Name: Live cel beeldvorming van de TGF-β/Smad3 signalering traject In Vitro en In Vivo met behulp van een Adenovirus verslaggever systeem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Leer live cel beeldvorming van TGF-β/Smad3 signalering met een adenovirus verslaggever systeem. Deze methode maakt real-time tracking van cel signalering mogelijk in vitro en in vivo voor kankeronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door subsidies van de nationale gezondheids- en medische onderzoek Raad (NHMRC) aan H-JZ. TMBW is een ontvanger van een Australia postdoctorale Award van de Australische overheid en de Ann Henderson oplaadbeurt beurs van Australische Rotary gezondheid in partner met Rotary van hoorn en Dine voor een kuur.

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Universiteit van Melbourne dier ethisch comité.
Opmerking: De volgorde, de bouw en de generatie protocol voor de adenovirale vectoren pAd-CMV-Td-Tom, pAd-CMV-GFP en pAd-CAGA12- Luc/Td-Tom geweest eerder beschreven11,,12, 13. Alle vectoren zijn commercieel verkrijgbaar.
1. virus Titer bepaling met 50% weefselkweek infectieuze dosis (TCID50)
<ol><li>Bereiden 1 x 106 HEK293A cellen in 10 mL DMEM + 10% FBS media.</li>
	<li>Beënt 100 µL celsuspensie in elk putje van de plaat van een 96-Wells flat-onderste cel cultuur.</li>
	<li>Bereiden 1 mL van een verdunning 1:100 virus voorraad in volledige medium. Voeg 11 µL van verdunde virus aan elk putje van kolom 1.</li>
	<li>Seriële 10-fold verdunningen rechtstreeks in de 96 goed plaat uitvoeren door het mengen van 11 µL van verdunde virus met 100 µL celsuspensie tot een uiteindelijke verdunning van 1 x1012 is bereikt. Hoewel cellen niet-aanhanger zijn in dit stadium, het aantal cellen overgedragen tussen putten constant blijft.</li>
	<li>Pipetteer 11 µL van elke verdunning in elke kolom die beginnen met de hoogste verdunning van 104. Pipetteer tips vervangen door elke verdunning te beperken van cross-over van virale deeltjes.</li>
	<li>Voeg 11 µL van virus-vrij volledige media naar kolom 12 als een negatieve controle.</li>
	<li>Incubeer plaat voor 7-10 dagen bij 37 ° C met 10% CO2.</li>
	<li>Met behulp van een Microscoop, score het aantal putten in elke kolom tekenen van cytopathogeen of cytotoxische effecten weer te geven. Overwegen een goed positief als enig teken van infectie aanwezig is.</li>
	<li>Berekenen van de Fractie van positieve putten voor elke verdunning met behulp van de riet- en Muench (1938) statistische methode14.</li>
	<li>Bereken met behulp van de proportionele afstand (PD): (A-50)/(A-B), waar is de reactie van het percentage groter dan of gelijk aan 50% van de A en B is de reactie van het percentage lager dan 50%.</li>
	<li>Bereken met behulp van TCID50 : 10X-PD, waarbij X staat voor de verdunning een groter is dan 50% antwoord te geven.</li>
	<li>Virale titer van het gebruik van het volgende berekenen: 0.69 / (0.011 x TCID50) PFU/mL</li>
</ol>2. adenovirus MOI bepaling
<ol><li>Zaad 1.0-1.5 x 105 MDA-MB-231 cellen met 500 μL van DMEM voedingsbodems met 5% FBS in ieder putje van een 12 goed plaat (35% cel confluentie, 6 wells in totaal).</li>
	<li>De volumes van Ad-CMV-Td-Tom voorraad vereist voor 0, 250, 500, 2500 en 5000 MOI met volgende formule berekenen: MOI = (volume [μL] x PFU/μl) / aantal cellen. Voor Ad-CMV-Td-Tom met een titer van 1 x 1010 (PFU/mL), de hoeveelheid virusinfectie zijn vereist MOIs 0, 3,75, 7.5, 37,5 en 75 μL respectievelijk.</li>
	<li>De cellen met de berekende volumes van Ad-CMV-Td-Tom in punt 2.2 besmetten door direct pipetteren virale voorraad in de putjes met homogenisatie van het mengsel.</li>
	<li>Plaats de plaat in de incubator bij 37 ° C met 10% CO2 gedurende 24 uur.</li>
	<li>Verwijder het medium van de putten en onmiddellijk het herstellen van de cellen met de 500 μL van 10% formaline gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Gecombineerd de formaline uit putten en putjes met 500 μL van PBS keer wassen.</li>
	<li>Vlek de celkern met 500 μL van Hoechst oplossing voor 5 min.</li>
	<li>Verwijder de oplossing Hoechst en was de putjes met 500 μL van PBS 3 keer.</li>
	<li>Beeld de Td-tomaat-eiwit en celkern signaal met behulp van 200 X vergroting op een fluorescentie Microscoop. Excite Td-tomaat eiwit op 554 nm en het Hoechst kleurstof op 352 nm.</li>
	<li>Analyseren van beelden met behulp van ImageJ om te bepalen van de MOI voor 100% van het Td-tomaat15 vereistwerken.</li>
</ol>3. dual-adenovirus signaaltransductie in levende enkele cellen
<ol><li>Zaad 1.0-1.5 x 105 MDA-MB-231 cellen met 500 μL van DMEM voedingsbodems met 5% FBS in ieder putje van een 12 goed plaat (35% cel confluentie, 2 putten in totaal).</li>
	<li>Cellen met 75 μL van Ad-CMV-GFP infecteren (titer = 5 x 109 PFU/mL) en 7,5 μL van Ad-CAGA12-Td-Tom (titer = 5 x 1010 PFU/mL) te verkrijgen van een 2.500 MOI, die 100% infectie positiviteit kan bereiken.</li>
	<li>Cellen met of zonder 0,25 μL van TGF-β per putje (10 mg/mL in voorraad, 5 ng/μL als de uiteindelijke concentratie) behandelen onmiddellijk na infectie van het adenovirus.</li>
