Name: Digitale PCR voor het kwantificeren van de circulerende MicroRNAs in acuut myocardinfarct en hart-en vaatziekten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Leer digitale PCR voor het kwantificeren van circulerende microRNAs als biomarkers bij hart- en vaatziekten. Deze methode biedt superieure nauwkeurigheid zonder standaardcurves en is ook toepasbaar bij andere aandoeningen zoals kanker.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs hebben geen bevestigingen.

1. extractie van miRNA van Plasma/Serum
Opmerking: Om te kwantificeren miRNAs op de juiste manier, het juiste microRNA isolement van het plasma/serum is een cruciale stap. Een belangrijkste ding in gedachten te houden, vooral omdat verschillende protocollen bestaan, is zich te houden aan dezelfde werkstroom tijdens de verwerking van de monsters. In dit protocol wordt de miRNA geëxtraheerd uit 50 µL van de serum. Gebruik niet meer dan 200 µL als deze limiet de juiste extractieproces.
<ol><li>Bereiden van serum of ontdooien van bevroren monsters.</li>
	<li>Voeg toe 250 µL (5 volumes) commerciële lysis reagens aan 50 µL van de serum. Steun de lysis van vortexing. Plaats de buis met de lysate op de Bank bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Spike de lysate met 3,5 µL van spike-controle (1.6 x 107 kopieën/µL) en meng ze door vortexing.</li>
	<li>Voeg 50 µL chloroform (dat wil zeggen, een gelijke hoeveelheid over het eerste serummonster) voor de fase-separatie zichtbaar. Goed schudden de buis voor 15 s. plaats de buis op de Bank bij kamertemperatuur gedurende 2-3 minuten.</li>
	<li>Voor de fasescheiding, centrifugeer de buis bij 12.000 x g bij 4 ° C gedurende 15 minuten. Opmerking: De monsters zijn nu opgedeeld in een bovenste waterige fase met de RNA, een witte interfase en een lagere, roze organische fase.</li>
	<li>Overdracht van de bovenste waterfase (100 µL) met de RNA in een nieuwe buis. Witte interfase materiaal niet overdragen als dit de juiste RNA-telling geschrift.</li>
	<li>Voeg 150 µL (d.w.z., 1.5 x de hoeveelheid van de overgebrachte monster) van 100% ethanol. Meng de materialen door pipetteren hen op en neer. Geen Centrifugeer ze en snel gaan naar de volgende stap.</li>
	<li>Pipetteer 250 µL van het monster op een commerciële spin-kolom in een collectie tube van 2 mL. Sluit het deksel. Centrifugeer de kolom > 8000 x g bij kamertemperatuur voor 15 s. negeren de doorstroming.</li>
	<li>700 µL van commerciële wassen buffer nummer 1 aan de spin kolom toevoegen. Sluit het deksel en centrifugeer de kolom > 8000 x g bij kamertemperatuur voor 15 s. negeren de run-through wassen buffer.</li>
	<li>Voeg toe 500 µL van commerciële wassen buffer nummer 2 aan de spin-kolom. Sluit het deksel en centrifugeer de kolom > 8, 000 x g bij kamertemperatuur voor 15 s. negeren de run-through wassen buffer.</li>
	<li>Pipetteer 500 µL van 80% ethanol naar de spin-kolom. Sluit het deksel, de kolom Centrifugeer > 8, 000 x g bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten negeren de buis van de collectie met de doorstroming.</li>
	<li>De spin kolom overbrengen in een nieuwe collectie-tube van 2 mL. Centrifugeer de kolom op volle snelheid met een geopende deksel te drogen van het membraan. Gooi de buis van de collectie met de doorstroming.</li>
	<li>Breng de spin-kolom in een nieuwe 1,5 mL collectie buis. Elueer de RNA door toepassing van de 30 ÂµL van RNase-gratis water rechtstreeks naar het midden van het membraan. Sluit het deksel. Centrifugeer de kolom op volle snelheid voor 1 min.</li>
	<li>Opslag van RNA bij 70 ° C. Opmerking: De opslag van gezuiverde RNA in RNase-gratis water tussen-70 ° C tot-20 ° C garandeert geen afbraak van het RNA voor 1 jaar. Na het protocol van de fabrikant is de minimale hoeveelheid water RNase-vrij om te verdunnen van het RNA 10 µL. met behulp van minder dan 10 µL kan onvoldoende hydrateren het membraan en verminderen de totale opbrengst van RNA.</li>
</ol>2. omgekeerde transcriptie
Opmerking: CDNA (cDNA) werd gesynthetiseerd met behulp van de volgende 15 µL omgekeerde transcriptie (RT) protocol (totale reactie volume).
<ol><li>Ontdooi de RT kit op ijs. Houd de enzymen in de vriezer, zolang mogelijk om te verhinderen dat ze vernederende en draai ze naar beneden vóór gebruik. RT inleidingen op ijs ontdooien en draai ze naar beneden vóór gebruik.</li>
	<li>De master mix bereiden zoals beschreven in tabel 1.</li>
	<li>Combineer 10 µL van master mix en 5 µL van uitgepakte RNA per putje in een 96 well-plate.</li>
