fluorescentie eiwit Tagging en 4, 6-Diamidino-2-phenylindole vlekken in Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Leer eiwitkerntranslocatie onder warmtestress volgen met GFP-fusie-eiwitten en DAPI-kleuring in Caenorhabditis elegans. Deze snelle methode maakt gelijktijdige observatie van kernkleuring en subcellulaire lokalisatie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De stammen van de C. elegans gebruikt in deze studie werden verkregen uit de Caenorhabditis genetica Center, dat wordt ondersteund door de National Institutes of Health - Office van onderzoek infrastructuur-programma's (P40 OD010440). Dit werk werd gesteund door de NIH: 1R03AG048578-01 Jun Liang, CUNY-CCRG 1501 Jun Liang en PSC-CUNY 66184-00 44 en 67248-00 45 tot Jun Liang. Wij danken Cathy Savage-Dunn voor de kandidatuur delen haar laboratorium ruimte. Alle afbeeldingen van de fluorescentie werden verzameld bij Queens College Core faciliteit. Wij danken William J. Rice voor zijn opmerkingen over het manuscript.

1. oplossingen
<ol><li>
NGM platen
	<ol>
<li>Toevoegen in een erlenmeyer van 2 L, 3 g NaCl, 17 g agar, 2,5 g pepton en 975 aantal milliliters dH2O. Cover de monding van de kolf met aluminiumfolie. Autoclaaf de kolf gedurende 50 minuten afkoelen voor 20-30 min.</li>
		<li>Voeg vervolgens gesteriliseerde oplossingen: 1 mL van de 1 M CaCl2, 1 mL 5 mg/mL cholesterol in ethanol, 1 mL van de 1 M MgSO4en 25 mL van de 1 M KPO4 (pH 6.0) buffer. Swirl de oplossingen om hen goed te mengen.</li>
		<li>Met behulp van een vloeistof dispenser, afzien de NGM oplossing voor 60 mm Petri platen. Vul de platen 2/3 vol agar. Opslaan in een luchtdichte verpakking bij 4 ° C voor toekomstig gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1 M KPO4 buffer (pH 6.0)
	<ol>
<li>Los 10.83 g van KH2PO4 en 3,56 g K2HPO4 in dH2O en het totale volume aan tot 100 mL. Autoclaaf de oplossing gedurende 15 minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
M9
	<ol>
<li>Los 3 g KH2PO4, 6 g Na,2HPO4, 5 g NaCl in dH2O, voeg 1 mL 1 M MgSO4en het totale volume aan 1 L.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
10 µg/mL DAPI
	<ol>
<li>Voeg 1 µL van 10 mg/mL DAPI in 999 µL van dH2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
95% alcohol (v/v)
	<ol>
<li>Meten van 95 mL voor 100% alcohol en Voeg gedistilleerd water om het volume tot 100 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
30% aceton (v/v)
	<ol>
<li>Voeg 30 mL aceton toe aan dH2O en het totale volume aan tot 100 mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. de hittestress
<ol><li>Een lijn van de extrachromosomal matrix met een translationeel constructie van doel genen9,10te genereren. Als alternatief, verkrijgen deze lijnen uit de Caenorhabditis genetica Center (CGC), oftewel een publieke hulpbron voor C. elegans onderzoek, of van een eerder gepubliceerde onderzoekslaboratorium.</li>
	<li>De extrachromosomal lijnen in het genoom integreren door wormen 3.800 Rad γ-straling9bloot te leggen. Selecteer vervolgens de regels stabiel uitgedrukt zodat elk dier een marker-eiwit zoals een GFP of roller brengt.</li>
	<li>Genenoverdracht als wilt verwijderen mutaties gegenereerd tijdens de straling, de lijnen ten minste 2 x. Deze transgene lijn gebruikt om eiwit expressie patroon wijzigingen onder stress te herkennen.</li>
	<li>Bereiden NGM worm platen zoals beschreven in stap 1.1. Strijk een kloon van de OP50 en de cultuur van de bacteriën in vloeibare de pond-Bouillon 's nachts. Zaad de NGM platen met vloeibare OP50 cultuur en Incubeer de platen in een incubator 37 ° C's nachts een gazon bacteriën groeien als een bron van voedsel voor de wormen. De platen bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten vóór gebruik afkoelen.</li>
	<li>Groeien de transgene lijn bij 20 ° C zonder honger voor ten minste 2 generaties vóór de hitte-stress-test.</li>
