Name: Genetische codering van een niet-canonieke aminozuur voor de generatie van antilichaam-Drug conjugaten door een snel Bioorthogonal reactie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Ontdek een methode voor site-specifieke modificatie van antilichamen met cyclopropeenderivaten van lysine voor de efficiënte generatie van antilichaam-drugconjugaten. Deze techniek biedt hoge opbrengst en stabiele bindingen voor gerichte kankertherapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de Medical Research Council, UK. BO-S. houdt een EMBO fellowship (ATLF 158-2016) en is dankbaar aan H. Pelham en J.W. kin voor steun, en G. Kym, C. W. Morgan, en O. Perisic voor hulp en advies.

1. produceren en karakteriseren van het antilichaam
<ol><li>Express van het antilichaam<ol>
<li>Een flesje van HEK schorsing cellen in een maatkolf van 250 mL 50 mL van expressie medium aangevuld met 100 eenheden/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine en 250 ng/mL amfotericine B. Houd de cellen bij 37 ° C met 8% CO2 in starterscentra uitgerust bevochtigde met ontdooien met een shaker bij 125 t/min. Splitst u cellen tot 0.3-0.5 x 106 cellen/mL (elke 2-3 dagen) minstens 2 maal vóór transfecting.</li>
		<li>Bij een dichtheid van 2,5 x 106 cellen/mL wordt bereikt (2-3 dagen na de splitsing), bereid een verse oplossing van 100 mM CypK. Voor dit doel, weeg 64 mg CypK, toevoegen van 2.5 mL 0,1 natriumhydroxide, vortex, spin naar beneden om te herstellen van alle onopgeloste deeltjes en bewerk ultrasone trillingen ten.</li>
		<li>2,5 mL CypK (100 mM in 0,1 M NaOH) toevoegen aan 42.5 mL van expressie medium aangevuld met antibiotica. Meng goed en voeg 250 µL van 0,1 M HCl steriliseren met behulp van een 0,22 µm filter.</li>
		<li>Verdun 50 µg HC en LC pKym1 plasmiden21 tot 2,5 mL met verminderde serum medium. Verdun in een aparte buis, 135 µL van transfectiereagens tot 2,5 mL met verminderde serum medium.</li>
		<li>Vijf minuten na de voorbereiding van de oplossingen, meng de plasmiden en de transfectie reagens oplossing en incubeer gedurende 20 min om de vorming van complexen tussen het DNA en het transfectiereagens.</li>
		<li>In de tussentijd 125 miljoen cellen op de dichtheid van de doelgroep voor 5 min op 500 x g centrifugeren, resuspendeer met het medium van de expressie dat CypK en voeg de DNA-transfectie reagens mengsel. CypK kunnen worden gekocht of gesynthetiseerd zoals gemeld eerder18.</li>
		<li>Na incubatie cellen voor 20u, voeg 250 µL van transfectie reagens versterkers inbegrepen in de kit.</li>
		<li>Oogsten van antilichamen van het supernatant 6-7 dagen na toevoeging van CypK (geen verandering van medium is vereist tijdens expressie). * Als alternatief voor het verkrijgen van hogere en consistentere opbrengsten, kan een stabiele cel-lijn worden gegenereerd zoals wordt beschreven in Oller-Salvia et al. 2018-21. In dit geval wordt trastuzumab(CypK)2 uitgedrukt gewoon door toevoeging van CypK 5 mM in het medium van expressie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zuiveren van het antilichaam<ol>
<li>De cellen gedurende 15 minuten op 3000 x g centrifugeren.</li>
		<li>De bovendrijvende vloeistof met een 0,45 of een 0,22 µm filter filteren. Als het filter wordt geroteerd, vervangen voor een nieuwe en verder filteren. Als dit na slechts een paar milliliter gebeurt, Centrifugeer het supernatant voor een extra 15 min bij 7000 x g.</li>
		<li>Toevoegen eiwit A hars (2 mL/100 mL van het supernatans dat) in de kolom van een lege polypropyleen chromatografie en equilibreer de hars met ten minste 5 volumes van parel was buffer (0,1 M natriumfosfaat, 150 mM NaCl).</li>