	<li>Centrifugeer het goed plaat bij 2.000 x g bij 4 ° C gedurende 2 minuten.</li>
	<li>Het protocol van de thermische cyclus wordt beschreven in tabel 2 voor de omgekeerde transcriptie gebruiken. Opmerking: Zoals hieronder beschreven, cDNA kan direct worden verwerkt in de digitale PCR machine (Zie Tabel van materialen); Als alternatief kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C.</li>
</ol>3. droplet generatie en digitale PCR
Opmerking: Digitale PCR werd uitgevoerd met behulp van het volgende 40 µL-protocol.
<ol><li>Ontdooi de commerciële dPCR-mix, bereid cDNA en de PCR inleidingen op ijs. Centrifugeer ze kort voor gebruik.</li>
	<li>De master mix bereiden zoals beschreven in tabel 3.
</li>
	<li>Voeg 1,33 μl per putje van de RT-product en het kort centrifugeren.</li>
	<li>Pipetteer 20 μL van het monster in elk putje van de 8-well cassette (middellange rij). Opmerking: Als de 8-well cassette niet volledig is gevuld, vul de resterende putjes met niet-template besturingselementen (NTC) die weglaten van cDNA (dat wil zeggen, het product van de RT geproduceerd met water in plaats van uitgepakte RNA) of commerciële buffer dPCR. De NTC dient als een controle van de besmetting. Water mag niet worden gebruikt in de overige wells, want dat zal afbreuk doen aan de kwaliteit van de vorming van de druppel.</li>
	<li>Pipetteer 70 μL van de druppel generatie olie voor de sondes in de oliebronnen (onderste rij) van de 8-well-cassette.</li>
	<li>Plaats een pakking op de top van de 8-well cassette en plaats de cassette in de droplet-generator. Sluit de droplet-generator. Wacht totdat de 3 indicatorlampjes stevige groen zijn. Opmerking: Druppels nu worden gegenereerd.</li>
	<li>Zorgvuldig en langzaam Pipetteer 40 μL van de druppel gevormde monster (bovenste rij) in aparte wells van een 96-wells-plaat door pipetteren.</li>
	<li>Na het voltooien van de vorming van de druppel op de monsters, het zegel van de PCR-plaat met een pierceable dPCR folie bij 180 ° C voor 4 s.</li>
	<li>Plaats de folie-verzegeld PCR-plaat in de cycler en cyclus het zoals beschreven in tabel 4, met een snelheid van de helling van 2,5 ° C/s.</li>
</ol>4. droplet lezen en analyseren
<ol><li>De plaat van de thermische cycler overbrengen aan de basis van de houder van de plaat. Draai de PCR-plaat door het plaatsen van de bovenkant van de plaat houder op het bord van de PCR.</li>
	<li>Start de commerciële dPCR software.</li>
	<li>Voer de naam van het monster, de naam van het experiment, en het doel in de setup. Selecteer de absolute kwantificering.</li>
	<li>Start de druppel lezen door te klikken op uitvoeren. Selecteer FAM/HEX of FAM/VIC als detectie chemie bij het werken met hydrolyse sondes. Opmerking: De commerciële dPCR software zal vervolgens auto-analyseren van de gegevens.</li>
	<li>Controleer de nummers van de druppel in de tabel van de resultaten om ervoor te zorgen een juiste druppel-generatie.</li>
	<li>Selecteer alle putjes met de dezelfde gekwantificeerde miRNA en klik op analyseren. Gebruik de 2D vlek om te markeren van positieve druppels en handmatig corrigeren de auto-geanalyseerd gegevens (Figuur 1).</li>
</ol>5. de juiste berekeningen van de steekproef
<ol><li>Normaliseren van het monster door het monster met de normalisatie-factor (NF) te vermenigvuldigen. NF = mediaan [C. elegans miR-39 metingen]alle samples/ [C. elegans miR-39]monster
</li>
	<li>Bereken de definitieve miRNA serum-concentratie, aanpassen voor verdunningsfactoren (DF). [miRNA] laatste = [miRNA]ruwe waarde x DFRT x DFdPCR x DFEx Waar: [miRNA] ruwe waarde = de miRNA gekwantificeerd door commerciële dPCR software; DFRT = de verdunningsfactor van de sjabloon in omgekeerde transcriptie; DFdPCR = de verdunningsfactor van de sjabloon in dPCR; DFEx = de verdunningsfactor bij de extractie.</li>
</ol>6. synthetische Oligonucleotide verdunningsreeks
<ol><li>Ontdooi gelyofiliseerd synthetische oligonucleotide op ijs. Kort na het centrifugeren.</li>
	<li>Verdun de gelyofiliseerd synthetische oligonucleotide in nuclease-gratis water met een eindconcentratie van 10 pmol / µL. kort centrifugeren het.</li>
	<li>Verdun het in nuclease-gratis water zoals beschreven in tabel 5. Centrifugeer de verdunning kort tussen elke verdunning stap bij 8.000 x g gedurende 10 s.</li>
	<li>Doorgaan met de omgekeerde transcriptie, zoals beschreven in stap 2 en analyseren van de monsters met digitale PCR, zoals beschreven in stap 3 en stap 4.</li>
</ol>