	<li>Kies 8 – 10 gravid jongvolwassenen (baarmoeder gevuld met eieren) naar een nieuwe worm plaat en laat ze leggen eieren voor ongeveer 3-5 h en verwijder alle volwassenen van de platen.</li>
	<li>Als u wilt synchroniseren de wormen, laat de eieren uitkomen en groeien de larven gedurende ongeveer 48 uur tot het vierde larvale stadium van de (L4). Het onderzoeken van hun vulva structuur (een halve maan structuur) om te identificeren van de L4 fase (Figuur 1, pijl)11.</li>
	<li>Plaats de platen van de worm met de L4 larven in een incubator 35 ° C voor 2-5 h om hittestress. Plaats een thermometer in de incubator voor het nauwkeurig meten van de temperatuur.</li>
</ol>3. de DAPI kleuring
<ol><li>
Ethanol fixatie
	<ol>
<li>Voeg 10 µL van de M9 buffer in het midden van een glasplaatje.</li>
		<li>Kies de warmte-geschokt wormen uit stap 2.8 en leg ze in de buffer van de M9 op het glasplaatje.<ol>
<li>Als alternatief, wassen van de plaat met de M9, het Centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant. De wormen aan het glasplaatje toevoegen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Gebruik een zacht weefsel om eventuele overtollige vloeistof. Bekijk deze stap onder een Microscoop ontleden.</li>
		<li>Voeg 10 µL van 95% alcohol op de wormen en laat ze droge lucht. Bekijk het proces onder een Microscoop ontleden en laat niet de dieren krijgen te droog. Onmiddellijk na de ethanol is verdampt van de dieren, gaat u verder met de volgende stap. Opmerking: Ethanol verdampt zeer snel.</li>
		<li>Herhaal stap 3.1.4 tweemaal zodat de wormen worden opgelost. Opmerking: Het is normaal dat de dieren te kijken donkerder en vervormd.</li>
		<li>Voeg 10 µL van de DAPI (10 µg/mL) voor de wormen. Onmiddellijk dek ze af met een dekglaasje aan en verzegel de dia met doorzichtige nagellak gel.</li>
		<li>Bekijk de dieren na ongeveer 10 min op een fluorescentie Microscoop.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aceton fixatie (een alternatieve benadering)
	<ol>
<li>Wassen van de warmte-geschokt plaat uit stap 2.8 met M9, het Centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant. Wassen van de pellet met 1 mL dH2O, verzamelen de pellet en verwijder het supernatant.</li>
		<li>Voeg 400 µL van 30% aceton voor 15 min. Centrifuge bij 1.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant. Gebruik van 500 µL dH2O te wassen de dieren 2 x. Verwijder het supernatant.</li>
		<li>Voeg 200 µL van de DAPI (10 µg/mL), of 4 x het bedrag van de totale wormen volume in de buis gedurende 15 minuten.</li>
		<li>Centrifugeer bij 1.000 x g voor 1 min en verwijder het supernatant. Wassen van de pellet 2 x met 500 µL van dH2O. plaats van de wormen op glas dia's, bestrijk ze met coverslips zegel van de dia met doorzichtige nagellak gel en observeren de dieren onder een fluorescentie Microscoop.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. de microscopische beeldvorming
<ol><li>Schakel de UV-lichtbron en een fluorescentie Microscoop. Zet de computer verbonden met de Microscoop.</li>
	<li>Laden van de dia op de fluorescentie Microscoop. Gebruik een energiebesparende objectief (10 X) om de wormen te vinden, de vergroting verhogen tot 400 X en zich richten op het model.</li>
	<li>Open de software die wordt geleverd met de Microscoop. Klik op de "Overname" in het menu; Klik op de "Camera" en kies de camera die is aangesloten op de Microscoop; Hierdoor worden de geselecteerde camera om te communiceren met de software. Opmerking: Andere microscopen kunnen variëren in werking.</li>
	<li>Onder de dezelfde "overname", tikken voort "Multidimensionale verwerving". Dit opent een nieuw "Multidimensionale verwerving" navigatie venster. Klik op de "Multichannel" knop en alle beschikbare kanalen wordt weergegeven.</li>