	<li>Plaats de plaat in de incubator bij 37 ° C met 10% CO2 gedurende 24 uur.</li>
	<li>Afbeelding levende cellen met fluorescentie fasecontrastmicroscoop. GFP prikkelen op 470 nm en Td-tomaat eiwit op 554 nm.</li>
	<li>Los van de cellen en vlek celkern zoals beschreven in stappen 1.6 - 1.9.</li>
	<li>Beeld de Td-tomaat-eiwit en Hoechst vlek met behulp van een fluorescentie Microscoop. Excite de Hoechst kleurstof op 352 nm.</li>
	<li>Met behulp van ImageJ, berekenen dat de percentage van GFP en Td-tomaat positieve cellen15.</li>
</ol>4. levende eencellige signalering wondheling in Assay
<ol><li>Zaad 4-5 x 105 MDA-MB-231 cellen met 1 mL van DMEM voedingsbodems met 5% FBS in ieder putje van een 6 goed plaat (50% cel confluentie, 2 putten in totaal).</li>
	<li>De cellen met 22.5 μL van Ad-CAGA12-Td-Tom infecteren (titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500).</li>
	<li>Plaats de plaat in de incubator bij 37 ° C met 10% CO2 gedurende 24 uur.</li>
	<li>Krabben twee snijdende lijnen op de cellaag van elk putje met behulp van een P200 pipette uiteinde.</li>
	<li>Verwijder de oude media uit putten en vervang met 2 mL vers 5% FBS media met of zonder 0,5 μL van TGF-β per putje (10 mg/mL in voorraad, 5 ng/μL als eindconcentratie).</li>
	<li>Plaats de plaat in de incubator bij 37 ° C met 10% CO2 voor 5 min en nemen van beelden van geselecteerde wond gebieden met behulp van 100 X vergroting op een fasecontrastmicroscoop.</li>
	<li>Plaats de plaat in de incubator bij 37 ° C met 10% CO2 gedurende 24 uur.</li>
	<li>Neem beelden van de wond sluiting op dezelfde gebieden als vóór.</li>
	<li>Hersteld de cellen vlek celkern, zoals beschreven in stappen 1.6 - 1.9 en visualiseren van de Td-tomaat signaal in de omgeving van de wond en de niet-wond gebied met behulp van 200 X vergroting op een fluorescentie Microscoop.</li>
	<li>Het percentage positieve cellen van de Td-tomaat in de wond en de niet-wond gebied met behulp van ImageJ software15te kwantificeren.</li>
</ol>5. in Vitro Luciferase Assay
<ol><li>Bereid een celsuspensie van 3-5 x 104 MDA-MB-231 cellen in 1 mL van DMEM media met 5% FBS.</li>
	<li>Infecteren celsuspensie met 2,5 μL van Ad-CAGA12- Luc (titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500).</li>
	<li>Zaad de geïnfecteerde cellen een 96 plaat goed op 3.000 cellen/100 µL per putje.</li>
	<li>Plaats de plaat in de incubator bij 37 ° C met 10% CO2 gedurende 24 uur.</li>
	<li>Verwijder oude media uit putten en vervang door 100 µL van vers 5% FBS media met of zonder 0.1 μL van TGF-β per putje (1 mg/mL op voorraad, 1 ng/μL als de uiteindelijke concentratie) en in de aanwezigheid of afwezigheid van 0,17 μL van TGF-β-remmer per putje (7 mg/mL op voorraad 12 ng/μL als eindconcentratie) (een roman TGF-β ligand trap proteïne, Chen et al., ongepubliceerd werk).</li>
	<li>Plaats de plaat in de incubator bij 37 ° C met 10% CO2 gedurende 24 uur.</li>
	<li>Het luciferase assay systeem substraat ontdooien en bereiden 1 x cel cultuur lysis reagens in dubbel gedestilleerd water (DDW).</li>
	<li>Media verwijderen van de 96-wells en lyse putjes met 50 μl van 1 x cel cultuur lysis buffer op ijs een roteerschudapparaat met zachte agitatie voor 30 min.</li>
	<li>30 μL van lysate van elk putje overboeken naar een ondoorzichtige luciferase plaat en laat de plaat opwarmen tot kamertemperatuur.</li>
	<li>Maak op de luminometer-software, een nieuw protocol. Selecteer voor 1 injector met metingen vóór en na de injectie. Metingen vóór injectie vastgesteldop 1 s voor zowel de vertraging bij de meting en de Tijd van de integratie. Voor na injectie meting, zet het Geïnjecteerde Volume aan 40 µL met een vertraging bij de meting van 1 s na injectie en 5 s Integratie tijd. Bevestig de instellingen door te kiezen voor OK.</li>
	<li>Plaats de buis injector in DDW en klik op de knop van de Injector 1 onder de Prime instellingen de injector buis vóór gebruik schoon te maken. Vervolgens verwijdert de injector buis van de plaats in de lucht gevolgd door twee verdere priemgetallen voor injector 1 voor het spoelen van alle oplossing uit buis en DDW. Plaats de buis injector in Firefly substraat en opnieuw Prime tweemaal te bereiden van het substraat.</li>
	<li>Plaats de ondoorzichtige luciferase plaat met de monsters in de luminometer en selecteer Opties op de software. Markeer de putten van belang en klik op toepassen. Druk op Start om te meten luciferase signaal.</li>
	<li>Als metingen voltooid zijn, verwijderen en de plaat met water spoelen. Herstel eventuele resterende substraat naar de injector buis door het plaatsen van de buis in de lucht en Prime injector 1 terug in firefly substraat buis. Plaats de buis injector in DDW en het uitvoeren van twee verdere priemgetallen om de buis van de injector van eventuele resterende substraat schoon te maken.</li>
</ol>6. cel voorbereiding Live signalering Imaging In Vivo
<ol><li>48 uur vóór de tumor implantatie, seed 2-3 x 106 MDA-MB-231 cellen in 175 cm2 flacons (10 kolven in totaal). Cultuur van cellen in 20 mL van DMEM media met 5% FBS bij 37 ° C, 10% CO2.</li>
