Name: Imaging FITC-dextran als verslaggever voor gereglementeerde exocytose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Leer live-cell imaging van gereguleerde exocytose met FITC-dextran als reporter in mastcellen. Deze methode maakt onderscheid tussen exocytosemodi met minimale celperturbatie en is toepasbaar op andere secretorische celtypen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr. U. Ashery voor de gulle gift van cDNA. Wij danken Drs. G. massa, L. Mittleman, M. Shaharbani en Y.Zilberstein van de Sackler mobiele & Molecular Imaging Center voor hun onschatbare hulp met microscopie. Dit werk werd gesteund door de Verenigde Staten-Israël binationale Science Foundation (grant 2013263 R. Sagi-Eisenberg, I. Hammel en S.J.Galli) en het verlenen van 933/15 vanaf de Israël Science Foundation, opgericht door de Israël-Academie voor Wetenschappen (te R.Sagi-Eisenberg ) en NIH grants U19 AI 104209 en R01 AR067145 (naar S.J. Galli).

1. voorbereiding
<ol><li>Bereiding van de voedingsbodems RBL<ol>
<li>Mix 500 mL van lage glucose Dulbecco bewerkt Eagle's medium (DMEM) met 56 mL foetale runderserum (FBS), 5,5 mL penicilline-streptomycine-nystatine oplossing, 5,5 mL van L-Glutamine 200 mM oplossing. Dit resulteert in lage glucose DMEM aangevuld met 10% FBS, 100 µg/mL streptomycine, 100 eenheden/mL penicilline, 12 eenheden/mL nystatine en 2 mM L-glutamine.</li>
		<li>De media filteren met behulp van een top-vacuüm-filter van 0,22 µm poriegrootte en winkel bij 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Onderhoud van RBL cellen.<ol>
<li>RBL cellen groeien tot een maximale confluentie van 90% in een 10 cm schotel. Als de celkweek gezond is, moeten de cellen hebben de vorm van een spindel met occasionele uitsteeksels.</li>
		<li>Voor cel splitsen, de cellen van de schotel te loskoppelen door aspirating van de media en 2 mL trypsine/EDTA oplossing B. Incubate vervangen voor 5-10 minuten in een bevochtigde sfeer van 5% CO2 bij 37 ° C.</li>
		<li>Zodra de cellen hebben losgemaakt, de trypsine te neutraliseren door toevoeging van 2 mL van voedingsbodems, met behulp van een precisiepipet, en splitsen van cellen in een 1:2-1:10 verhouding.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiding van 20 x Tyrode de buffer<ol>
<li>Een voorraad 20 x 54 mM KCl oplossing, 20 mM MgCl22,74 M NaCl en 8 mM NaH2PO4 in dubbel gedestilleerd water (DDW) voor te bereiden. Meng goed en bewaren bij 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. cultuur van RBL cellen voor levende cellen microscopie
<ol><li>Bereiding van FITC-dextran oplossing.<ol>
<li>Meng 1 mg FITC-dextran poeder (150 K) per 1 mL voedingsbodems (zie stap 1.1.1). Voor een volledige chambered dekglaasje, bereiden 3 mL.</li>
		<li>Met behulp van een celluloseacetaat spuit filter eenheid met 0,22 µm poriegrootte, filteren de opgeloste FITC-dextran.</li>
		<li>Voeg muis IgE tot een concentratie van 1 µg/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zaaien van RBL cellen voor imaging<ol>
<li>Eergisteren beeldvorming, gecombineerd de media van de cultuur-schotel en 2 mL trypsine/EDTA oplossing B. Incubate vervangen voor 5-10 minuten in een bevochtigde sfeer van 5% CO2 bij 37 ° C. Zodra de cellen hebben losgemaakt, neutraliseren de trypsine door toevoeging van 2 mL van voedingsbodems.</li>
		<li>Graaf RBL cellen met behulp van een hemocytometer en het volume aanpassen met voedingsbodems om een concentratie van de cel van 7,5 x 105/mL.</li>
		<li>Voeg toe 10 µL celsuspensie aan een chambered dekglaasje vooraf gevuld met verse FITC-dextran aangevuld voedingsbodems (dit resulteert in het zaaien van 7,5 x 103 cellen in een kamer).</li>
		<li>Groeien RBL cellen overnachting in een humified sfeer van 5% CO2 bij 37 ° C. De cellen moeten in een sub confluente niveau blijven om ervoor te zorgen dat de cellen worden gescheiden en dat het gemakkelijk te identificeren van elke cel afzonderlijk onder de Microscoop.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De transfectie van RBL cellen - optioneel.<ol>