	<li>Blauw, groen en DIC (differentiële interferentie contrast) acht het model te kiezen. In het venster "Multidimensionale verwerving" navigatie laat de "Blue-DAPI", "Green-GFP" en "Grey-DIC", "Nomarski" kanalen op; Klik met de rechtermuisknop op andere kanalen, zoals "Red-rhodamine" en "wit-helder veld", om hen te sluiten.</li>
	<li>
Eerst meten de belichtingstijd voor elk kanaal:
	<ol>
<li>Klik met de linkermuisknop het kanaal van de "Blue-DAPI" te selecteren en klik dan op "Maatregel" om een live beeld onder de DAPI-kanaal met de geautomatiseerde blootstellingstijd. Er verschijnt een nieuw venster met een live beeld.</li>
		<li>Aan de linkerzijde van het venster live beeld, pas handmatig de belichtingstijd indien nodig om de afbeelding naar wens te maken.</li>
		<li>Tenslotte, tikken voort "" OK "in het venster live beeld. Hiermee stelt u de belichtingstijd onder de DAPI-kanaal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herhaal stap 4.6 voor de andere kanalen, "Green-GFP" en "Grey-DIC", "Nomarski", de belichtingstijden voor die kanalen instellen.</li>
	<li>In het "Multidimensionale verwerving" navigatie venster, klik op "Start" voor het automatisch verzamelen van 3 beelden onder de 3 verschillende kanalen in volgorde (zie hierboven) met specifieke belichtingstijden als set.</li>
	<li>Als u wilt het bestand opslaat, gaan naar het hoofdmenu, klikt u op 'Bestand' en vervolgens op "Opslaan als". Naam van invoerbestand en de naam van de map. Sla het bestand als de standaardbestandsindeling voor het behoud van de beeldvorming Detailgegegevens voor toekomstig gebruik.</li>
	<li>
Het bestand in andere indelingen exporteren:
	<ol>
<li>Ga naar "File" en klik op "Export". Dit zal een uitvoer instelling venster openstellen.</li>
		<li>Bestandsnaam en map instellen. Controleer dat de gegevens "Een projectmap maken" beter te organiseren. De software maakt het ook mogelijk de gebruiker 4 andere opties op te geven: "Genereer samengevoegd afbeeldingen", "Gebruik kleur voor afbeeldingen kanaal", "Gebruik kanaalnamen" en "Alleen samengevoegde afbeelding".</li>
		<li>Kies een gewenste bestandstype uit de drop-down menu, zoals "TIF", "BMP", "PSD", "JPG" of andersoortige. Klik vervolgens op "Start" om te exporteren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Essers, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXO+transcription+factor+activation+by+oxidative+stress+mediated+by+the+small+GTPase+Ral+and+JNK%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Ral and JNK.</a> The EMBO Journal. 23 (24), 4802-4812 (2004).</li>
<li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JNK+regulates+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans+by+modulating+nuclear+translocation+of+forkhead+transcription+factor%2FDAF-16%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">JNK regulates lifespan in Caenorhabditis elegans by modulating nuclear translocation of forkhead transcription factor/DAF-16.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (12), 4494-4499 (2005).</li>
<li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+cleaved+BID+targets+mitochondria+and+is+required+for+cytochrome+c+release%2C+while+BCL-XL+prevents+this+release+but+not+tumor+necrosis+factor-R1%2FFas+death%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Caspase cleaved BID targets mitochondria and is required for cytochrome c release, while BCL-XL prevents this release but not tumor necrosis factor-R1/Fas death.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (2), 1156-1163 (1999).</li>
<li>Doerflinger, M., Glab, J. A., Puthalakath, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3-only+proteins%3A+a+20-year+stock-take%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">BH3-only proteins: a 20-year stock-take.</a> The FEBS Journal. 282 (6), 1006-1016 (2015).</li>