	<li>24 h later toevoegen 300 μL van Ad-CAGA12- Luc (titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500) in elke kolf. Houd cellen cultuur voor een andere 24 h.</li>
	<li>Op de dag van implantatie, verwijderen van de oude media en wassen van het adenovirus besmette cellen eenmaal met 20 mL PBS, pH 7.4. Voeg toe 2 mL trypsine-EDTA 0,05% in de kolf en schud de kolf lichtjes zodat trypsine ter dekking van alle het oppervlak van de kolf. Plaats de kolf in de incubator 37 ° C, 10% CO2 voor 3 min.</li>
	<li>Doven de trypsine door toevoeging van 8 mL FBS-bevattende DMEM media in kolven. Breng alle cel schorsingen in een fles van de reagens.</li>
	<li>Tellen van het nummer van de cel met behulp van een hemocytometer en overbrengen van 4.8 x 107 cellen in twee 50 ml centrifuge buizen.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen bij 400 x g gedurende 5 min op RT verwijderen trypsine en resuspendeer de cellen in 720 mL verse FBS-DMEM media.</li>
	<li>Breng de schorsingen van de cel in een tube steriele 5 mL en voeg 160 l Matrigel (10% totale matrigel schorsing).</li>
	<li>Houden cellen op ijs totdat de implantatie.</li>
</ol>7. Orthotopic implantatie
<ol><li>Weeg 12 SCID muizen en willekeurig toewijzen van muizen in de behandelde en controlegroepen (6 muizen/group).</li>
	<li>Voer de inplanting in een steriele bio-kast te handhaven van een steriele omgeving. Anaesthetize de muis 2,5-4,5% Isofluraan met een debiet van de zuurstof van 1 L/min. plaats de muis op een warmte pad en afzien van een druppel smeren oog zalf op beide ogen om hoornvlies schade te voorkomen. Fix de muis naar de warmte pad in een liggende positie, terwijl behoud van anesthesie door het plaatsen van de snuit in een neus kegel met de Isofluraan verbonden.</li>
	<li>Bevestig het succes van anesthesie door het gebrek aan reactie tot teen snuifje. Isofluraan reduceren tot een onderhoudsdosis van 1,5 tot 2,5% met 1 L/min zuurstof voor de herinnering van implantatie.</li>
	<li>Reinig de huid van de vierde tepel aan beide zijden aan de middellijn met behulp van het wattenstaafje gedoopt in 80% ethanol.</li>
	<li>Vinden van de 4th borstklier vet pad door middel van palpatie en knijp het vet pad om verder het weefsel bloot te stellen.</li>
	<li>Meng de celsuspensie goed door pipetteren omhoog en omlaag. Zachtjes 50 µL van het mengsel van de cel gecombineerd in een 27G insuline spuit en injecteren in de borstklier vet pad aan weerszijden van de muis.</li>
	<li>Bevestig een succesvolle injectie door gevoel voor de zwelling van het vet pad. Laat het vet pad zachtjes en plaatst u de muisaanwijzer weer in de kooi.</li>
	<li>Laat de kooien op de warmte pad voor minstens 30 min om de muizen te winnen van bewustzijn en plaatst u vervolgens de kooien terug in het bedrijf ruimte voor 3 dagen.</li>
</ol>8. IVIS Imaging
<ol><li>De Living Image software niet openen.</li>
	<li>Initialiseer het systeem van de IVIS door te klikken op de knop Initialiseren IVIS systeem op het Configuratiescherm. Wacht tot de temperatuur teken groen.</li>
	<li>Selecteer de verlichtend Imaging modus op het bedieningspaneel.</li>
	<li>Inschakelen van Isofluraan anesthesie aan de kamer en de IVIS systeem.</li>
	<li>Anaesthetize de muizen met behulp van 2,5-4,5% Isofluraan met 1 L/min zuurstof. Eenmaal verdoofde, set Isofluraan op 1,5 tot 2,5% voor onderhoud. 150 mg/kg lichaamsgewicht van D-luciferine injecteren met muizen door intraperitoneaal (i.p.) injectie.</li>
	<li>Onmiddellijk overdracht muizen in het IVIS systeem, plaats ze op de temperatuurgevoelig imaging platform en plaatsen hun neus in de neus.</li>
	<li>Klik op de knop Reeks instellingen op het control panel en selecteer Medium weggooien.</li>
	<li>De imaging belichtingstijd als volgt instellen: 10 s, 20 s, 30 s, 60 s 120 s. Start ongeveer 3 min na de injectie luciferine imaging en blijven beeld tot het signaal begint te dalen (normaal gesproken duurt dit ongeveer 20 min).</li>
	<li>De muizen uit de IVIS verwijderen met behoud van Isofluraan verdoving via een neus kegel en behandelen van de muizen met 50 µL PBS of 50 µL TGF-β signalering remmer (50 μg/tumor) via intra-tumor injectie.</li>
	<li>Zet de muizen terug in de kooi en laat ze op de warmte pad voor minstens 30 min. Plaats dan de kooi terug in de kamer van het bedrijf.</li>
	<li>IVIS imaging procedure zoals beschreven hierboven de dag na de behandeling herhalen.</li>
</ol>9. de gegevensanalyse
<ol><li>Open bestanden opgeslagen in Levende beeld software.</li>
	<li>Vinden van de beeldinformatie met weergave | Beeldinformatie.</li>
	<li>Selecteer foto's genomen op een gelijkaardig punt van de tijd met de dezelfde blootstellingstijd. Foto's laden als een groep.</li>
	<li>Uncheck de afzonderlijke doos in het Image aanpassen aan het normaliseren van de intensiteit.</li>
	<li>Foton -kiezen voor het analyseren van de intensiteit. Kwantificeren van de intensiteit van het signaal door de Regio van belang (ROI) knop in ROI Tools.</li>
	<li>Sleep de ROI cirkel naar de regio met de bioluminescente signaal en klikt u op de knop van de maatregel om te verwerven van de signaalsterkte.</li>
</ol>