		<li>Het supernatant gesplitst door twee conische buizen van 50 mL en voeg 5 x parel was buffer (0.5 M natriumfosfaat, 150 mM NaCl) gevolgd door de vooraf zijn geëquilibreerd eiwit A hars. Plaats de conische buis op een roller gedurende 3 uur bij kamertemperatuur te trekken van het antilichaam in het supernatant. Alternatief: Voeg het supernatant op de kolom met ten minste het dubbele de aanbevolen hoeveelheid hars en laat doorheen kan stromen. Zorg ervoor dat er niet een significante hoeveelheid van antilichaam links in het supernatant door SDS-PAGE. Als er, elueer de bovendrijvende vloeistof via de hars nogmaals.</li>
		<li>Breng EiwitA hars met de bovendrijvende substantie in een kolom en laat de vloeistof doorheen kan stromen.</li>
		<li>Voeg 25 mL buffer van het wassen (of ten minste 10 hars volumes) en laten doorstromen.</li>
		<li>Elueer het antilichaam met 4 mL 0,1 M Natriumcitraat, pH 3, op 1 mL van de 1 M fosfaatbuffer, 150 mM NaCl.</li>
		<li>Verdun het antilichaam met 10 mL PBS, concentreren op 0,5-1 mL door centrifugaal filtratie en uitwisseling buffer driemaal met PBS.</li>
		<li>Zuiveren van de monsters door FPLC met behulp van een butyl HIC-kolom met een stroom van 0,5 mL/min en een 0-100% verloop in 30 min voor lage-zout buffer (50 mM natriumfosfaat pH 7.0, 20% isopropanol) in hoog-zout buffer (1,5 M (NH4)2SO4, 50 mM natriumfosfaat pH 7.0 5% isopropanol). Verzamelen van alle fracties en bijhouden van de elutie op 280 nm. Kleine hoeveelheden (< 1 mg) kunnen worden gezuiverd met HPLC-HIC onder de voorwaarden beschreven in punt 2.4 te maximaliseren van de opbrengst en zuiverheid.</li>
		<li>Zwembad de breuken die bevatten antilichaam, Verdun hen tot ten minste 4 mL met PBS, concentreren ze door centrifugaal filtratie en uitwisseling buffer driemaal met PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kwantificeren van het antilichaam<ol>
<li>Verkrijgen van een geschatte concentratie door het meten van de absorptie bij 280 nm met behulp van een micro-volume spectrofotometer.</li>
		<li>Als een nauwkeurige meting vereist is, gebruikt u een ELISA-kit voor het meten van menselijke IgGs. Voor een ruwe schatting, SDS-pagina met een vlek van Coomassie gebaseerde als volgt gebruiken:<ol>
<li>Normen bereid door verdunning van zes maal twee-voudige een trastuzumab standaard gekwantificeerd door ELISA bij 1 mg/mL.</li>
			<li>Kook de normen en de monsters bij ongeveer 0,25 mg/mL in het verminderen van laden buffer.</li>
			<li>Lopen ze in een 4-12% Bis-Tris SDS-pagina met behulp van MES-SDS buffer en vlek met een kleurstof Coomassie gebaseerde. Tenslotte kleur dichtheid van de band die overeenkomt met het licht of de zware ketting met behulp van ImageJ meten en interpoleren van het signaal van de monsters in de standaard curve.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Opslaan van het antilichaam bij 4 ° C.</li>
</ol>2. de geconjugeerde van het antilichaam en karakteriseren van de ADC
<ol><li>Conjugaat van het antilichaam aan de tetrazine-bevattende molecuul<ol>
<li>Verdun 10 molaire equivalenten van tetrazine-vcMMAE (4 µL, 3.4 mM in dimethylsulfoxide (DMSO)) met 20 µL van acetonitril en 76 µL van PBS in een kleine conische buis (bijvoorbeeldPCR buis).</li>
		<li>Toevoegen van 1 molair equivalent van trastuzumab(CypK)2 (100 µL, 2 mg/mL in PBS), meng en laat reageren gedurende 3 uur bij kamertemperatuur (25 ° C) tot trastuzumab(MMAE)2. Opmerking: Andere moleculen zoals tetrazine-5-TAMRA kunnen worden gekoppeld aan het antilichaam in plaats van tetrazine-vcMMAE met behulp van dit protocol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zuiveren van de ADC<ol>
<li>Vooraf equilibreer een kolom grootte uitsluiting spin met PBS volgens de instructies van de fabrikant.</li>
		<li>Het gehele volume van de reactie op de spin kolom en centrifugeer bij 1500 x g gedurende 1 minuut toevoegen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kwantificeren van de ADC en analyseren van de geconjugeerde door SDS-PAGE<ol>
<li>Kwantificeren van de ADC zoals beschreven in 1.3.2. door het meten van de dichtheid van de kleur van de lichtketting op een SDS-pagina met behulp van het ongemodificeerde antilichaam voor de standaard curve.</li>