<ol><li>Schulte, C., Zeller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-based+diagnostics+and+therapy+in+cardiovascular+disease+-+summing+up+the+facts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Diagnosis+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease - summing up the facts.</a> Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).</li>
<li>Sun, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microRNAs+in+myocardial+infarction%3A+from+molecular+mechanism+to+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).</li>
<li>Dimmeler, S., Zeiher, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+novel+biomarkers+for+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases.</a> European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).</li>
<li>Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+novel+biomarkers+and+extracellular+communicators+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 110, 483-495 (2012).</li>
<li>Oerlemans, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+assessment+of+acute+coronary+syndromes+in+the+emergency+department%3A+the+potential+diagnostic+value+of+circulating+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs.</a> EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).</li>
<li>Olivieri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+potential+of+circulating+miR-499-5p+in+elderly+patients+with+acute+non+ST-elevation+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Internation+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Diagnostic potential of circulating miR-499-5p in elderly patients with acute non ST-elevation myocardial infarction.</a> Internation Journal of Cardiology. 167, 531-536 (2013).</li>
<li>Navickas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+circulating+microRNAs+as+biomarkers+of+cardiovascular+disease%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: a systematic review.</a> Cardiovascular Research. 111, 322-337 (2016).</li>
<li>Devaux, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+value+of+circulating+microRNAs+in+patients+with+acute+chest+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic value of circulating microRNAs in patients with acute chest pain.</a> Journal of Internal Medicine. 277, 260-271 (2015).</li>
<li>Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+normalization+strategies+for+microRNA+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Data normalization strategies for microRNA quantification.</a> Clinical Chemistry. 61, 1333-1342 (2015).</li>
<li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83, 8604-8610 (2011).</li>
<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nature Methods. 10, 1003-1005 (2013).</li>
<li>Robinson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+as+a+novel+detection+method+for+quantifying+microRNAs+in+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Internation+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction.</a> Internation Journal of Cardiology. 257, 247-254 (2018).</li>
<li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10513-10518 (2008).</li>
<li>D'Alessandra, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+are+new+and+sensitive+biomarkers+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction.</a> European Heart Journal. 31, 2765-2773 (2010).</li>
<li>Forootan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+limit+of+detection+and+limit+of+quantification+in+quantitative+real-time+PCR+%28qPCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR).</a> Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).</li>
<li>Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+of+droplet-digital+PCR+vs+real-time+quantitative+PCR+to+inhibitory+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances.</a> Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7, 2409(2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Digitale PCR is een relatief nieuwe eindpunt methode van PCR waarmee de directe absolute kwantificering van nucleïnezuren binnen een steekproef. De methode heeft bepaalde voordelen, zoals een verminderde variabiliteit, een grotere dagelijkse reproduceerbaarheid en een superieure gevoeligheid11,12. Verder, als gevolg van het partitioneren van het monster in ongeveer 20.000 enkele reacties en eindpunt analyses, dPCR is robuuster aan storende stoffen in PCR in verge...