<ol><li>Massague, J., Like, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+receptors+for+type+beta+transforming+growth+factor.+Ligand+binding+and+affinity+labeling+in+human+and+rodent+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines.</a> The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).</li>
<li>Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+import+function+of+Smad2+is+masked+by+SARA+and+unmasked+by+TGFbeta-dependent+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The nuclear import function of Smad2 is masked by SARA and unmasked by TGFbeta-dependent phosphorylation.</a> Nature Cell Biology. 2, 559-562 (2000).</li>
<li>Massague, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22992590">TGFbeta signaling in context.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 13, 616-630 (2012).</li>
<li>Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16322555">Smad transcription factors.</a> Genes Development. 19, 2783-2810 (2005).</li>
<li>Blobe, G. C., Schiemann, W. P., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+transforming+growth+factor+beta+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Role of transforming growth factor beta in human disease.</a> The New England journal of medicine. , 1350-1358 (2000).</li>
<li>Zhu, H. J., Burgess, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+transforming+growth+factor-beta+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell+biology+research+communications+%3A+MCBRC%22%5BJournal%5D)">Regulation of transforming growth factor-beta signaling.</a> Molecular cell biology research communications : MCBRC. 4, 321-330 (2001).</li>
<li>Massagué, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3512574/">TGFβ in Cancer.</a> Cell. 134, 215-230 (2008).</li>
<li>Luwor, R. B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25744371">Single live cell TGF-beta signaling imaging: breast cancer cell motility and migration is driven by sub-populations of cells with dynamic TGF-beta-Smad3 activity.</a> Molecular cancer. 14, 50(2015).</li>
<li>Clarke, D. C., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+quantitative+nature+of+TGF-beta%2FSmad+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biol.ogy%22%5BJournal%5D)">Decoding the quantitative nature of TGF-beta/Smad signaling.</a> Trends in Cell Biol.ogy. 18, 430-442 (2008).</li>
<li>Zhao, R., Li, N., Xu, J., Li, W., Fang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+single-molecule+study+of+TGF-beta%2FSmad+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+et+Biophysica+Sinica+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative single-molecule study of TGF-beta/Smad signaling.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50, 51-59 (2017).</li>
<li>Luwor, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+reagents+for+improved+in+vitro+and+in+vivo+examination+of+TGF-beta+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Growth+factors%22%5BJournal%5D)">New reagents for improved in vitro and in vivo examination of TGF-beta signalling.</a> Growth factors. 29, 211-218 (2011).</li>
<li>Dennler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+binding+of+Smad3+and+Smad4+to+critical+TGF+beta-inducible+elements+in+the+promoter+of+human+plasminogen+activator+inhibitor-type+1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene.</a> EMBO J. 17, 3091-3100 (1998).</li>
<li>Luwor, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Stat3+and+Smad7+to+restore+TGF-beta+cytostatic+regulation+of+tumor+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Targeting Stat3 and Smad7 to restore TGF-beta cytostatic regulation of tumor cells in vitro and in vivo.</a> Oncogene. 32, 2433-2441 (2013).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/aje/article-abstract/27/3/493/99616">A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints.</a> American Journal of Epidemiology. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Dennler, S., Prunier, C., Ferrand, N., Gauthier, J. M., Atfi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Jun+inhibits+transforming+growth+factor+beta-mediated+transcription+by+repressing+Smad3+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">c-Jun inhibits transforming growth factor beta-mediated transcription by repressing Smad3 transcriptional activity.</a> The Journal of biological chemistry. 275, 28858-28865 (2000).</li>
<li>Fink, S. P., Mikkola, D., Willson, J. K., Markowitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-induced+nuclear+localization+of+Smad2+and+Smad3+in+Smad4+null+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-induced nuclear localization of Smad2 and Smad3 in Smad4 null cancer cell lines.</a> Oncogene. 22, 1317-1323 (2003).</li>
<li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49, 103-115 (2008).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, 3173-3178 (2010).</li>
<li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+adenovirus+and+its+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Update on adenovirus and its vectors.</a> Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).</li>
<li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery%3A+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Diseases%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes & Diseases. 4, 43-63 (2017).</li>
<li>Wang, I. I., Huang, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+technology+for+gene+manipulation+and+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Adenovirus technology for gene manipulation and functional studies.</a> Drug Discovery Today. 5, 10-16 (2000).</li>
<li>Kochanek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+adenoviral+vector%3A+Replacement+of+all+viral+coding+sequences+with+28+kb+of+DNA+independently+expressing+both+full-length+dystrophin+and+beta-galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and beta-galactosidase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 5731-5736 (1996).</li>
<li>Wang, Q., Finer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-generation+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Second-generation adenovirus vectors.</a> Nature Medicine. 2, 714-716 (1996).</li>
<li>Durham, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+replication-defective+adenoviral+recombinants+in+dissociated+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Toxicity of replication-defective adenoviral recombinants in dissociated cultures of nervous tissue.</a> Experimental Neurology. 140, 14-20 (1996).</li>
<li>MacKenzie, K. L., Hackett, N. R., Crystal, R. G., Moore, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+vector-mediated+gene+transfer+to+primitive+human+hematopoietic+progenitor+cells%3A+assessment+of+transduction+and+toxicity+in+long-term+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture.</a> Blood. 96, 100-108 (2000).</li>
<li>Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+wild-type+contamination+in+a+recombinant+adenoviral+preparation+by+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Detection of wild-type contamination in a recombinant adenoviral preparation by PCR.</a> Biotechniques. 18, 444-447 (1995).</li>
<li>Choi, Y., Chang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+vaccine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Vaccine+Research%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for vaccine applications.</a> Clinical and Experimental Vaccine Research. 2, 97-105 (2013).</li>
<li>de Cassan, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+requirement+for+potent+adjuvants+to+enhance+the+immunogenicity+and+protective+efficacy+of+protein+vaccines+can+be+overcome+by+prior+immunization+with+a+recombinant+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus.</a> Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).</li>
<li>Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+recombinant+adenovirus+vectors+with+modified+fibers+for+altering+viral+tropism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism.</a> Journal of Virology. 70, 6839-6846 (1996).</li>
<li>Wickham, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+in+vitro+and+in+vivo+gene+transfer+by+adenovirus+vectors+containing+chimeric+fiber+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins.</a> Journal of Virology. 71, 8221-8229 (1997).</li>
<li>Smith, F., Jacoby, D., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Restorative+neurology+and+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Virus vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Restorative neurology and neuroscience. 8, 21-34 (1995).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+receptor+NR4A1+promotes+breast+cancer+invasion+and+metastasis+by+activating+TGF-beta+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling.</a> Nature communications. 5, 3388(2014).</li>
</ol>