<li>Zie transfectie protocol voor RBL cellen in Azouz et al. voor imaging exocytic gebeurtenissen in combinatie met andere fluorescently tagged eiwitten, 67
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. levende cel microscopie van exocytose
<ol><li>Bereiding van de oplossingen:<ol>
<li>Een definitieve Tyrode bufferoplossing bereid door verdunning van de stockoplossing in DDW in een 1:20 verdunnings- en supplement met 20 mM Hepes pH 7, 1,8 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA en 5,6 mM glucose.</li>
		<li>Vers bereiden 20 x secretagogue reagens in de Tyrode van buffer [1 µg/mL dinitrophenyl geconjugeerd met menselijk serum albumine (DNP-heeft (Ag)) in ons geval, voor een concentratie van 50 ng/mL 1 x].</li>
		<li>Bereid een 400 mM ammoniumchlorideoplossing door ontbinding poeder in Tyrode de buffer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiding van de cellen.<ol>
<li>De chambered dekglaasje 3 keer wassen door aspirating van de media van de kamer en het navullen dankzij 300 µL van Tyrode de buffer, voorverwarmde tot 37 ° C. Tot slot, het vullen van de zaal met 300 µL van Tyrode de buffer, voorverwarmde tot 37 ° C.</li>
		<li>Plaats de chambered dekglaasje in van de Microscoop incubator kamer. Zorg ervoor dat de kamer stabiel is.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Instellen van de Microscoop<ol>
<li>Om te kiezen een gebied van belang om bij te houden, zet de fluorescerende lichtbron (traditioneel een kwik-lamp) en kies de juiste fluorescentie-filter (het filter voor groene fluorophores voor het bekijken van de FITC-dextran kiezen). Zodra de regio van belang in beeld is en in het midden van het gezichtsveld is, schakelt u de lichtbron ter voorkoming van foto-bleken en toxiciteit. Opmerking: Sommige van de FITC-dextran opgenomen in de cellen kan handhaven fluorescentie. Dit is omdat de FITC-dextran kan ook worden gesorteerd naar niet-lysosomale compartimenten zoals Endosomen.</li>
		<li>Inschakelen van de juiste verlichting voor excitatie van FITC. Als met behulp van een laser gebaseerde Microscoop, schakelt de 488 nm laser. Emissies moet worden verzameld rond 500-550 nm (FITC emissie pieken bij 510-520 nm).</li>
		<li>Wanneer u een confocal microscoop, open het gaatje tot het maximum. Dit zal toestaan met behulp van lagere laser macht om te voorkomen dat bleken en toxiciteit en zorgt voor de inname van exocytose gebeurtenissen uit alle vliegtuigen van de cel.</li>
		<li>Kalibreren van het tijdsinterval tussen afbeelding acquisities.<ol>
<li>Verschillende cellen kunnen variëren in hun kinetiek van gereglementeerde exocytose68. Voor specifieke beeldvorming van samengestelde exocytose raden wij een tijdsinterval van minstens 5 seconden. Nochtans, als een vuistregel, als u wilt toestaan voor snelle beeldvorming, zorg ervoor dat het tijdstip van de verwerving van een enkel frame snel is.</li>
			<li>Bij het gebruik van een laser-scanner confocal microscoop, de richting van de scan instellen met bi-directionele, niet toestaan voor gemiddeld en resolutie ingesteld op 512 x 512 (aanbevolen; de laatste twee bepalingen zal ook helpen om bleken en toxiciteit te minimaliseren).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beeldvorming van exocytose.<ol>
<li>De cellen van de afbeelding voor de gewenste duur, afhankelijk van het type cel of secretagogue. RBL cellen geactiveerd met IgE/Ag, plaatsvinden de meeste exocytic gebeurtenissen binnen 15-20 min van activering.</li>
		<li>Voor activering van de cellen, Voeg 16 µL van de 20 x secretagogue oplossing aan de kamer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bevestiging van FITC-dextran aanwezigheid in de cellen.<ol>
<li>Om te bevestigen de aanwezigheid en de lokalisatie van FITC-dextran naar de SGs, Voeg 16 µL van ammoniumchlorideoplossing (wees niet worden verplaatst van de zaal in om niet te verliezen richten) aan de kamer zachtjes (Hierdoor wordt een eindconcentratie van 20 mM). Dit zal leiden tot alkalization van de SGs en dequenching van FITC fluorescentie, die binnen enkele seconden voordoen zich.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belang