Circulerende miRNAs hebben geïdentificeerd als veelbelovende markers voor een aantal ziekten, waaronder hart-en vaatziekten1. De miRNAs zijn kleine, niet-coderende single-stranded RNA moleculen (ongeveer 22 nucleotiden lang) betrokken zijn in de post-transcriptional verordening via de wijziging van de boodschapper-RNA vertaling en beïnvloeden gene expression2, en worden vrijgegeven in de circulatie in zowel fysiologische en pathologische staten. De kwantitatieve expressie van specifieke miRNAs kan worden gekoppeld aan de pathologie, en sommige miRNAs tonen hoog weefsel en ziekte specificiteit1. Cardiovasculaire aandoeningen, miRNAs geworden aantrekkelijke kandidaten als nieuwe biomarkers omdat ze opmerkelijk stabiel in het serum zijn en gemakkelijk kunnen worden gekwantificeerd met behulp van PCR methode3. De potentiële waarde van miRNAs als biomarkers voor myocardiaal infarct is geëvalueerd in kleine studies, maar een validatie in grote cohorten ontbreekt2. Bijvoorbeeld, miR-499 komt sterk uitgedrukt in de myocardiale spier, en het is aangetoond dat aanzienlijk worden verhoogd in een AMI4,5,6. Verder regelt het geprogrammeerde celdood (apoptose) en de differentiatie van cardiomyocytes en gaat dus in verschillende mechanismen na een AMI-7. Afgezien van enkele kleine studies rapporteren een superioriteit en incrementele waarde van miRNAs voor de diagnose van AMI, is de superioriteit of gelijkheid aan hoog-gevoeligheids cardiale troponins niet nog bewezen in grootschalig onderzoek2,5 ,6,8. Meer prospectieve studies in grote cohorten zijn, daarom, nodig voor de beoordeling van de potentiële diagnostische waarde van miRNAs. Bovendien, methoden van miRNA kwantificering moeten worden geoptimaliseerd en9gestandaardiseerde met behulp van vergelijkbare protocollen. Gestandaardiseerde testen inconsistente resultaten kunnen verminderen en kunnen helpen miRNAs te worden van mogelijke biomarkers voor de routinematige klinische toepassing, zoals biomarkers worden gekwantificeerd in een reproduceerbare manier moeten om hun klinische toepasbaarheid.
Onlangs, dPCR is ingevoerd als een eindpunt analyse. Het partities van het monster in ongeveer 20.000 individuele reacties10. Vervolgens het dPCR-systeem maakt gebruik van een wiskundige Poisson statistische analyse van fluorescerende signalen (positieve en negatieve reacties), waardoor een absolute kwantificering zonder een standaard curve10. Bij het combineren van dPCR met fluorescerende hydrolyse sondes, is de zeer specifieke directe absolute kwantificering van miRNAs mogelijk gemaakt. Digitale polymerase-kettingreactie heeft aangetoond dat het vertonen van superieure technische kwaliteiten (met inbegrip van een verminderde variabiliteit, een grotere dagelijkse reproduceerbaarheid, een hoge mate van lineariteit en een hoge gevoeligheid) voor het kwantificeren van miRNA niveaus in de verkeer in vergelijking met kwantitatieve real-time PCR10,11. Deze superieure technische kwaliteiten kunnen helpen verlichten van de huidige beperkingen op het gebruik van de circulerende miRNAs als biomarkers en kunnen leiden tot de oprichting van miRNAs als biomarkers in grote multi center cardiovasculaire klinische proeven en als een diagnostische methode in algemene. In een eerdere studie, wij onlangs toegepast dPCR voor de absolute kwantificering van de circulerende miRNAs bij patiënten met een AMI en waren in staat om aan te tonen van superieure diagnostische mogelijkheden in vergelijking met de kwantificering van miRNAs door qPCR12.
In deze publicatie willen we aantonen dat het gebruik van dPCR een nauwkeurige en reproduceerbare methode is voor rechtstreeks kwantificeren cardiovasculaire miRNAs circuleren. De absolute kwantificering van miRNA niveaus in het serum, met behulp van digitale PCR, toont het potentieel voor het gebruik in grote multi center cardiovasculaire klinische proeven. In deze publicatie beschrijven we in detail hoe effectief uitvoeren van digitale PCR en hoe om te ontdekken de absolute miRNA exemplaaraantal in serum.