De auteurs melden geen belangenconflicten.

Hebben we een techniek om te voorzien in real-time beeldvorming van TGF-β/Smad3 signalering in één levende cellen. Met deze nieuwe methode hebben we eerder een subpopulatie van cellen geïdentificeerd met dynamische TGF-β/Smad3 transcriptionele activiteit die werd geassocieerd met verbeterde invasie en migratie8. Deze methode verbetert op traditionele testen voor TGF-β signalering, zoals westelijke vlekken van Smad3 fosforylatie en TGF-β gerichte genexpressie, door het vastleggen van de heterogenit...

Transformeren groeifactor β (TGF-β) is een essentiële cytokine betrokken in de menselijke ontwikkeling die signalen via een heterodimeric complex bestaande uit type II en type ik receptoren1. Binding met de type II receptor resultaten bij de werving en fosforylering van type ik receptor, dat op zijn beurt kinaseenzym stroomafwaarts Smad2/3 eiwitten2,3. Deze Smad2/3 eiwitten binden aan Smad4, vormen een complex dat translocates in de kern en regelt gene transcriptie4geactiveerd. Homeostatische voorwaarden TGF-β/Smad is signalering strak geregeld is; echter in vele ziekten, het signalering traject is gedereguleerd en vaak leiden tot progressie van de ziekte5,6,7overexpressie. Recente studies hebben aangetoond dat cellulaire reactie op TGF-β heterogeen is en subpopulaties van TGF-β/Smad actieve cellen verantwoordelijk voor biologische functie in een tijd-afhankelijke manier8,9 zijn. Gemeenschappelijke cellulaire analyse van TGF-β/Smad signalering impliceert het gebruik van vaste eindpunt tests die bieden slechts een momentopname van cellulaire activiteit en de gemiddelde TGF-β/Smad effect10vaak te kwantificeren. Deze methoden, maar kunnen niet nauwkeurig vertegenwoordigen de moleculaire gedrag van TGF-β/Smad signalering in de fysiologische staat tijdens de progressie van de ziekte. Beeld-gebaseerde analyse van levende cellen vangen de dynamiek van cellulaire en biologische processen met beide een ruimtelijke en temporele begrip.
Ons doel was het ontwikkelen van een gevoelige methode hoge gegevensdoorvoer voor levende cellen beeldvorming van TGF-β/Smad signalering gebruikmaken van adenovirus gebaseerde reagentia. Hier, besmet we de menselijke borst kanker cellijn MDA-MB-231 met een uiting van de Smad3 CAGA motief bindende volgorde en een luciferase (Luc) of Td-tomaat (Td-Tom) verslaggever gene adenovirus. Adenovirale verslaggever systemen bieden een snelle en goedkope methode voor het plasmide inleiding is die in een 100% besmettingstarief in kanker cellijnen resulteren kan. Adenovirale verslaggever systemen hebben ook met succes toegepast op cellijnen die moeilijk te transfect met conventionele plasmide11. In dit protocol beschrijven we een reproduceerbare en noninvasive proces om levende cellen beeldvorming van de signalering traject van TGFβ/Smad zowel in vivo en in vitro.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>1881024</td><td>Opwarmen in 37 &deg;C waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>Foetaal Rund Serum</td><td>Scientifix Life</td><td>FBS500-S</td><td>Voor gebruik verhit</td></tr><tr><td>Recombinant Human TGF-&beta;1</td><td>PEPROTECH</td><td>100-21</td><td>Aliquot in DDW om de eindconcentratie van 10 mg/mL te maken</td></tr><tr><td>Hoechst-33258</td><td>Tocris Bioscience</td><td>5117</td><td>Verdunnen in PBS om de eindconcentratie van 1 &mu;L/mL te maken</td></tr><tr><td>Luciferase Reporter Assay Kit</td><td>Promega</td><td>197897</td><td>5x verdunnen in PBS voor gebruik</td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Promega</td><td>9100-002</td><td></td></tr><tr><td>Phase contrast fluorescence microscopy</td><td>OLYMPUS</td><td>IX50</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>VivoGl Luciferin</td><td>Promega</td><td>P1041</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina III In Vivo Imaging System</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td>Verdunnen tot 0.05% (1x) in PBS</td></tr><tr><td>Cell Culture Lysis 5x Reagent</td><td>Promega</td><td>E153A</td><td>Verdunnen tot 1x in DDW</td></tr><tr><td>10% Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5554-4L</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293A</td><td>ThermoFisher</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>CRM-HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>PRKDC-SCID</td><td>Animal Resources Centre</td><td>SCIDF6</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Zoetis</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Chem-supply</td><td>EA043-10L-P</td><td></td></tr><tr><td>Refresh Night Time</td><td>Allergan</td><td>1750D</td><td>Smerende oogzalf</td></tr><tr><td>Oplossing</td><td></td><td></td><td>Samenstelling</td></tr><tr><td>Fosfaat-Buffered Saline (PBS)</td><td></td><td></td><td>NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M)</td></tr><tr><td>FBS-DMEM&nbsp;</td><td></td><td></td><td>5% verhit foetaal rund serum; 10 &mu;g/mL penicilline; 100 &mu;g/mL streptomycine</td></tr></tbody></table>