Hier beschrijven we hoe traceren de fluorescentie van FITC-dextran in SGs geladen kan worden gebruikt om het speciaal samengestelde exocytose van gebeurtenissen. Dit werd bereikt door de Microscoop te verwerven van een afbeelding elke 15 seconden, aldus voor te zorgen dat alleen langdurige gebeurtenissen na verloop van tijd worden vastgelegd en dus met uitzondering van korte gebeurtenissen die zou overeenkomen met volledige exocytose of kus-en-run exocytose. Om vast te stellen van de methode, toonden we dat knockdown van...

Gereglementeerde exocytose is het primaire mechanisme waarmee gemakkelijk gemaakt lading wordt vrijgelaten uit een secretoire cel in antwoord op een specifieke trigger. De lading is pre gevormd en afgezonderd in secretoire blaasjes, waarin het is opgeslagen totdat een trigger Relais het signaal voor de vrijlating van de SGs inhoud. Verschillende soorten signalen kunnen resulteren in verschillende modi van gereglementeerde exocytose of verschillende modi van gereglementeerde exocytose tegelijkertijd kunnen optreden. Drie belangrijkste wijzen van gereglementeerde exocytose zijn bekend: volledige exocytose, waarbij volledige fusie van een enkele secretoire submodule met het plasmamembraan; kus-en-run exocytose, waarbij voorbijgaande fusie voor de secretoire granule met het plasma-membraan gevolgd door haar recycling; en samengestelde exocytose, die wordt gekenmerkt door homotypic fusie van verschillende SGs prior (dat wil zeggen, multigranular exocytose) of na elkaar (dat wil zeggen, sequentiële exocytose) tot fusie met het plasmamembraan1. Samengestelde exocytose wordt beschouwd als de meest uitgebreide modus van lading release2, omdat het zorgt voor de snelle afscheiding van vracht, met inbegrip van die van SGs die zich bevinden distale uit het plasma-membraan. Samengestelde exocytose is gedocumenteerd in beide exocrine en endocriene cellen3,4,5,6,7,8,9, evenals in immuuncellen. Samengestelde exocytose kunt immune cellen, zoals eosinofielen10,11,12 en neutrofielen13, de snelle en robuuste versie van bemiddelaars die nodig zijn voor het doden van invasie ziekteverwekkers zoals bacteriën of parasieten. Mastcellen (MCs) implementeren samengestelde exocytose voor de efficiënte introductie van vooraf opgeslagen inflammatoire mediatoren tijdens aangeboren immuunresponsen, anafylaxie en andere allergische reacties14,15,16 , 17. aangezien de verschillende modi van exocytose gelijktijdig18,19 treedt, is het een uitdaging onderscheid maken tussen hen in real-time of identificeren van hun respectieve fusion machineries, vandaar ophelderen geworden hun onderliggende mechanismen.
Hier presenteren we een methode, gebaseerd op de levende cel beeldvorming van cel geladen FITC-dextran, waarmee real-time tracking van exocytic evenementen en onderscheid te maken tussen hun verschillende modi. Onze werkwijze zorgt voor met name de exclusieve opvolging van samengestelde exocytose.
FITC-dextran is een geconjugeerde van de pH-gevoelige fluorophore FITC met de glucan polysaccharide dextran. Fluorescently geëtiketteerde dextrans hebben aangetoond dat de cel invoeren door micropinocytosis20,21 en macropinocytosis22,23. Naarmate endocytotische compartimenten in de lysosomen rijpen, is gebleken dat de FITC-dextran in het lysosoom met geen zichtbare aantasting accumuleert. Echter, aangezien FITC een zeer pH-gevoelige fluorophore24 is, en het lysosoom lumen zuur is, Lest FITC-dextran fluorescentie bij het bereiken van het lysosoom24. Dus, tot vaststelling van dextrans als lysosoom lading, samen met de gevoeligheid van de pH van FITC gericht, hebben de basis gelegd voor het gebruik van FITC-dextran in studies van lysosoom exocytose25,26,27 , 28 , 29.
In verschillende celtypen, met inbegrip van MCs, neutrofielen eosinofielen, cytotoxische T-cellen, melanosomes en anderen, de SGs lysosomale functies weergegeven en zijn geclassificeerd als lysosoom-gerelateerde organellen (LROs) of secretoire lysosomen30,31 . Aangezien LROs een zure luminal pH hebben, kan FITC-dextran worden gebruikt om te visualiseren van hun exocytose, als gevolg van hogere pH die is gekoppeld aan de exteriorization van de LROs. Inderdaad, FITC-dextran is gebruikt om te controleren van exocytose in MCs18,32,33. Bij deze methode is FITC-dextran toegevoegd aan de celcultuur, in beslag genomen door de cellen door Pinocytose en gesorteerd in de SGs. Aangezien er in de lysosomen, is FITC fluorescentie uitgeblust in de SGs wanneer zij binnen de cel. Echter bij SG fusion met het plasmamembraan en daaruit voortvloeiende blootstelling aan de externe omgeving herwint de FITC-dextran zijn fluorescentie als de SG pH stijgt, waardoor het eenvoudig volgen van exocytic evenementen door levende cel microscopie. Hier, we deze methode zodat unieke tracking van samengestelde exocytose aangepast.