<table><tbody><tr><td>RNA-Extractie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Kit (50)</td><td>Qiagen-Sample &amp; Assay Technologies, Hilden, Deutschland</td><td>217184</td><td>Kit voor microRNA extractie. Kit bevat commerciële buffer RWT (genoemd nummer één in het manuscript)&nbsp; en RPE (genoemd nummer twee in manuscript).</td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol</td><td>Qiagen-Sample &amp; Assay Technologies, Hilden, Deutschland</td><td>219610</td><td>Spike-in voor normalisatie, Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3'</td></tr><tr><td>Omgekeerde transcriptie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Omgekeerde transcriptie kit (1000 reacties)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4366597</td><td>Kit voor microRNA omgekeerde transcriptie</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays M</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td><td>Assays gebruikt bij omgekeerde transcriptie</td></tr><tr><td>hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR reacties)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td><td>Assay Nummer 001352</td></tr><tr><td>cel-miR-39 (750 RT/750 PCR reacties)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td><td>Assay Nummer 000200</td></tr><tr><td>PCR-plaat, 96-well, gesegmenteerd, half-omzoomd</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>AB0900</td><td>96 well plaat voor omgekeerde transcriptie</td></tr><tr><td>Microseal &lsquo;B&rsquo; seal Seals</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>MSB1001</td><td>Folie om juiste opslag te garanderen</td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1851196</td><td>Cycler gebruikt voor omgekeerde transcriptie</td></tr><tr><td>Droplet Digital PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 nmol RNA oligo hsa-miR-499-5p</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Custom</td><td>Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3'</td></tr><tr><td>ddPCR Supermix voor Probes (geen dUTP)</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863024</td><td>Supermix gebruikt bij druppelgeneratie</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td><td>Assays gebruikt in digitale PCR (fluorescente hydrolyse sonde)</td></tr><tr><td>hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR reacties)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td><td>Assay Nummer 001352, commerciële primers</td></tr><tr><td>cel-miR-39 (750 RT/750 PCR reacties)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td><td>Assay Nummer 000200, commerciële primers</td></tr><tr><td>DG8 Cartridges en pakkingen</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1864007</td><td>Cartridge neemt maximaal 8 monsters op voor druppelgeneratie</td></tr><tr><td>DG8 Cartridge Holder</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863051</td><td>Houdt cartridges vast bij druppelgeneratie</td></tr><tr><td>Droplet Generation Olie voor Probes</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863005</td><td>Olie gebruikt bij druppelgeneratie</td></tr><tr><td>ddPCR 96-Well Plates</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>12001925</td><td>96 well plaat voor ddPCR</td></tr><tr><td>PCR Plate Heat Seal, folie, doorboorbaar</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1814040</td><td>Doorboorbare folie, compatibel met druppellezer</td></tr><tr><td>ddPCR Druppel Reader Olie</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863004</td><td>Olie gebruikt bij druppellezing</td></tr><tr><td>QX100 of QX200 Druppel Generator</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863002</td><td>Druppel Generator, genereert de druppels uit monster/olie emulsie</td></tr><tr><td>PX1 PCR Plate Sealer</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1814000</td><td>Verzegeld de plaat voor PCR</td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1851196</td><td>Cycler gebruikt voor ddPCR</td></tr><tr><td>QX100 of QX200 Druppel Reader</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863003</td><td>Lees PCR-positieve en PCR-negatieve druppels met een optische detector</td></tr><tr><td>ddPCR Buffer Control voor Probes</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863052</td><td>Blanco controle&nbsp;en om de resterende putjes van 8-putjes cassette te vullen</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantaSof Software</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1864011</td><td>Programma voor druppellezing</td></tr><tr><td>Prism Windows 5</td><td>GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA</td><td></td><td>Programma voor statistische analyse</td></tr></tbody></table>