live cel beeldvorming van de tgf-β/smad3 signalering traject in vitro en in vivo met behulp van een adenovirus verslaggever systeem

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Transformeren groeifactor β (TGF-β) signalering reguleert vele belangrijke functies die nodig zijn voor cellulaire homeostase en wordt vaak gevonden in veel ziekten, waaronder kanker overexpressie. TGF-β is sterk betrokken bij de metastase tijdens late stadium kanker progressie, het activeren van een subset van migratiestromen en invasieve tumorcellen. Huidige methoden voor signalering traject analyse richten op eindpunt modellen, die vaak proberen te meten van signalering post-hoc van de biologische evenement en komen niet overeen met de progressieve aard van de ziekte. Hier tonen we een nieuwe adenovirus verslaggever systeem specifiek voor de TGF-β/Smad3 signalering traject dat transcriptionele activering in levende cellen kan detecteren. Gebruik makend van een verslaggever van Ad-CAGA12-Td-Tom , kunnen we een 100% besmettingsgraad van MDA-MB-231 cellen binnen 24u in vitro. Het gebruik van een fluorescerende verslaggever zorgt voor de beeldvorming van levende enkele cellen in real time met rechtstreekse identificatie van transcriptionally actieve cellen. Stimulatie van geïnfecteerde cellen met TGF-β wordt alleen een subset van cellen die transcriptionally actief en betrokken in de specifieke biologische functies zijn weergegeven. Deze aanpak zorgt voor hoge specificiteit en de gevoeligheid op het niveau van een eencellige om inzicht in de biologische functies gerelateerde TGF-β signalering in vitro. Smad3, transcriptionele activiteit kan ook worden gerapporteerd in vivo in real-time door de toepassing van een Ad-CAGA12- Luc verslaggever. Ad-CAGA12- Luc kan worden gemeten op dezelfde wijze als traditionele stabiel transfected luciferase cellijnen. Smad3 transcriptionele activiteit van cellen geïmplanteerd in vivo kan worden geanalyseerd door middel van conventionele IVIS imaging en gecontroleerd live tijdens de progressie van de tumor, unieke inzicht bijbrengen in de dynamiek van de signalering TGF-β-pathway. Ons protocol beschrijft een voordelige verslaggever leveringssysteem toestaan voor snelle high-throughput beeldvorming van levende cellen signaling pathways zowel in vitro als in vivo. Deze methode kan worden uitgebreid tot een scala aan beeld gebaseerde testen en presenteert als een gevoelige en reproduceerbare aanpak voor zowel de fundamentele biologie en de therapeutische ontwikkeling.

Levende eencellige beeldvorming in vitro
Om te nauwkeurig beoordelen de activering van TGF-β/Smad signalering in afzonderlijke cellen met behulp van adenovirus gebaseerd reagentia, is het belangrijk om eerst de optimale multipliciteit van infectie (MOI) voor elke regel van de cel. De optimale MOI wordt bepaald wanneer 100% van de cellen positief voor adenovirale infectie met geen huidige cytopathogeen of cytotoxische effec...

Hier presenteren we een protocol voor levende cellen beeldvorming van de signalering activiteit TGF-β/Smad3 met behulp van een adenovirus verslaggever systeem. Dit systeem transcriptionele activiteit in real time worden bijgehouden en kunnen worden toegepast op beide afzonderlijke cellen in vitro en in levende diermodellen.

