Digitale PCR voor het kwantificeren van de circulerende MicroRNAs in acuut myocardinfarct en hart-en vaatziekten
3 juli 2018
Circulerende microRNAs is gebleken belofte als biomarkers voor cardiovasculaire aandoeningen en acuut myocardiaal infarcten. In deze studie beschrijven we een protocol voor extractie van miRNA, omgekeerde transcriptie en digitale PCR voor de absolute kwantificering van miRNAs in het serum van patiënten met hart-en vaatziekten.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van diagnostiek, zoals of micro RNA's geldige biomarkers zijn bij hart- en vaatziekten. In vergelijking met kwantitatieve real-time PCR vertoont digitale PCR superieure technische kwaliteiten voor het kwantificeren van microRNA's in de circulatie. Omdat de steekproef wordt verdeeld in ongeveer 20.000 druppels, zijn er geen dubbele metingen nodig en is er geen standaardcurve nodig voor kwantificering.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in de kwantificering van microRNA's bij cardiovasculaire patiënten, kan deze ook worden toegepast op andere patiënten en ziekten, aangezien andere microRNA's belofte hebben getoond als biomarkers bij kankerprogressie, kan deze ook worden toegepast op oncologische patiënten. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat de gegenereerde druppels kwetsbaar zijn en voorzichtig moeten worden behandeld. Na het isoleren van RNA uit serummonsters, gaat u verder met reverse transcriptie om stabielere complementaire DNA voor dPCR te verkrijgen.
Om te beginnen, ontdooi de reverse transcriptie kit op ijs. Draai vervolgens de enzymen en de primers naar beneden. Bereid vervolgens de mastermix voor zoals beschreven in het tekstprotocol.
Combineer 10 microliter van de mastermix met vijf microliter geëxtraheerd RNA in elke put van een 96-wellsplaat. Centrifugeer vervolgens de plaat bij 2.000xg bij vier graden Celsius gedurende twee minuten. Ga door met de reverse transcriptie zoals beschreven in het tekstprotocol.
Ontdooi eerst de commerciële dPCR mix, cDNA en PCR primers op ijs en centrifugeer direct voor gebruik. Bereid vervolgens de mastermix voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg 1,33 microliter volumes van reverse transcriptieproduct toe aan 18,67 microliter volumes van de mastermix en centrifugeer kort.
Gebruik een pipet om 20 microliter van het monster over te brengen naar elke put van de middelste rij van een acht-puts cassette. Pipet vervolgens 70 microliter druppelgeneratieolie in de olieputjes van de cassette. Plaats vervolgens een pakking op de cassette en plaats deze in de druppelgenerator.
Sluit de druppelgenerator en wacht tot de drie indicatorlichten vast groen zijn. Gebruik een pipet om voorzichtig 40 microliter van het druppelvormige monster over te brengen naar afzonderlijke putjes van een 96-wellsplaat. Verzegeld vervolgens de plaat met dPCR folie bij 180 graden Celsius gedurende vier seconden.
Plaats de verzegeld PCR plaat in de cycler en volg de cycling instructies beschreven in het tekstprotocol. Verwijder de plaat uit de thermocycler en breng deze over naar de basis van een plaathouder. Plaats vervolgens de bovenkant van de plaathouder op de PCR plaat.
Start ten slotte de commerciële dPCR software. In dit protocol werd digitale PCR gebruikt om microRNA's in het serum van patiënten met hart- en vaatziekten te kwantificeren. Steekproeven werden genomen van 16 patiënten vóór, acht uur na en 16 uur na percutane interventie.
Patiënten met ST-elevatie myocardinfarct vertoonden een significante toename van miR-499 niveaus in vergelijking met patiënten met stabiele coronaire hartziekte. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in ongeveer een uur worden uitgevoerd voor druppelvorming van 96 monsters als deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om in gedachten te houden om voorzichtig met de druppels om te gaan.
Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u digitale PCR correct uitvoert, door correcte druppelvorming, cycling, lezen en analyseren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor de extractie en kwantificering van circulerende microRNA's als potentiële biomarkers voor hart- en vaatziekten. Door gebruik te maken van digitale PCR beoogt de methode de nauwkeurigheid van de miRNA-meting in serummonsters van patiënten met cardiovasculaire aandoeningen te verbeteren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Cardiovasculaire ziekten
- Biomarkers
- MicroRNA-analyse
Achtergrond
- MicroRNA's zijn kleine niet-coderende RNA's die betrokken zijn bij genregulatie.
- Ze zijn naar voren gekomen als potentiële biomarkers voor diverse ziekten, waaronder cardiovasculaire aandoeningen.
- Digitale PCR biedt voordelen ten opzichte van traditionele methoden voor het kwantificeren van microRNA's.
- Inzicht in miRNA-profielen kan helpen bij de diagnose en behandeling van cardiovasculaire ziekten.
Doel van de studie
- Om microRNA's te valideren als biomarkers voor hart- en vaatziekten.