Twee andere methoden hebben eerder is gebruikt voor het bijhouden van samengestelde exocytose. Elektronenmicroscopie was de eerste methode te karakteriseren exocytic structuren die het vóórkomen van de verschillende vervoerswijzen exocytose voorgesteld. Met name gaf opmerkingen van "secretoire tunnels" in de alvleesklier acinaire cellen34 en MCs35,36,,37 aanleiding tot de hypothese van samengestelde exocytose. Maar terwijl de hoge resolutie van elektronenmicroscopie bevoegd is om te onthullen gesmolten blaasjes, kan de dynamiek van hun fusie niet bijhouden en dus geen definiëren of ze overeenkomen met SG fusion tijdens samengestelde exocytose of fusie van heroverde korrels na hun endocytose. Dit obstakel overwonnen in andere methoden die exocytose in levende cellen, zoals patch klem metingen van het plasmamembraan capaciteit11,13,38,39 of amperometry meten kunnen 40 van de media. Echter patch klemmen vereist een speciale set-up en mogelijk niet geschikt voor alle celtypes. Amperometry metingen kunnen bijhouden van exocytose alleen als de lading in zeer dicht bij de elektrode wordt vrijgegeven. Dus, met behulp van levende cellen imaging biedt een voordeel ten opzichte van deze methoden, zoals het niet alleen voor real-time tracking van exocytose staat, maar het biedt ook snelle en eenvoudige overname van gegevens uit de hele cel.
Het volgen van FITC-dextran door levende cel microscopie biedt ook enkele voordelen naar andere levende cel imaging gebaseerde methoden. Bijvoorbeeld, is een veel gebruikte methode totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) van cellen met een fluorescente sonde SG geladen of uiting van een fluorescente proteïne-gelabeld SG vracht of membraan eiwit26,41, 42 , 43. de kracht van deze methode ligt in zijn vermogen om uitsluitend gebeurtenissen die zich voordoen vlak bij het plasma-membraan (hierna te noemen voetafdruk), te controleren dus exocytic gebeurtenissen. Dit is echter ook het nadeel van deze methode omdat slechts in het geval van de cel-fractie dat grenst aan het dekglaasje en dicht bij de lens Microscoop kan worden beeld44. Of dergelijke voetafdrukken inderdaad het gehele celmembraan oppervlak vertegenwoordigen is nog betwistbaar45,46,47. In dit verband kunt met behulp van een pH-gevoelige kleurstof zoals FITC-dextran en een standaard fluorescentie Microscoop of een confocal microscoop met een open pinhole beeldvorming van de hele cel, dus het vastleggen van de totale exocytic-gebeurtenissen die in die cel plaatsvinden.
Extra pH-gevoelige verslaggevers die worden gebruikt voor het bestuderen van gereglementeerde exocytose door hele cel beeldbewerkings- of TIRFM bevatten SG vracht of SG membraan eiwit gesmolten tot phlourin, een pH-gevoelige GFP variant. Voorbeelden zijn NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin, en synapto-phluorin48,49,50,51,52. Terwijl uitdrukking van deze sondes de endogene samenstelling van de SGs nauwer vertegenwoordigen kan, het impliceert transfectie van de cellen, en kan dus minder geschikt voor cellen die moeilijk te transfect. Daarom, wanneer bestuderen van cellen die zijn moeilijk te transfect of onder experimentele omstandigheden waarvoor meerdere genomic manipulaties, is het gebruik van een stof die eenvoudig kan worden aangevuld in het kweekmedium cel, zoals FITC-dextran, voordelig . FITC-dextran biedt ook een voordeel ten opzichte van acridine oranje (AO), een andere pH-gevoelige kleurstof die is gebruikt voor het volgen van exocytose door levende cel microscopie53,54,55,56 , 57 , 58. AO is gebleken voor het opwekken van fotolyse van blaasjes dat resultaat in valse flitsen, die niet met werkelijke secretie overeen komen27verwerkt. Daarentegen weerspiegelt de FITC-dextran beter secretie evenementen, waarschijnlijk als gevolg van zijn lage foto-geïnduceerde productie van reactieve zuurstof27.
Met name is een alternatieve benadering voor het bestuderen van exocytose door het bijhouden van de instroom van een kleurstof, uit het externe medium in de SG via de porie van fusie dat wordt tijdens dit proces wordt geopend. In dit geval wordt de kleurstof toegevoegd aan het externe medium naast de secretoire trigger. Vervolgens, wanneer de fusie porie opent, de kleurstof diffundeert in de SG59,60. Een duidelijk voordeel van deze methode is dat het biedt ook de mogelijkheid om het inschatten van de fusion porie maat, door het gebruik van kleurstoffen van variabele grootte. Bijvoorbeeld, kunnen dextrans met verschillende molecuulgewicht (MW), geconjugeerd met verschillende fluorophores, worden gebruikt als extracellulaire kleurstoffen waarbij de maximale grootte van Dextraan die de SG doordringen kan zou overeenkomen met de grootte van de fusion porie59, 61 , 62 , 63 , 64. Bovendien deze aanpak vereist niet het gebruik van een pH-gevoelige sonde. Een aanzienlijk nadeel is echter dat de signaal / ruisverhouding zeer laag is, is aangezien een grote hoeveelheid kleurstof aanwezig in de media tijdens de overname van beelden, wat resulteert in hoge achtergrond.
Globaal, het gebruik van FITC-dextran als een marker voor exocytose overwint verschillende nadelen in reeds gerapporteerde methoden, zoals de signaal-ruis verhouding, toxiciteit, dynamische tracering en complexiteit.
Hier beschrijven we het gebruik van FITC-dextran samengestelde exocytose in de RBL - 2H 3 mestcel lijn (hierna te noemen RBL, voornamelijk opgericht door Eccleston et al. volgen 65 en verder door Barsumian et al. gekloond 66), in reactie op immunoglobuline (IgE) / antigeen (Ag) activering.