<li>Mayorova, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+containing+aragonite+crystals+mediate+responses+to+gravity+in+Trichoplax+adhaerens+%28Placozoa%29%2C+an+animal+lacking+neurons+and+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cells containing aragonite crystals mediate responses to gravity in Trichoplax adhaerens (Placozoa), an animal lacking neurons and synapses.</a> PLoS One. 13 (1), e0190905(2018).</li>
<li>Terron-Camero, L. C., Molina-Moya, E., Sanz-Fernandez, M., Sandalio, L. M., Romero-Puertas, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+%28ROS%2FRNS%29+during+hypersensitive+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) during hypersensitive cell death.</a> Methods in Molecular Biology. , 97-105 (2018).</li>
<li>Pedrazzini, E., Vitale, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29043678">Protein biosynthesis and maturation in the ER.</a> Methods in Molecular Biology. , 179-189 (2018).</li>
<li>Liang, J., Shaulov, Y., Savage-Dunn, C., Boissinot, S., Hoque, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+intracellular+channel+proteins+respond+to+heat+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chloride intracellular channel proteins respond to heat stress in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 12 (9), e0184308(2017).</li>
<li>Evans, T. C. Transformation and microinjection. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">Wormbook</a>. , edited by The C. elegans Research Community (2006).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Yochem, J. Nomarski images for learning the anatomy, with tips for mosaic analysis. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">Wormbook</a>. , edited by The C. elegans Research Community (2006).</li>
<li>Dulhunty, A., Gage, P., Curtis, S., Chelvanayagam, G., Board, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glutathione+transferase+structural+family+includes+a+nuclear+chloride+channel+and+a+ryanodine+receptor+calcium+release+channel+modulator%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The glutathione transferase structural family includes a nuclear chloride channel and a ryanodine receptor calcium release channel modulator.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (5), 3319-3323 (2001).</li>
<li>Suh, K. S., Malik, M., Shukla, A., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIC4%2C+skin+homeostasis+and+cutaneous+cancer%3A+surprising+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">CLIC4, skin homeostasis and cutaneous cancer: surprising connections.</a> Molecular Carcinogenesis. 46 (8), 599-604 (2007).</li>
<li>Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M., Kong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIC4+mediates+TGF-beta1-induced+fibroblast-to-myofibroblast+transdifferentiation+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">CLIC4 mediates TGF-beta1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer.</a> Oncology Reports. 22 (3), 541-548 (2009).</li>
<li>Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Edwards, J. C., Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+a+chloride+intracellular+channel+gene%2C+CLIC4%2C+in+transforming+growth+factor-beta1-mediated+conversion+of+fibroblasts+to+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Differential expression of a chloride intracellular channel gene, CLIC4, in transforming growth factor-beta1-mediated conversion of fibroblasts to myofibroblasts.</a> The American Journal of Pathology. 161 (2), 471-480 (2002).</li>
<li>He, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+CLIC4+in+the+host+innate+responses+to+bacterial+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Role of CLIC4 in the host innate responses to bacterial lipopolysaccharide.</a> European Journal of Immunology. 41 (5), 1221-1230 (2011).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+CLIC4+enhances+autophagy+and+triggers+mitochondrial+and+ER+stress-induced+apoptosis+in+human+glioma+U251+cells+under+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inhibition of CLIC4 enhances autophagy and triggers mitochondrial and ER stress-induced apoptosis in human glioma U251 cells under starvation.</a> PLoS One. 7 (6), e39378(2012).</li>