- Om de effectiviteit van digitale PCR aan te tonen bij het kwantificeren van circulerende miRNA's.
- Om een betrouwbaar protocol te bieden voor onderzoekers in dit vakgebied.
Gebruikte methoden
- Extractie van miRNA's uit serummonsters.
- Reverse transcriptie voor de synthese van complementair DNA.
- Digitale PCR voor absolute kwantificering van miRNA's.
- Vergelijking van digitale PCR met kwantitatieve real-time PCR.
Belangrijkste resultaten
- Digitale PCR vertoonde een superieure nauwkeurigheid bij de kwantificering van miRNA.
- De methode maakt de analyse van duizenden druppeltjes mogelijk zonder dat standaardcurven nodig zijn.
- De potentiële toepasbaarheid van de methode strekt zich uit voorbij cardiovasculaire aandoeningen naar andere condities zoals kanker.
- Uitdagingen bij het hanteren van fragiele druppeltjes werden opgemerkt bij nieuwe gebruikers van de techniek.
Conclusies
- De studie ondersteunt het gebruik van circulerende microRNA's als biomarkers voor cardiovasculaire aandoeningen.
- Digitale PCR is een veelbelovend instrument voor de precieze kwantificering van miRNA.
- Verder onderzoek zou de toepassing van deze methode naar andere ziekten kunnen uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het kwantificeren van circulerende microRNA's met digitale PCR biedt een reproduceerbare methode met een hoge gevoeligheid voor de validatie van biomarkers in onderzoek naar hart- en vaatziekten. Deze methode ondersteunt de validatie van targets en de ontwikkeling van assays door absolute kwantificering zonder standaardcurven mogelijk te maken, wat de variabiliteit in multicenterstudies vermindert. De techniek vergroot het voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door miRNA-expressie te koppelen aan pathologie, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen bij het onderzoeken van therapeutische hypothesen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door ziekte-specifieke miRNA's zoals miR-499 bij AMI te kwantificeren.
- Operationele waarde: Levert absolute miRNA-kopiegetallen zonder standaardcurven, wat de reproduceerbaarheid tussen verschillende locaties verbetert.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de triage van portfolio's op basis van biomarkers door miRNA-niveaus te koppelen aan cardiovasculaire pathologie.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gevalideerde biologische systemen (cDNA uit serum-RNA) voor downstream screening-workflows.
- Operationele waarde: Levert output met een hoge lineariteit en lage variabiliteit, geschikt voor assay-standaardisatie.
- Schaalbaarheid: Maakt de verwerking van 96 monsters in ongeveer één uur mogelijk na het maken van de mastermix, wat medium-throughput screening ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Verbindt miRNA-kwantificering in de ontdekkingsfase met preklinische validatie via ziekterelevante serumbiomarkers.
- Mechanistische Risicoreductie: Vermindert ambiguïteit bij targetvalidatie door miRNA-expressie te correleren met cardiovasculaire schade.
- Afstemming van Biomarkers: Ondersteunt de ontwikkeling van translationele biomarkers door miRNA's met een hoge weefsel- en ziektespecifiteit te kwantificeren.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van hypothese-toetsing tot lead-identificatie en levert kwantitatieve miRNA-gegevens die inzicht geven in het vertrouwen in het target en de gereedheid van de assay.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door de afgifte van miRNA van cardiovasculaire cellen naar de circulatie te kwantificeren.
- Screening: Levert assay-klare, gestandaardiseerde resultaten met een hoge sensitiviteit voor de evaluatie van biomarker-kandidaten.
- Analytica: Maakt directe vergelijking van miRNA-niveaus tussen verschillende condities mogelijk middels absolute kwantificering zonder standaardcurven.
- Translationeel onderzoek: Bevordert de continuïteit van biomarkers door circulerende miRNA-profielen te koppelen aan cardiovasculaire pathologie.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Vestigt een herbruikbaar kwantificeringsplatform dat toepasbaar is op zowel cardiovasculaire als oncologische indicaties.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in de validiteit van biomarkers door miRNA-kwantificering met een lage variabiliteit en hoge gevoeligheid.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid en standaardisatie via droplet-gebaseerde partitionering, waardoor dubbele metingen worden geëlimineerd.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door mechanistische ambiguïteit in biomarker-targetrelaties te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde vooruitgang mogelijk door kwantitatieve, pathologie-gekoppelde miRNA-data.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in RNA-isolatie, reverse transcriptie en de behandeling van druppels om monsterverlies te voorkomen.
- Necessiteert apparatuur voor druppelgeneratie, PCR-cyclers en dPCR-software voor een nauwkeurige kwantificering.
- Vereist standaardisatie tussen teams van de protocollen voor druppelvorming en verzegeling voor reproduceerbare resultaten.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij toepassing op verschillende monstertypes naast serum, zoals plasma of weefsellysaten.
- Bevat praktische beperkingen zoals de kwetsbaarheid bij het hanteren van druppels, wat de doorvoer voor onervaren gebruikers kan beïnvloeden.