<table><tbody><tr><td>DMEM low glucose</td><td>Biological Inductries</td><td>01-050-1A</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Gibco</td><td>12657</td><td></td></tr><tr><td>Pen-strep-nystatin-oplossing</td><td>Biological Inductries</td><td>03-032-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM oplossing&nbsp;</td><td>Biological Inductries</td><td>03-020-1A</td><td></td></tr><tr><td>FITC dextran 150K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46946-500MG-F</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA-oplossing B</td><td>Biological Inductries</td><td>03-052-1A</td><td>Verwarm in 37 &deg;C waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>Top-vacuumfilter van 0,22 &micro;m poriëngrootte&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430769-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Cellulose acetaat spuitfilterunit, 0,22 &micro;m poriëngrootte</td><td>Sartorius</td><td>16534K</td><td></td></tr><tr><td>Kammerdekselglas&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Corning weefselkweekbekers</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>Rundvlees serum albumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Anti-DNP monoklonaal IgE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8406</td><td></td></tr><tr><td>DNP-HSA (Ag)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6661&nbsp;</td><td>Vermijd direct licht</td></tr><tr><td>Hepes buffer 1M, pH 7.4</td><td>Biological Inductries</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>MERK</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>BDH Laboratories</td><td>284515V</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium chloride</td><td>MERK</td><td>1145</td><td></td></tr><tr><td>PIPES dipotassium zout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108321-27-3</td><td></td></tr><tr><td>Calcium acetaat hydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114460-21-8</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium acetaat tetrahydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661</td><td></td></tr><tr><td>Kalium glutamaat (L-Glutaminzuur kaliumzout monohydraat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>MERK</td><td>6346</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>MERK</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>MERK</td><td>105833</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>MERK</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator&nbsp;</td><td>BTX</td><td>ECM830</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscoop, Zeiss</td><td>Zeiss</td><td>LSM 5 Pascal, Axiovert 200M</td><td>Gebruikt in Figuur 3. Uitgerust met een elektronische temperatuurgestuurde luchtstroom incubator</td></tr><tr><td>Confocal microscoop, Zeiss</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800, Axio Observer.Z1 /7</td><td>Gebruikt in Figuur 2. Uitgerust met een GaAsP detector en een elektronische temperatuurgestuurde luchtstroom incubator</td></tr><tr><td>Confocal microscoop, Leica</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td>Gebruikt in Figuur 1. Uitgerust met een leica HyD detector en een bovenste incubator (okolab)</td></tr><tr><td>RBL-2H3 cellen</td><td></td><td></td><td>RBL-2H3 cellen werden gekloond in het lab van Reuben P. Siraganian. Zie referentie 67</td></tr></tbody></table>