digitale pcr voor het kwantificeren van de circulerende micrornas in acuut myocardinfarct en hart-en vaatziekten

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Circulerende serum microRNAs (miRNAs) is gebleken belofte als biomarkers voor de hart-en vaatziekten en acuut myocardinfarct (AMI), vrijgelaten uit de cardiovasculaire cellen in de circulatie. Circulerende miRNAs zijn zeer stabiel en kunnen worden gekwantificeerd. De kwantitatieve expressie van specifieke miRNAs kan worden gekoppeld aan de pathologie, en sommige miRNAs Toon hoge weefsel en de specificiteit van de ziekte. Het vinden van nieuwe biomarkers voor cardiovasculaire aandoeningen is van belang voor medisch onderzoek. Vrij recentelijk heeft digitale polymerase-kettingreactie (dPCR) uitgevonden. dPCR, gecombineerd met fluorescerende hydrolyse sondes, kan specifieke directe absolute kwantificering. dPCR vertoont superieure technische kwaliteiten, met inbegrip van een lage variabiliteit, hoge lineariteit en hoge gevoeligheid ten opzichte van de kwantitatieve polymerase chain reaction (qPCR). DPCR is dus een meer nauwkeurige en reproduceerbare methode voor rechtstreeks het kwantificeren van miRNAs, met name voor het gebruik in grote multi center cardiovasculaire klinische proeven. In deze publicatie beschrijven we het effectief uitvoeren van digitale PCR teneinde de absolute exemplaaraantal in serummonsters.

Digitale PCR gecombineerd met fluorescerende hydrolyse sondes kan onderzoekers de absolute bedragen van specifieke miRNAs in kopieën/µL rechtstreeks te kwantificeren. Als het monster in dPCR is gepartitioneerd in ongeveer 20.000 afzonderlijke PCR reacties, dPCR vereist geen technische repliceert10. Het dPCR-systeem maakt gebruik van een wiskundige Poisson statistische analyse van fluorescerende signalen (verschillen tussen positieve en negatieve reacties) een absol...

Circulerende microRNAs is gebleken belofte als biomarkers voor cardiovasculaire aandoeningen en acuut myocardiaal infarcten. In deze studie beschrijven we een protocol voor extractie van miRNA, omgekeerde transcriptie en digitale PCR voor de absolute kwantificering van miRNAs in het serum van patiënten met hart-en vaatziekten.

