Opsporen van Eiwit Subcellular Localisatie door Green fluorescentie eiwit Tagging en 4', 6-Diamidino-2-phenylindole vlekken in Caenorhabditis elegans
30 juli 2018
Dit protocol laat zien hoe een eiwit nucleaire translocatie onder hittestress bijhouden met behulp van een groene fluorescentie proteïne (GFP) fusieproteïne als merkstof en 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kleuring. De DAPI kleuring protocol is snel en behoudt de GFP en eiwit subcellular localisatie-signalen.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van C.elegans, zoals celbiologie. Het grote voordeel van deze techniek is dat het snel en efficiënt is om signalen van nucleaire kleuring, GFP en veranderingen in subcellulaire lokalisatie gelijktijdig te verkrijgen. Om te beginnen, genereer een extrachromosomale array uitlijning met een translationeel construct van doelgenen.
Alternatief, verkrijg dergelijke lijnen van het Caenorhabditis Genetic Center, dat een openbare bron is voor C.elegans onderzoek. Of, van een eerder gepubliceerd onderzoekslaboratorium. Na het blootstellen van wormen aan gammastraling om de extrachromosomale lijnen in het genoom te integreren, selecteer de stabiel geëxprimeerde lijnen zodat elk dier een markereiwit zoals een GFP of roller tot expressie brengt.
Om mutaties die tijdens de straling zijn gegenereerd te verwijderen, kruis de lijnen ten minste twee keer uit. Gebruik de resulterende transgene lijn om veranderingen in eiwitexpressiepatronen onder stress te detecteren. Vervolgens, na het voorbereiden van NGM wormplaten volgens het tekstprotocol, streken een OP50-klon en cultiveer de bacteriën in vloeibare LB-bouillon een nacht lang.
Zaai de NGM-platen met vloeibare OP50-cultuur en incubeer de platen een nacht in een incubator van 37 graden Celsius om een bacteriemat als voedselbron voor de wormen te laten groeien. Koel de platen af bij kamertemperatuur gedurende minimaal 30 minuten voor gebruik. Laat de transgene lijn groeien bij 20 graden Celsius zonder honger, gedurende minimaal twee generaties vóór de hittestresstest.
Kies acht tot tien jonge, drachtige volwassenen naar een nieuwe wormplaat. Laat ze dan eieren leggen gedurende ongeveer drie tot vijf uur, en verwijder alle volwassenen van de platen. Om de wormen te synchroniseren, laat de eieren uitkomen en laat de larven ongeveer 48 uur groeien tot de vierde larvale, of L4-fase.
Die kunnen worden geïdentificeerd aan de vulva, die een halve maan structuur is. Vervolgens stress de wormen door de platen met de L4-larven bij 35 graden Celsius gedurende twee tot vijf uur te incuberen. Bevat een thermometer in een incubator om de temperatuur nauwkeurig te meten.
Pipetteer 10 microliter M9 op het midden van een glazen plaatje. Neem vervolgens hitte-geschokte wormen en breng ze over in de druppel buffer. Als alternatief, gebruik M9 om de wormen van de plaat te wassen.
Centrifugeer vervolgens het monster bij 1000 keer de zwaartekracht bij kamertemperatuur gedurende één minuut. Gooi de supernatant weg, voeg dan de wormen toe aan het glazen plaatje. Onder een dissectief microscoop, gebruik een zacht weefsel om eventuele overtollige vloeistof af te tappen.
Vervolgens, terwijl u nog steeds onder de microscoop bent, voegt u 10 microliter 95% alcohol toe aan de wormen en blijf ze observeren. Direct nadat de ethanol droogt, herhaalt u het toevoegen van ethanol nog twee keer. Het is cruciaal voor het proces van het verdampen van ethanol van de dieren onder de dissectiefmicroscoop.
Zodra het ethanol van de dieren komt, gaat u onmiddellijk naar de volgende stap. Voeg 10 microliter DAPI toe aan de wormen. Breng onmiddellijk een dekglas aan en verzegel de plaat met transparante nagellakgel.
Laat het nagellak ongeveer 10 minuten stollen, bekijk de dieren vervolgens onder een fluorescentiemicroscoop. Gebruik M9 om de hitte-geschokte plaat af te wassen en centrifugeer het monster bij 1000 keer de zwaartekracht bij kamertemperatuur gedurende één minuut. Gooi de supernatant weg en gebruik één milliliter gedistilleerd water om het pellet te wassen.