imaging fitc-dextran als verslaggever voor gereglementeerde exocytose

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Gereglementeerde exocytose is een proces dat door die lading, die is opgeslagen in secretoire korrels (SGs), is uitgebracht in reactie op een secretoire trigger. Gereglementeerde exocytose is van fundamenteel belang voor de intercellulaire communicatie en is een belangrijk mechanisme voor de secretie van neurotransmitters, hormonen, inflammatoire mediatoren en andere verbindingen, door een aantal cellen. Ten minste drie verschillende mechanismen staan bekend om gereglementeerde exocytose: volledige exocytose, waar een enkele SG volledig met het plasma-membraan, kus-en-run exocytose versmelt, waar een enkele SG Transient met het plasma-membraan combineert, en samengestelde exocytose, waar verschillende SGs zekering met elkaar, vóór of na SG fusion met het plasma-membraan. Het soort gereglementeerde exocytose ondernomen door een cel wordt vaak bepaald door het soort secretoire trigger. Echter in veel cellen, kunt één secretoire trigger activeren meerdere modi van gereglementeerde exocytose gelijktijdig. Ondanks hun overvloed en belang in de celtypen en soorten zijn de mechanismen die bepalend zijn voor de verschillende vervoerstakken secretie grotendeels onbekend. Een van de belangrijkste uitdagingen bij het onderzoeken van de verschillende modi van gereglementeerde exocytose, is het moeilijk onderscheid te maken tussen hen, evenals het verkennen van hen afzonderlijk. Hier beschrijven we het gebruik van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-dextran als exocytose verslaggever en levende cel imaging, om te differentiëren tussen de verschillende trajecten van gereglementeerde exocytose, gericht op samengestelde exocytose, op basis van de robuustheid en duur van de exocytic gebeurtenissen.

Figuur 1a vertegenwoordigt schematisch hoe FITC-dextran kan fungeren als een verslaggever voor geregeld exocytose en herhalen van de verschillende modi van exocytic gebeurtenissen. Ten eerste, de cellen worden geïncubeerd met FITC-dextran, die door Pinocytose geïnternaliseerd en gesorteerd naar de SGs. Aangezien de SGs van MCs LROs, hun lage pH dempt de fluorescentie van FITC, hier weergegeven als zwarte korrels (A-C, ik). Wanneer cellen worden getriggerd doo...

Hier detail we een methode om levende cellen beeldvorming van gereglementeerde exocytose. Deze methode maakt gebruik van FITC-dextran, die hoopt zich op in lysosoom-gerelateerde organellen, als verslaggever. Deze eenvoudige methode kan ook onderscheid te maken tussen de verschillende modi van gereglementeerde exocytose in cellen die moeilijk zijn te genetisch manipuleren.