<li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+schnurri+homolog+sma-9+mediates+stage-+and+cell+type-specific+responses+to+DBL-1+BMP-related+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling.</a> Development. 130 (26), 6453-6464 (2003).</li>
<li>Leopold, L. E., Heestand, B. N., Seong, S., Shtessel, L., Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+pairing+during+meiosis+triggers+multigenerational+transgene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lack of pairing during meiosis triggers multigenerational transgene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), E2667-E2676 (2015).</li>
<li>Schultz, R. D., Bennett, E. E., Ellis, E. A., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+extracellular+matrix+organization+by+BMP+signaling+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Regulation of extracellular matrix organization by BMP signaling in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 9 (7), e101929(2014).</li>
<li>Matus, D. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+cell+fate+requires+G1+cell-cycle+arrest+and+histone+deacetylase-mediated+changes+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Invasive cell fate requires G1 cell-cycle arrest and histone deacetylase-mediated changes in gene expression.</a> Developmental Cell. 35 (2), 162-174 (2015).</li>
<li>Reddy, K. C., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+HIM-17+links+chromatin+modification+and+competence+for+initiation+of+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">C. elegans HIM-17 links chromatin modification and competence for initiation of meiotic recombination.</a> Cell. 118 (4), 439-452 (2004).</li>
<li>Ames, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-cell-autonomous+role+of+BEC-1%2FBECN1%2FBeclin1+in+coordinating+cell-cycle+progression+and+stem+cell+proliferation+during+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A non-cell-autonomous role of BEC-1/BECN1/Beclin1 in coordinating cell-cycle progression and stem cell proliferation during germline development.</a> Current Biology. 27 (6), 905-913 (2017).</li>
<li>Pekar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+the+environment%2C+DAF-7%2FTGFbeta+signaling+and+LAG-2%2FDSL+ligand+expression+in+the+germline+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Linking the environment, DAF-7/TGFbeta signaling and LAG-2/DSL ligand expression in the germline stem cell niche.</a> Development. 144 (16), 2896-2906 (2017).</li>
<li>Schvarzstein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+helicase+HIM-6%2FBLM+both+promotes+MutSgamma-dependent+crossovers+and+antagonizes+MutSgamma-independent+interhomolog+associations+during+caenorhabditis+elegans+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">DNA helicase HIM-6/BLM both promotes MutSgamma-dependent crossovers and antagonizes MutSgamma-independent interhomolog associations during caenorhabditis elegans meiosis.</a> Genetics. 198 (1), 193-207 (2014).</li>
<li>Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+polyploidization+and+cellular+proliferation+drive+body+size+evolution+in+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).</li>
<li>Nagamatsu, Y., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+the+control+of+body+size+by+a+G-kinase+and+a+downstream+TGFbeta+signal+pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for the control of body size by a G-kinase and a downstream TGFbeta signal pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Genes to Cells. 9 (1), 39-47 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te verklaren.