Na het verwijderen van de supernatant, voegt u 400 microliter 30% aceton toe en incubeert u het monster gedurende 15 minuten. Centrifugeer vervolgens de buis bij 1000 keer de zwaartekracht bij kamertemperatuur gedurende één minuut. Na het weggooien van de supernatant, gebruikt u 500 microliter gedistilleerd water om de dieren twee keer te wassen.
Voeg 200 microliter DAPI toe aan het pellet, of vier keer de hoeveelheid van het totale wormenvolume aan de buis, en incubeer het monster gedurende 15 minuten. Centrifugeer het monster en gooi de supernatant weg. Gebruik vervolgens 500 microliter gedistilleerd water om het pellet twee keer te wassen voordat u het monteert en afbeeldt zoals eerder.
Om beeldvorming uit te voeren, zet u de UV-lichtbron en de fluorescentiemicroscoop aan. Zet vervolgens de computer aan die op de microscoop is aangesloten. Laad de plaat op de fluorescentiemicroscoop.
Gebruik een 10X objectieflens om de wormen te lokaliseren. Verhoog vervolgens de vergrotingskracht tot 400X en concentreer u op het specimen. Open vervolgens de software die bij de microscoop is geleverd.
Klik op Acquisitie, klik vervolgens op Camera en selecteer de camera die op de microscoop is aangesloten. Onder dezelfde Acquisitie, klikt u op Multidimensionele Acquisitie. Dit opent een nieuw Multidimensioneel Acquisitie navigatie venster.
Klik op de multi kanaal knop en alle beschikbare kanalen verschijnen. Kies blauw, groen en DIC om het specimen te observeren. In het Multidimensioneel Acquisitie navigatie venster, laat de blauwe DAPI, groene GFP en grijze DIC kanalen aan, en klik met de rechtermuisknop op andere kanalen, zoals rood Rhodamine en wit Brightfield, om ze te sluiten.
Om de belichtingstijd voor elk kanaal te meten, klikt u met de linkermuisknop op het blauwe DAPI-kanaal om het te selecteren en klikt u op meten"om een live beeld te maken met een geautomatiseerde belichtingstijd. Aan de linkerkant van het live beeldvenster kunt u de belichtingstijd handmatig aanpassen indien gewenst, en klik vervolgens op OK. Stel de belichtingstijden voor de GFP- en DIC-kanalen op een vergelijkbare manier in. In het Multidimensioneel Acquisitie navigatie venster, klikt u op Start"om automatisch drie beelden te verzamelen onder de drie verschillende kanalen, in volgorde, met de ingestelde
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol demonstreert hoe de nucleaire translocatie van een eiwit onder hittestress kan worden gevolgd met behulp van een GFP-fusie-eiwit als marker en DAPI-kleuring. De methode is snel en efficiënt, waardoor gelijktijdige observatie van de nucleaire kleuring en veranderingen in de subcellulaire lokalisatie mogelijk is.
Belangrijke componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Celbiologie
- Neurowetenschappen
- Genetica
Achtergrond
- Het begrijpen van de proteinlokalisatie is cruciaal in de celbiologie.
- Hittestress kan de proteintranslocatie en -lokalisatie beïnvloeden.
- GFP-fusieproteïnen zijn waardevolle markers voor het volgen van proteïnen.
- DAPI-kleuring biedt een methode voor het visualiseren van kernen.
Doel van de studie
- Om de nucleaire translocatie van eiwitten onder hittestress te volgen.
- Om GFP te gebruiken als marker voor eiwitlokalisatie.
- Om een snel protocol voor DAPI-kleuring te demonstreren.
Gebruikte methoden
- Generatie van extrachromosomale arrays met translationele constructen.
- Blootstelling van C.elegans aan gammastraling voor integratie.
- Selectie van stabiel tot expressie gebrachte lijnen met markerproteïnen.
- Simultane observatie van nucleaire en subcellulaire lokalisatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle tracking van nucleaire translocatie onder hittestress.
- Efficiënte visualisatie van GFP- en DAPI-kleuring.
- Aantoonde de effectiviteit van het protocol in C. elegans.
- Bood inzichten in de dynamiek van eiwitlokalisatie.
Conclusies
- Het protocol is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van proteïnedynamica.
- Snelle en efficiënte methoden verbeteren het onderzoek in de celbiologie.