Imaging FITC-dextran als verslaggever voor gereglementeerde exocytose

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het onderzoek naar gereguleerde exocytose, door onderzoekers in staat te stellen onderscheid te maken tussen de verschillende modi van exocytose in de levende cel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het eenvoudig is en minimale verstoring van de cellen vereist. Hoewel deze methode inzicht kan geven in mastcel exocytose, kan het ook worden toegepast op andere secretoire cellen zoals neutrofielen en eosinofielen.Bereid om te beginnen een stockoplossing van 20x Tyrode's buffer volgens het tekstprotocol. Meng vervolgens drie milligram FITC-dextran poeder met drie milliliter kweekmedium. Filter de opgeloste FITC-dextan met een cellulose acetaat spuitfilterunit.Voeg vervolgens muis IgE toe tot een concentratie van één microgram per milliliter. Eén dag voorafgaand aan beeldvorming, zuig media uit een kweekschaal en vervang dit met twee milliliter Trypsine EDTA Oplossing B. Bewaar de schaal vervolgens vijf tot 10 minuten. Zodra de cellen los zijn, voeg dan twee milliliter kweekmedium toe aan de schaal om de Trypsine te neutraliseren.Gebruik vervolgens een hemocytometer om de RBL-cellen te tellen. Pas het volume van de suspensie aan met kweekmedium aan om een concentratie van 750.000 cellen per milliliter te bereiken. Voeg vervolgens 10 microliter van de celsuspensie toe aan een kamerdeksels met vers FITC-dextran aangevuld kweekmedium, en laat de RBL-cellen een nacht groeien.Bereid eerst een uiteindelijke Tyrode's bufferoplossing volgens het tekstprotocol. Bereid vervolgens een 20x secretagogue reagens in de vers bereide buffer. Los ammoniumchloride poeder op in Tyrode's buffer om een 400 millimolar ammoniumchlorideoplossing te maken.Zuig vervolgens het medium uit de kamerdeksels en vervang het met 300 microliter voorverwarmde Tyrode's buffer. Na twee keer herhalen van het wasproces, vul de kamer aan met 300 microliter Tyrode's buffer. Plaats vervolgens de kamerdeksels in de incubatorkamer van een microscoop en zorg ervoor dat de kamer stabiel is.Schakel de fluorescerende lichtbron in en selecteer de juiste fluorescentiefilter. Zodra het gebied van belang in focus is, in het midden van het gezichtsveld, schakel de lichtbron uit. Schakel vervolgens de 488 nanometer laser in met de emissie verzameld rond 500 tot 550 nanometer.Kalibreer vervolgens het tijdsinterval tussen beeldacquisitie. Stel de scanrichting in op bidirectioneel, sta geen gemiddelde toe, open de pin-hole en stel de resolutie in op 512 bij 512. Beeld vervolgens de cellen voor de geschikte duur voor het specifieke celtype of secretagogue.Voeg vervolgens 16 microliter van de secretagogueoplossing toe aan de kamer en blijf filmen. Om de aanwezigheid en lokalisatie van FITC-dextran naar de secretoire korrels te bevestigen, voeg voorzichtig 16 microliter ammoniumchlorideoplossing toe aan de kamer. In dit protocol werd FITC-dextran gebruikt als reporter voor live cel beeldvorming van gereguleerde exocytose.Het beelden van FITC-dextran afgifte maakt het mogelijk om de sequentiële aard van samengestelde exocytose vast te leggen. Na de toevoeging van ammoniumchloride aan het medium, wordt FITC-dextran zichtbaar en is geco-lokaliseerd met de mRFP-gelabelde neuropeptide Y, als secretoire korrel reporter in RBL-cellen. Terwijl u deze procedure probeert, is het belangrijk om toxiciteit voor de cellen tijdens het filmen te minimaliseren door de blootstelling van de cellen aan de laser te minimaliseren.Dit kan worden bereikt door gebruik te maken van de lage laservermogen en korte acquisitietijd. Aangezien samengestelde exocytotische gebeurtenissen langer leven in vergelijking met andere gereguleerde exocytische gebeurtenissen, kunnen we categorisch samengestelde exocytose vastleggen door een lange tijdsinterval tussen acquisities in te stellen.

imaging-fitc-dextran-as-a-reporter-for-regulated-exocytosis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In deze video laten we zien hoe te labelen en te visualiseren enkele synaptische blaasjes exocytose en handel in goudvissen het netvlies bipolaire cellen met behulp van totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie.

Imaging exocytose in het netvlies bipolaire cellen met TIRF Microscopie

This video demonstrates a technique to visualize exocytosis in mast cells. The cells are incubated with FITC-dextran — a fluorescent reporter — which is taken up by cells inside secretory granules (SGs), where the acidic pH quenches its fluorescence. Upon stimulation of granule exocytosis, the medium's higher pH induces reporter fluorescence inside the fused SGs, which is visualized using a fluorescence microscope.