In dit artikel voorgesteld een snelle en efficiënte methode om te controleren of eiwit subcellular wijzigingen ten opzichte van het cytoplasma naar de kern. De eiwituitdrukking bleek ontstaan door een fusie van GLP, terwijl de kern structuur werd gecontroleerd door de DAPI kleuring (Figuur 3). Aangezien immunokleuring C. elegans eiwitten is uitdagend, meeste C. elegans eiwit subcellular lokalisaties worden gekenmerkt door tagging hen met marker eiwitten zoals GFP Laz, mCher...

Een verandering van eiwit subcellular localisatie is een gemeenschappelijk mechanisme in reactie op interne of externe signalen zoals hittestress, honger, oxidatieve stress, apoptosis, proteïne fosforylatie en anderen. Bijvoorbeeld induceert hittestress een FOXO lid1,2van de nucleaire translocatie van de DAF-16 en de pro-apoptotic BCL-2 eiwit die bod translocates aan de mitochondriën bij ontvangende overlijden signalering van3,4. Verschillende technieken zijn beschikbaar om deze wijzigingen te herkennen. Een combinatie van het westelijke bevlekken en biochemically isoleren subcellular structuren (bv, mitochondriën of de kernen) konden goed het bereiken van de doelstelling3. Het vereist echter een specifiek antilichaam tegen het eiwit van belang. Zo wordt een gevestigde antilichaam de sleutel tot het succes. Een alternatieve benadering is etikettering van verschillende subcellular structuren of organellen met verschillende markeringen zoals groene fluorescentie proteïne (GFP), rode fluorescentie eiwit (RFP), gele fluorescentie eiwit (YFP) en mCherry, en ondertussen de proteïne van label belang met andere markeringen. Dan, om hen onder een confocal microscoop te lokaliseren de doelstellingen5,6te observeren. Radioactieve isotopen zijn een alternatieve keuze voor het benoemen van doel eiwitten en vervolgens hun subcellular localisatie7opsporen. Echter, deze methode vereist een goede opleiding en de behandeling van radioactief afval. Omstandigheden zoals het gebrek aan een specifiek antilichaam, het ontbreken van een goede marker, of de schaarste van apparatuur, zoals een confocal microscoop moet een alternatieve aanpak worden overwogen. Ter identificatie van een nucleaire translocatie van eiwit, is het aantrekkelijk label alleen de doel-eiwitten met een marker en vlek kernen met het chemisch reagens 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) omdat dit alleen een regelmatige fluorescentie Microscoop vereist.
Immunolabeling, C. elegans met antilichamen is uitdagend vanwege de lage permeabiliteit van de "eggshell" of de collagene cuticle rondom het dier. Ondertussen, aangezien C. elegans eiwitten beduidend verschillend van hun gewervelde orthologs zijn, een paar commerciële bedrijven voorzien van C. elegans specifieke producten. Het is moeilijk voor een klein laboratorium voor het genereren van C. elegans antilichamen voor zichzelf. Onderzoekers in de Gemeenschap gebruiken vaak tagged eiwitten als markers om aan te tonen van een eiwit lokalisatie of gen-expressie. In dit artikel gebruikt EXL-1::GFP als voorbeeld voor het bijhouden van een nucleaire translocatie van eiwit onder hitte stress8. Een geïntegreerde translationeel exl-1::gfp in het genoom van dieren wordt gebruikt om het stabiel express het gen met gfp fusie. Onderzoek heeft uitgewezen dat exl-1 wordt uitgedrukt in de darm, lichaam muur spier en andere subcellular structuren8. Dit protocol laat zien hoe om te synchroniseren van wormen naar de vierde larvale fase (L4), voert u een hitte stress experiment, en gedrag DAPI kleuring, ethanol fixatie, aceton fixatie en beeldvorming onder een regelmatige fluorescentie Microscoop.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Biotium</td><td>40043</td><td>zowel Hoechst 33258 als Hoechst 33342 werken ook goed</td></tr><tr><td>OP50</td><td>CGC</td><td>OP50</td><td>https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td><td>https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>Kim Wipe</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td></td><td>zacht weefsel</td></tr><tr><td>Zeiss&nbsp; AX10</td><td>Zeiss</td><td></td><td>fluorescentiemicroscoop</td></tr><tr><td>Axiovision Rel 4.8</td><td>Zeiss</td><td></td><td>microscoopsoftware</td></tr><tr><td>AxioCam MR Rev3</td><td>Zeiss</td><td></td><td>digitale camera</td></tr><tr><td>Incubator&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transparant nagellakgel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm petrischalen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glazen platen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glazen dekvlakken</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-20 &micro;L pipettor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20-200 &micro;L pipettor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200-1000 &micro;L pipettor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-200 &micro;L pipet tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200-1000 &micro;L pipet tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL microcentrifugebuisjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platinedraadwormpook</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