- Toekomstige toepassingen kunnen worden uitgebreid naar andere stresscondities.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Dit protocol maakt snelle, antilichaam-vrije tracking mogelijk van veranderingen in de subcellulaire lokalisatie van eiwitten als reactie op stress, wat vroege targetvalidatie in discovery-workflows ondersteunt. Door GFP-tagging te combineren met DAPI-kernkleuring, biedt het kwantitatieve, visuele bevestiging van translocatiegebeurtenissen — zoals nucleaire accumulatie onder hittestress — die kunnen bijdragen aan het mechanistische de-risking van therapeutische hypothesen. De compatibiliteit van de methode met standaard fluorescentiemicroscopen maakt deze toegankelijk voor de voorbereiding van high-throughput screening en gebruik door cross-functionele teams in biofarmaceutische R&D-omgevingen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt directe observatie van stress-geïnduceerde eiwittranslocatie mogelijk, wat bijdraagt aan functionele targetvalidatie en het onderzoek naar signaalpaden.
- Operationele waarde: Elimineert de noodzaak voor antilichamen of radioactieve labels, waardoor de ontwikkeltijd en de kosten van de assay worden verminderd.
- Voorspellende waarde: Bevestigt verschuivingen in de subcellulaire lokalisatie die kunnen wijzen op het werkingsmechanisme of de modulatie van de stressrespons.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Genereert stabiele transgene lijnen die GFP-getagde eiwitten tot expressie brengen voor consistente, reproduceerbare screeningsplatforms.
- Kwantitatieve output: Maakt gelijktijdige meting van het GFP-signaal en nucleaire DAPI-kleuring mogelijk voor co-lokalisatieanalyse.
- Schaalbaarheid: Compatibel met standaard fluorescentiemicroscopie, waardoor aanpassing aan multi-well formaten voor compound-screening mogelijk is.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Volgt de lokalisatie van EXL-1, een eiwit uit de CLIC-familie met zoogdierhomologen (bijv. CLIC4), ter ondersteuning van de translationele beoordeling van targets.
- Mechanistische risicoreductie: Bevestigt nucleaire translocatie bij hittestress maar niet bij oxidatieve stress, wat helpt bij het definiëren van het conditiespecifieke gedrag van het target.
- Preklinische continuïteit: Biedt een herbruikbaar systeem om proteïnedynamiek onder verschillende stresscondities te evalueren voorafgaand aan in vivo validatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van het testen van hypothesen over targets tot de identificatie van leads, in het bijzonder voor stress-responsieve eiwitten. Het ondersteunt vroege go/no-go-beslissingen door de interactie met het target en de subcellulaire dynamiek te valideren voordat screeningcampagnes voor verbindingen worden gestart.
- Discovery Biology: Test therapeutische hypothesen door veranderingen in de eiwitlokalisatie te visualiseren onder gedefinieerde stresscondities.
- Screening: Bereidt gevalideerde celgebaseerde systemen voor op het screenen van verbindingenbibliotheken met ingebouwde lokalisatie-read-outs.
- Analytics: Genereert co-lokalisatiegegevens (GFP/DAPI-overlap) als kwantitatieve output voor het beoordelen van de effecten van verbindingen op eiwittransport.
- Translationeel onderzoek: Koppelt bevindingen uit C. elegans aan zoogdiersystemen via geconserveerde CLIC-eiwitten, ter ondersteuning van target-validatie tussen soorten.
- Enterprise Reuse: Vestigt een modulaire, herbruikbare pipeline voor het volgen van de subcellulaire dynamiek van elk GFP-getagd eiwit onder stress of blootstelling aan verbindingen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door direct visueel bewijs te leveren van proteintranslocatie in live-cell contexten.
- Operationele waarde: Standaardiseert fixatie- en imageringsprotocollen tussen teams, wat de reproduceerbaarheid verbetert en variabiliteit vermindert.
- Strategische waarde: Versnelt de tijdlijnen voor target-validatie, waardoor een snellere portfolio-triage mogelijk wordt en investeringen in vals-positieve targets worden verminderd.
- Impact op het portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang door target-gedrag te bevestigen in ziekterelevante stressmodellen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van C. elegans, het genereren van transgene lijnen en fluorescentiemicroscopie.
- Afhankelijk van toegang tot een fluorescentiemicroscoop met FITC- en DAPI-filtersets en Nomarski-optiek.
- Vereist standaardisatie van de fixatie (ethanol/aceton) en de timing van de kleuring om het GFP-signaal te behouden en een consistente DAPI-nucleuslabeling te waarborgen.
- Aanpassing aan andere modelsystemen kan optimalisatie van de promotorsterkte, tagging-efficiëntie en stressparadigma's vereisen.
- Praktische beperking: Het meest geschikt voor eiwitten met detecteerbare translocatie; kan snelle of kortstondige shuttling-gebeurtenissen mogelijk niet resolveren zonder live imaging.