Digitale PCR voor het kwantificeren van de circulerende MicroRNAs in acuut myocardinfarct en hart-en vaatziekten

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van diagnostiek, zoals of micro RNA's geldige biomarkers zijn bij hart- en vaatziekten. In vergelijking met kwantitatieve real-time PCR vertoont digitale PCR superieure technische kwaliteiten voor het kwantificeren van microRNA's in de circulatie. Omdat de steekproef wordt verdeeld in ongeveer 20.000 druppels, zijn er geen dubbele metingen nodig en is er geen standaardcurve nodig voor kwantificering.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de kwantificering van microRNA's bij cardiovasculaire patiënten, kan deze ook worden toegepast op andere patiënten en ziekten, aangezien andere microRNA's belofte hebben getoond als biomarkers bij kankerprogressie, kan deze ook worden toegepast op oncologische patiënten. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat de gegenereerde druppels kwetsbaar zijn en voorzichtig moeten worden behandeld. Na het isoleren van RNA uit serummonsters, gaat u verder met reverse transcriptie om stabielere complementaire DNA voor dPCR te verkrijgen.Om te beginnen, ontdooi de reverse transcriptie kit op ijs. Draai vervolgens de enzymen en de primers naar beneden. Bereid vervolgens de mastermix voor zoals beschreven in het tekstprotocol.Combineer 10 microliter van de mastermix met vijf microliter geëxtraheerd RNA in elke put van een 96-wellsplaat. Centrifugeer vervolgens de plaat bij 2.000xg bij vier graden Celsius gedurende twee minuten. Ga door met de reverse transcriptie zoals beschreven in het tekstprotocol.Ontdooi eerst de commerciële dPCR mix, cDNA en PCR primers op ijs en centrifugeer direct voor gebruik. Bereid vervolgens de mastermix voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg 1,33 microliter volumes van reverse transcriptieproduct toe aan 18,67 microliter volumes van de mastermix en centrifugeer kort.Gebruik een pipet om 20 microliter van het monster over te brengen naar elke put van de middelste rij van een acht-puts cassette. Pipet vervolgens 70 microliter druppelgeneratieolie in de olieputjes van de cassette. Plaats vervolgens een pakking op de cassette en plaats deze in de druppelgenerator.Sluit de druppelgenerator en wacht tot de drie indicatorlichten vast groen zijn. Gebruik een pipet om voorzichtig 40 microliter van het druppelvormige monster over te brengen naar afzonderlijke putjes van een 96-wellsplaat. Verzegeld vervolgens de plaat met dPCR folie bij 180 graden Celsius gedurende vier seconden.Plaats de verzegeld PCR plaat in de cycler en volg de cycling instructies beschreven in het tekstprotocol. Verwijder de plaat uit de thermocycler en breng deze over naar de basis van een plaathouder. Plaats vervolgens de bovenkant van de plaathouder op de PCR plaat.Start ten slotte de commerciële dPCR software. In dit protocol werd digitale PCR gebruikt om microRNA's in het serum van patiënten met hart- en vaatziekten te kwantificeren. Steekproeven werden genomen van 16 patiënten vóór, acht uur na en 16 uur na percutane interventie.Patiënten met ST-elevatie myocardinfarct vertoonden een significante toename van miR-499 niveaus in vergelijking met patiënten met stabiele coronaire hartziekte. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in ongeveer een uur worden uitgevoerd voor druppelvorming van 96 monsters als deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om in gedachten te houden om voorzichtig met de druppels om te gaan.Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u digitale PCR correct uitvoert, door correcte druppelvorming, cycling, lezen en analyseren.

digital-pcr-for-quantifying-circulating-micrornas-acute-myocardial

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde multiplex reverse transcriptase kwantitatieve PCR (qRT-PCR)-protocol in combinatie met een microfluïdisch platform als een kost en tijd efficiënte high-throughput screening tool voor microRNA (miRNA) expressie niveaus, in het bijzonder bij het werken met beperkte hoeveelheden van het monster.

High Throughput MicroRNA Profiling: Geoptimaliseerd Multiplex qRT-PCR op nanoliter Schaalverdeling op de Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCS

Het meten van biomarkers in complexe biologische monsters wordt in toenemende mate leidend klinische besluitvorming. We beschrijven een zeer gevoelige methode voor het gelijktijdig meten cardiale myosine bindend eiwit C, creatine kinase MB, troponine I en in serummonsters van patiënten met myocardiaal infarct en gezonde controlepersonen.