opsporen van eiwit subcellular localisatie door green fluorescentie eiwit tagging en 4', 6-diamidino-2-phenylindole vlekken in caenorhabditis elegans

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

In dit protocol, een fusieproteïne van groene fluorescentie proteïne (GFP) en 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kleuring worden gebruikt voor het bijhouden van eiwit subcellular localisatie wijzigingen; in het bijzonder benadrukken een nucleaire translocatie onder een hitte voorwaarde. Eiwitten reageren dienovereenkomstig aan externe en interne signalen. Een gemeenschappelijk mechanisme is om te veranderen zijn subcellular localisatie. Dit artikel beschrijft een protocol voor het bijhouden van de lokalisatie van eiwit dat niet nodig een antilichaam, radioactieve labeling of een confocal microscoop. In dit artikel, wordt GFP gebruikt voor het label van de doel-proteïne EXL-1 in C. elegans, een lid van de chloride kanaal van intracellulaire eiwitten (CLICs) familie, waaronder zoogdieren CLIC4. Een geïntegreerde translationeel exl-1::gfp transgene lijn (met een promotor en een volledige gensequentie) werd bedacht door transformatie en γ-straling en stabiel de gene en gfpuitdrukt. Recent onderzoek toonde aan dat bij hittestress, niet oxidatieve stress, EXL-1::GFP hoopt zich op in de kern. Overlappende het GFP-signaal met zowel de structuur van de atoomkernen en de DAPI signalen bevestigt de EXL-1 subcellular localisatie wijzigingen onder stress. Dit protocol stelt twee verschillende fixatie methoden voor DAPI kleuring: fixatie van ethanol en aceton fixatie. De DAPI kleuring protocol gepresenteerd in dit artikel is snel en efficiënt en zowel het GFP-signaal en de eiwit subcellular localisatie wijzigingen blijven behouden. Deze methode vereist alleen een fluorescentie Microscoop met Nomarski, een FITC-filter en een DAPI-filter. Het is geschikt voor de instelling van een klein laboratorium, undergraduate student onderzoek, middelbare school student onderzoek en biotechnologie klaslokalen.

Chloride kanaal van intracellulaire eiwitten (CLIC) zijn multifunctionele eiwitten die zeer over soorten12zijn bewaard. Veel onderzoek laat zien dat CLICs cellulaire stress, autophagy, apoptosis, carcinogenese, angiogenese en de macrofaag aangeboren immuunrespons bij de zoogdieren systeem13,14,15,16 regelen ,...

Dit protocol laat zien hoe een eiwit nucleaire translocatie onder hittestress bijhouden met behulp van een groene fluorescentie proteïne (GFP) fusieproteïne als merkstof en 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kleuring. De DAPI kleuring protocol is snel en behoudt de GFP en eiwit subcellular localisatie-signalen.

Opsporen van Eiwit Subcellular Localisatie door Green fluorescentie eiwit Tagging en 4', 6-Diamidino-2-phenylindole vlekken in Caenorhabditis elegans

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van C.elegans, zoals celbiologie. Het grote voordeel van deze techniek is dat het snel en efficiënt is om signalen van nucleaire kleuring, GFP en veranderingen in subcellulaire lokalisatie gelijktijdig te verkrijgen. Om te beginnen, genereer een extrachromosomale array uitlijning met een translationeel construct van doelgenen.Alternatief, verkrijg dergelijke lijnen van het Caenorhabditis Genetic Center, dat een openbare bron is voor C.elegans onderzoek. Of, van een eerder gepubliceerd onderzoekslaboratorium. Na het blootstellen van wormen aan gammastraling om de extrachromosomale lijnen in het genoom te integreren, selecteer de stabiel geëxprimeerde lijnen zodat elk dier een markereiwit zoals een GFP of roller tot expressie brengt.Om mutaties die tijdens de straling zijn gegenereerd te verwijderen, kruis de lijnen ten minste twee keer uit. Gebruik de resulterende transgene lijn om veranderingen in eiwitexpressiepatronen onder stress te detecteren. Vervolgens, na het voorbereiden van NGM wormplaten volgens het tekstprotocol, streken een OP50-klon en cultiveer de bacteriën in vloeibare LB-bouillon een n

detecting-protein-subcellular-localization-green-fluorescence-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een procedure voor vloeibare-based kweken en verstrekking...

High-throughput screening &#39;en biosensing met fluorescerende C. elegans Stammen

"Freeze-kraken," een werkwijze voor het blootstellen van de inwendige weefsels van de nematode C. elegans antilichamen voor eiwit lokalisatie, wordt aangetoond.

Antilichaamkleuring in<em&gt; C. Elegans</em&gt; Een &#39;Freeze-Cracking &quot;

Om de relatie tussen eiwithomeostase, stress en veroudering te bestuderen, hebben we veranderingen in eiwitvouwing gemonitord door eiwitdisfunctie, eiwitlocalisatie in de cel en eiwitstabiliteit op organismisch, cellulair en eiwitniveau te volgen, met behulp van de genetisch hanteerbare metazoa Caenorhabditis elegans als modelsysteem.