Live cel beeldvorming van de TGF-β/Smad3 signalering traject In Vitro en In Vivo met behulp van een Adenovirus verslaggever systeem

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van celsignalering te beantwoorden door celsignalering non-invasief in realtime te volgen. Het grote voordeel van deze techniek is dat adenovirussystemen een snelle en eenvoudige methode bieden voor celsignaleringdetectie die een infectiepercentage van 100% kan bereiken in kankercellijnen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot therapeutische ontwikkeling voor kanker en kunnen worden uitgebreid naar andere signaalroutes.Hoewel deze methode inzicht kan geven in borstkankermodellen, kan deze ook worden toegepast op andere kankertypen, zoals hersen-, bot- en longkanker. Op de dag van adenovirusinfectie, zaai de putjes van een 12-putsplaat met ongeveer 1,25 keer 10 tot de vijfde MDA-MB-231 cellen in 500 microliter medium voor een confluency van 35% Infecteer cellen in alle putjes met 75 microliter adenovirus-CMV-GFP en 7,5 microliter adenovirus CAGA12-Td-Tomato om een 2, 500 MOI te verkrijgen die 100%infectiepositiviteit kan bereiken. Voeg vervolgens TGF-beta toe aan de behandelingsputten onmiddellijk na adenovirusinfectie.Incubeer bij 37 graden Celsius met 10% koolstofdioxide gedurende 24 uur. De volgende dag, beeld levende cellen af met een fasecontrastfluorescentiemicroscoop. Bepaal vervolgens, na fixatie van de cellen en kleuring van de kernen met Hoechst-kleurstof, de TD-Tomato-eiwit en Hoechst-kleuring met behulp van een fluorescentiemicroscoop.Na beeldvorming van alle putjes, bereken het percentage GFP- en Td-Tomato-positieve cellen met behulp van ImageJ. Voor de wondgenezingstest, begin met het zaaien van de putjes van een zes-putsplaat met ongeveer 4,5 keer 10 tot de vijfde MDA-MB-231 cellen in één milliliter medium voor 50%confluency op de dag van infectie. Infecteer de cellen met 22,5 microliter adenovirus CAGA12-Td-Tomato, plaats vervolgens de plaat in de incubator bij 37 graden Celsius met 10%koolstofdioxide gedurende 24 uur.Na 24 uur, gebruik een P200 pipettepunt om twee gekruiste lijnen op de cellaag van elke put te krabben. Verwijder het medium uit de putjes en behandel met TGF-beta zoals eerder getoond, plaats vervolgens de plaat in de incubator bij 37 graden Celsius met 10%koolstofdioxide gedurende vijf minuten. Neem na vijf minuten incubatie beelden van geselecteerde wondgebieden met 100X vergroting op een fasecontrastmicroscoop voordat u de plaat terug in de incubator plaatst.24 uur later, neem fasecontrastbeelden van dezelfde gebieden om wondsluiting te beoordelen. Bepaal na fixatie van de cellen en kleuring van de kernen, het Td-Tomato-signaal in het wondgebied en niet-wondgebied met 200X vergroting op een fluorescentiemicroscoop. 48 uur voor tumorimplantatie, zaai ongeveer 2,5 keer 10 tot de zesde MDA-MB-231 cellen in 10 175-vierkante-centimeterkolven.Na 24 uur in cultuur, voeg 300 microliter adenovirus CAGA12-luciferase toe aan elke kolf voordat u de cellen nog eens 24 uur in de incubator teruggeeft. Op de dag van implantatie, verwijder het oude medium en was de adenovirus-geïnfecteerde cellen eenmaal met 20 milliliter PBS. Voeg twee milliliter van 0,05%Trypsin-EDTA toe aan de kolf en schud de kolf lichtjes om Trypsin alle oppervlakken van de kolf te laten bedekken.Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende drie minuten, en doof de Trypsin uit door acht milliliter DMEM-medium met FBS toe te voegen aan de kolven. Breng alle celsuspensies over in een glazen reagensfles. Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer.Transfer vervolgens 4,8 keer 10 tot de zeven cellen in 250-milliliter centrifugeerbuizen en centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 400 keer g bij kamertemperatuur. Na de centrifugatie, suspendeer de cellen opnieuw in 720 microliter vers medium en breng de suspensie over naar een vijf-milliliter buisje. Voeg vervolgens medium met 10%Matrigel toe om de celsuspensie te verdunnen tot drie keer 10 tot de zesde cellen per 50 microliter.Transfer de celsuspensie naar een steriele vijf-milliliter buis en bewaar op ijs tot implantatie. Weeg 12 SCID-muizen en verdeel de muizen willekeurig gelijk verdeeld over controle- en behandelingsgroepen. Na het verdoven van de muis, breng een druppel smerende oogzalf aan op beide ogen om hoornvliesbeschadiging te voorkomen, bevestig vervolgens de muis op een warmtepad in een steriele bio-cabinet en houd de anesthesie in stand door de snuit in een neuskoker te plaatsen die is verbonden met de isofluraankleefgas.Bevestig het succes van de anesthesie door het ontbreken van reactie op een teenprik. Verlaag de isofluraankleefgas tot een onderhoudsdosis voor de rest van de implantatie. Gebruik vervolgens een wattenstaafje gedrenkt in 80%ethanol om de huid van elke vierde tepel tot de middenlijn schoon te maken.Zoek het vierde borstvetzwamkussen door palpatie en knijp het vetkussen samen om het weefsel verder bloot te leggen, meng vervolgens de celsuspensie door op en neer te pipetten. Aanzuig voorzichtig 50 microliter celmengsel in een insulinesyringe van 27 gauge en injecteer in het borstvetzwamkussen. Bevestig een succesvolle injectie en laat het vetkussen voorzichtig los.Plaats de muis terug in de thuiskooi. Nadat de muizen bij bewustzijn zijn gekomen, breng de kooi terug naar de wachtkamer gedurende drie dagen voordat u verder gaat met IVIS-beeldvorming. Levende MDA-MB-231 cellen vertoonden verschillende niveaus van Td-Tomato expressie ondanks 100%infectie zoals aangetoond door GFP expressie, wat duidt op heterogene activering van TGF-beta-afhankelijke Smad3 transcriptie tussen cellen.Analyse van vaste cellen toonde opnieuw 100%GFP expressie terwijl slechts ongeveer 26%van de cellen detecteerbare TGF

live-cell-imaging-tgf-smad3-signaling-pathway-vitro-vivo-using-an

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Met de groeiende belangstelling voor stamceltherapieën, moleculaire imaging technieken zijn ideaal voor de bewaking stamceltransplantatie gedrag na transplantatie. Luciferase reporter genen hebben ingeschakeld non-invasieve, repetitieve evaluatie van de overleving van de cel, de locatie en de proliferatie in vivo. Deze video zal laten zien hoe je hESC proliferatie track in een levende muis.