Een gevoelige en specifieke kwantificering Methode voor het bepalen van Serum cardiale myosine bindend eiwit C door elektrochemiluminescentie-Immunoassay

Circulerende microRNAs zijn onlangs naar voren gekomen als veelbelovend en nieuwe biomarkers voor verschillende vormen van kanker en andere ziekten. Het doel van dit artikel is om drie verschillende probes gebaseerde real-time PCR-platforms en methoden die beschikbaar zijn om te kwantificeren en te bepalen de overvloed aan circulerende microRNAs zijn te bespreken.

Probe-gebaseerde real-time PCR Benaderingen voor kwantitatieve meting van microRNAs

Er wordt een gevoelige en nauwkeurige methode beschreven voor de kwantificering van celvrije microRNA's met behulp van een kleurstof-gebaseerde chemie en druppel digitale PCR-technologie.

Circulerende MicroRNA Kwantificering Met behulp van DNA-bindende Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

MicroRNAs spelen een belangrijke regulerende rol en zijn in opkomst als nieuwe therapeutische doelen voor verschillende ziekten bij de mens. Het is aangetoond dat miRNAs worden vervoerd in high density lipoproteïnen. Wij hebben een eenvoudige methode om gezuiverd HDL geschikt voor miRNA analyse uit menselijk plasma snel isoleren ontwikkeld.

Snelle en vereenvoudigde methode voor High Through-put Isolatie van miRNA uit Highly Purified high density lipoproteïne

Dit verslag beschrijft een protocol voor het meten van de absolute niveaus van plasma miRNA, kwantitatieve real-time omgekeerde transcriptie PCR gebruiken met of zonder voorafgaande versterking. Dit protocol biedt een beter begrip van de hoeveelheid plasma miRNAs en laat de kwalitatieve beoordeling van de bijbehorende gegevens uit verschillende studies of laboratoria.

Absolute kwantificering van Plasma MicroRNA niveaus bij Cynomolgus apen, met behulp van kwantitatieve Real-time omgekeerde transcriptie PCR

Micro-RNAs (miRNAs) zijn korte en zeer homologe RNA-sequenties, post-transcriptional regulatoren van messenger RNAs (mRNAs) bijeenkomen. Huidige miRNA detectiemethoden verschillen in gevoeligheid en specificiteit. We beschrijven een protocol dat in situ hybridisatie en immunokleuring voor gelijktijdige detectie van miRNA en eiwit moleculen op muis hart weefselsecties combineert.

Weefsel-specifieke miRNA expressie profilering in muis hart secties gebruiken In Situ hybridisatie

Presenteren we een protocol om te evalueren van de expressie niveaus van circulerende microRNA (miRNAs) in plasma monsters van kankerpatiënten. In het bijzonder, hebben we gebruikt een verkrijgbare kit voor circulerende miRNA extractie en omgekeerde transcriptie. Ten slotte, geanalyseerd wij een panel van 24 geselecteerde miRNAs met behulp van real-time vooraf gevlekte sonde aangepaste platen.

Detectie van een circulerende MicroRNA Custom Panel bij patiënten met uitgezaaide darmkanker

Dit protocol beschrijft de gedetailleerde methode van digitale druppel PCR (dd-PCR) voor nauwkeurige kwantificering van circulaire RNA (circRNA) niveaus in cellen met behulp van divergente primers.

Kwantificering van circulaire RNA's met behulp van digitale druppel-PCR

De rat model van acuut myocard infarct (AMI) is nuttig om het gevolg van een MI op cardiale pathofysiologische en fysiologische functie te bestuderen.

Acuut myocardinfarct in ratten

Leer digitale PCR voor het kwantificeren van circulerende microRNAs als biomarkers bij hart- en vaatziekten. Deze methode biedt superieure nauwkeurigheid zonder standaardcurves en is ook toepasbaar bij andere aandoeningen zoals kanker.

Digitale PCR voor het kwantificeren van de circulerende MicroRNAs in acuut myocardinfarct en hart-en vaatziekten

Meer video's verkennen