Gebruik Caenorhabditis elegans Als een modelsysteem voor de Protein Homeostase studeren in een meercellige

Skeletspieren is essentieel voor de motoriek en is het lichaam 'belangrijkste eiwit store. Muscle gezondheid metingen binnen C. elegans beschreven. Prospectieve veranderingen in de spier structuur en functie worden beoordeeld met behulp van gelokaliseerde GFP en kationische kleurstoffen.

Methoden om subcellulaire compartimenten van Muscle beoordelen C. elegans

De transparante C. elegans darm kan dienen als een"in-vivo weefsel kamer" voor de studie van apicobasal membraan en lumen biogenese de eencellige en subcellular niveau tijdens meercellige tubulogenesis. Dit protocol beschrijft hoe te combineren met het standaard labeling, verlies-van-functie genetische/RNAi en microscopische benaderingen te ontleden van deze processen op een moleculair niveau.

C. elegans darm als een Model voor intercellulaire Lumen genuitdrukking en In Vivo gepolariseerde biogenese van eencellige niveau: Labeling door antilichaam kleuring, RNAi verlies-van-functie analyse en beeldvorming

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een goed model te bestuderen van axonale en intracellulair transport. Hier beschrijf ik een protocol voor in vivo opname en analyse van axonale en intraflagellair vervoer in C. elegans.

Immobilisatie van Caenorhabditis elegans te analyseren intracellulair Transport in neuronen

Een protocol voor het in beeld brengen van de dynamische microtubuli in vivo met behulp van fluorescerend gelabeld Eindbindend eiwit is gepresenteerd. We beschreven de methoden om de dynamische microtubuli in het posterieure laterale microtubuli (PLM) neuron van C. elegans te labelen,in beeld te geven en te analyseren .

In vivo Beoordeling van microtubule dynamica en oriëntatie in Caenorhabditis elegans neuronen

Intestinale microben, waaronder extracellulaire bacteriën en intracellulaire pathogenen zoals het Orsay-virus en microsporidia (schimmels), worden vaak geassocieerd met wilde Caenorhabditis-nematoden . Dit artikel presenteert een protocol voor het detecteren en kwantificeren van microben die C. elegans-nematoden koloniseren en / of infecteren, en voor het meten van de pathogenenbelasting na gecontroleerde infecties in het laboratorium.

RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om microbiële kolonisatie en infectie in caenorhabditis elegans darmen te visualiseren

Het artikel beschrijft de optimalisatie van de acquisitieparameters van fluorescentiemicroscopie om het axonale transport van endogene gelabelde ladingen met een resolutie van één neuron in een levende nematode te visualiseren.

Optimalisatie van visualisatie van axonaal transport van endogene lading door fluorescentiemicroscopie in levende Caenorhabditis elegans

Hier geven we instructies voor het effectief gebruik van SegElegans, een deep learning-systeem dat we hebben ontwikkeld voor de geautomatiseerde segmentatie van individuele wormen in breedveldmicroscopiebeelden, voor later gebruik in beeldanalysesoftware zoals ImageJ. We bieden manieren om het systeem zowel online als offline te gebruiken.

Geautomatiseerde analyse van C. elegans fluorescentiebeelden met behulp van SegElegans

Een CRISPR/Cas9 microinjectieworkflow voor endogene fluorescerende tagging in de Caenorhabditis elegans kiemlijn om homozygote knock-in-lijnen te verkrijgen voor in vivo eiwitlokalisatieanalyse.

CRISPR/Cas9-gemedieerde endogene fluorescerende tagging van kiemlijnspecifieke genen in Caenorhabditis elegans

Leer eiwitkerntranslocatie onder warmtestress volgen met GFP-fusie-eiwitten en DAPI-kleuring in Caenorhabditis elegans. Deze snelle methode maakt gelijktijdige observatie van kernkleuring en subcellulaire lokalisatie mogelijk.

Opsporen van Eiwit Subcellular Localisatie door Green fluorescentie eiwit Tagging en 4, 6-Diamidino-2-phenylindole vlekken in Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal

Opsporen van Eiwit Subcellular Localisatie door Green fluorescentie eiwit Tagging en 4', 6-Diamidino-2-phenylindole vlekken in Caenorhabditis elegans

Meer video's verkennen