In vitro en in vivo bioluminescente reportergen-beeldvorming van menselijke embryonale stamcellen

In deze video gebruiken we een adenovirus het dragen van de Cre-recombinase-gen tot de primaire muis embryonale fibroblasten het dragen van een floxed Rac1 allel infecteren.

Adenovirus-gemedieerde Genetische Verwijdering van signaalmoleculen in gekweekte primaire muis embryonale fibroblasten

Hierin beschrijven we de methoden om te bouwen, visualiseren en kwantificeren van de bioluminescente reacties van zowel vuurvlieg en Renilla luciferase enzymen uitgedrukt in gemetastaseerde borstkanker cellen tijdens hun groei en...

In vivo Dual ondergrond Bioluminescent Imaging

Een test om kwantitatief te meten Transforming Growth Factor (TGF)-β-geïnduceerde invasie in 3-dimensionale collageen gels is beschreven. Deze test maakt gebruik van de MCF10A reeks van cel-lijnen, die verschillende stadia van de ontwikkeling van borstkanker te vertegenwoordigen. Deze methode kan worden vastgesteld om te worden gebruikt met andere cellijnen en kan worden gebruikt om andere potentiële activatoren of inhibitoren van een invasie te onderzoeken.

Sferoïde Assay voor TGF-β-geïnduceerde Invasion Measure

Source: Chen, H. et. al. Live Cell Imaging of the TGF-β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the preparation of luciferase-expressing breast cancer cells using recombinant adenoviruses for in vivo imaging.

Preparation of Reporter-Expressing Cancer Cells for In Vivo Imaging

We beschrijven een methode voor depletie-reddingsexperimenten die de cellulaire integriteit en eiwithomeostase behoudt. Adenofectie maakt functionele analyses van eiwitten mogelijk binnen biologische processen die afhankelijk zijn van fijn afgesteld actine-gebaseerde dynamica, zoals mitotische celdeling en myogenese, op het niveau van een enkele cel.

Adenofection: Een methode voor het bestuderen van de rol van de Molecular Begeleiders in Cellular Morfodynamica door uitputting-Rescue Experimenten

Live volgen van individuele WT retinale voorlopers in verschillende genetische achtergronden maakt voor de beoordeling van de bijdrage van de cel niet-zelfstandige signalering tijdens de neurogenese. Hier, een combinatie van gen knockdown, chimeer generatie via embryo transplantatie en in vivo time-lapse confocale beeldvorming werd gebruikt voor dit doel.

In vivo beeldvorming van transgene Gene Expression Individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryo&#39;s to Cell Nonautonomous Invloeden Studie

Een protocol voor in vitro inductie van endotheel-mesenchymale overgang (EndMT), die nuttig is voor het onderzoeken van cellulaire signaalroutes die betrokken zijn bij EndMT, wordt beschreven. In dit experimenteel model wordt EndMT veroorzaakt door behandeling met TGF-β in MS-1 endotheliale cellen.

Moleculaire analyse van endotheel-mesenchymale overgang geïnduceerd door transformeren groeifactor-β signalering

Morfologische veranderingen optreden in immuun responsieve fibroblast cellen na activering en het bevorderen van veranderingen in cellulaire werving. Gebruik makend van 2-Photon Imaging in combinatie met een genetisch gemanipuleerde fibroblast-specifieke proteïne 1 (FSP1)-CRE; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) muis lijn en groene fluorescently gelabeld lipopolysaccharide-FITC, we kunnen zeer specifieke opname van lipopolysaccharide in dermale fibroblasten en morfologische veranderingen in...

In vivo tweekleurige 2-Fobe beeldvorming van genetisch gelabelde reporter cellen in de huid

We beschrijven een systematische workflow om TGF-β signalering en TGF-β-geïnduceerde EMT te onderzoeken door de eiwit- en genexpressie te bestuderen die betrokken zijn bij deze signaleringsroute. De methoden omvatten western blotting, een luciferase reporter assay, qPCR, en immunofluorescentie vlekken.

TGF-β Signalering en TGF-β-geïnduceerde Epitheel-naar-mesenchymale overgang bij borstkanker en normale cellen bestuderen

Hier stellen we een protocol op om tegelijkertijd meerdere SMAD-complexen te visualiseren en te analyseren met behulp van proximity ligation assay (PLA) in endotheelcellen die worden blootgesteld aan pathologische en fysiologische vloeistofafschuifstressomstandigheden.

Visualisatie en kwantificering van TGFβ/BMP/SMAD-signalering onder verschillende vloeistofafschuifstressomstandigheden met behulp van proximity-ligation-assay

Leer live cel beeldvorming van TGF-β/Smad3 signalering met een adenovirus verslaggever systeem. Deze methode maakt real-time tracking van cel signalering mogelijk in vitro en in vivo voor kankeronderzoek.

Live cel beeldvorming van de TGF-β/Smad3 signalering traject In Vitro en In Vivo met behulp van een Adenovirus verslaggever systeem (Video) | JoVE Journal

Live cel beeldvorming van de TGF-β/Smad3 signalering traject In Vitro en In Vivo met behulp van een Adenovirus verslaggever systeem

Meer video's verkennen