An In Vitro Technique to Visualize Exocytosis of Secretory Granules in Mast Cells

-Polarisatie gebaseerde Total Internal Reflection Fluorescentie microscopie (pTIRFM) maakt real-time detectie van celmembraan dynamiek. Dit artikel beschrijft de uitvoering van pTIRFM voor de studie van membraan remodeling tijdens gereguleerde exocytose. De techniek is generaliseerbaar naar andere celbiologische processen die veranderingen in de membraan vorm direct of indirect te betrekken.

Imaging Plasma Membraan Vervormingen Met pTIRFM

Clathrine-gemedieerde endocytose, een snel en zeer dynamisch proces, internaliseert veel eiwitten, inclusief signaalreceptoren. Het hier beschreven protocol visualiseert direct de kinetiek van individuele endocytische gebeurtenissen. Dit is essentieel om te begrijpen hoe kernleden van de endocytische machinerie met elkaar coördineren en hoe eiwitlading dit proces beïnvloedt.

Visualiseren Clathrine-gemedieerde endocytose van G-proteïne gekoppelde receptoren bij Single-event resolutie via TIRF Microscopie

Dit artikel beschrijft een methode voor het onderzoeken van de dynamica van neurotransmittervesicles in neuroblastoomcellen, met behulp van een synaptobrevin2-pHluorine construct en Total Internal Reflection Fluorescence Microscopie. De strategie die ontwikkeld is voor beeldverwerking en gegevensanalyse wordt ook gerapporteerd.

TIRFM en pH-gevoelige GFP-sondes naar Neurotransmitter Vesicle Dynamics Evalueer in SH-SY5Y Neuroblastoom Cellen: cell imaging en data-analyse

We beschrijven hoe eiwitten en cel-ondoorlatende kleine moleculen in gekweekte zoogdiercellen kunnen worden afgeleverd door middel van een eenvoudig co-incubatieprotocol met een reagens dat ervoor zorgt dat endocytische organellen lekkend worden.

Levering van eiwitten, peptiden of Cell-ondoordringbare Kleine moleculen in levende cellen door incubatie met de endosomolytisch reagens dfTAT

Labelen van de extracellulaire domein van een membraaneiwit met een pH-gevoelige fluorofoor, superecliptic pHluorin (SEP), maakt lokalisatie, expressie en mensenhandel worden bepaald. Imaging september-gemerkte eiwitten met totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) maakt de kwantificering van eiwitniveaus in de perifere ER en plasmamembraan.

Gebruik makend van pHluorin-gelabeld receptoren Monitor subcellulaire lokalisatie en handel

Geautomatiseerde assays met behulp van multi-well microplaten zijn voordelige benaderingen voor het identificeren van pathway-regulatoren door de beoordeling van een groot aantal omstandigheden in één experiment mogelijk te maken. Hier hebben we het gevestigde macropinosoombeeldvormings- en kwantificeringsprotocol aangepast aan een 96-well microplaatformaat en bieden we een uitgebreid overzicht voor automatisering met behulp van een multi-mode plaatlezer.

Geautomatiseerde beeldvorming en analyse voor de kwantificering van fluorescerend gelabelde macropinosomen

In deze studie wordt fluoresceïne-isothiocyanaat-gelabeld (FITC) dextran toegediend aan muizen via orale maagsonde om de intestinale permeabiliteit zowel in vivo als in plasma- en fecale monsters te evalueren. Omdat de darmbarrièrefunctie in veel ziekteprocessen wordt beïnvloed, kan deze directe en kwantitatieve test in verschillende onderzoeksgebieden worden gebruikt.

Beoordeling van de integriteit van de darmbarrière bij muizen met fluoresceïne-isothiocyanaat-gelabeld dextran

De mogelijkheid om de kinetiek van blaasje los maatregel kan hulp bieden inzicht in een aantal van de basisprincipes van neurotransmissie. Hier gebruikten we real-time beeldvorming van blaasjes gelabeld met de rode fluorescente kleurstof FM 4-64 om de snelheid van presynaptische blaasje release in hippocampale neuronale culturen te meten.

Het meten van exocytose in Neuronen FM-ontvanger voor Labeling

Leer live-cell imaging van gereguleerde exocytose met FITC-dextran als reporter in mastcellen. Deze methode maakt onderscheid tussen exocytosemodi met minimale celperturbatie en is toepasbaar op andere secretorische celtypen.

Imaging FITC-dextran als verslaggever voor gereglementeerde exocytose

Meer video's verkennen