		<li>De zware keten moet iets hebben verschoven een verhoging in molecuulgewicht op de vervoeging tonen. Opmerking: Als het antilichaam wordt gewijzigd met een fluorophore zoals in trastuzumab(TAMRA)2, alleen de band die overeenkomt met de zware ketting moet weergeven in-gel fluorescentie voordat kleuring</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyseren van de geconjugeerde door HPLC-HIC<ol>
<li>De HPLC-HIC-kolom met 100% buffer A equilibreer (1,5 M (NH4)2SO4, 50 mM natriumfosfaat pH 7.0, 5% isopropanol) gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Mix 15 µL (67 pmol) van een 1 mg/mL oplossing van trastuzumab (CypK) 2 met 15 µL van 2 x buffer A in een flesje. Vervolgens program een 10 µL injectie in de HPLC.</li>
		<li>Elueer in een isocratic 1 mL/min stroom met een 100% buffer A voor 1 min, gevolgd door een 15 min verloop van 100 tot 0% voor buffer A in B (50 mM natriumfosfaat pH 7.0, 20% isopropanol). Controleren van de elutie op 280 nm.</li>
		<li>Bereken de DAR door de integratie van de piek overeenkomt met elke soort en het gebruik van de resulterende gebieden in de volgende vergelijking: DAR = (1 x trastuzumab(MMAE) + 2 x trastuzumab(MMAE)2) trastuzumab(MMAE)1 /(trastuzumab(MMAE)0 + trastuzumab(MMAE)-2) Verwachte retentietijd voor trastuzumab(CypK)2 is 7.5-8.0 min, want trastuzumab (CypK, MMAE) 9.1-9.6 min is, en voor trastuzumab(MMAE)2 10.5-11.0 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyseren van de geconjugeerde door LC-MS<ol>
<li>Deglycosylate 30 µL van 1 mg/mL ADC en het ongewijzigde antilichaam in niet-reducerende omstandigheden met behulp van 250 PNGase F eenheden voor ten minste 6 uur bij 37 ° C.</li>
		<li>Elueer het antilichaam in de massaspectrometer in een C4 1-5 µm 1.0 x 100 mm kolom met behulp van een helling van 20 min van 2% tot 80% acetonitril in water. Gegevens over het bereik van een m/z van 350-4000 in de modus van het positieve ion met een spanning van de kegel van 150v verwerven.</li>
		<li>Deconvolute van de ruwe gegevens met behulp van de juiste software. Bereken het verschil in massa tussen de gewijzigde en de ongewijzigde antilichamen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. assay stabiliteit van de koppeling van de Dihydropyridazine in Trastuzumab(TAMRA),2 in Serum
<ol><li>Filteren van het serum met behulp van een filter 0,22 μm onder steriele omstandigheden. U kunt 100 eenheden/mL penicilline, en 100 μg/mL streptomycine.</li>
	<li>De externe wells van een 96-wells-plaat met water vullen. In de centrale putten, Meng in drievoudige 90 µL van gefilterde serum met 10 µL van 1 mg/mL trastuzumab(TAMRA)2 in PBS op een eindconcentratie van 0,1 mg/mL. Plaats de plaat in een incubator verzadigd met vochtigheid bij 37 ° C en 4-5% CO2.</li>
	<li>Elke 24 uur gedurende 5 dagen, Pipetteer elke goed grondig te mengen, neem een 5 µL aliquoot, flash-bevriezen met vloeibare stikstof, en opslaan bij-80 ° C.</li>
	<li>Zodra alle monsters verzameld zijn, de aliquots ontdooien en analyseren met behulp van een indirecte ELISA zoals eerder gemeld12 met enkele wijzigingen:<ol>
<li>Jas van een 96-wells-plaat overnachting met 0,25 µg/mL HER2 bij 4 ° C. Alle andere stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Op de volgende dag, 5 keer wassen met PBS 0,05% tween (PBS-T) en blokkeren met 1% bovien serumalbumine gedurende 1 uur.</li>
		<li>Wassen en de monsters bij verdunning van de 1:10000 in PBS voor 2 h uit te broeden.</li>
		<li>Wassen en een anti-TAMRA antilichaam aan de orde gesteld in muis bij 1:2000 verdunning in PBS-T met 0,5% BSA voor 1 h uit te broeden.</li>
		<li>Wassen en een anti-muis HRP-geconjugeerde 1:1000 in PBS-T met 0,5% BSA voor 1 h uit te broeden.</li>
		<li>Voeg TMB en laat om te reageren op 5-10 min.</li>
		<li>Stop reactie met 50 µL H2dus4 op 1 M en maatregel absorptie bij 450 nm. Aftrekken van de achtergrond gemeten bij 570 nm.</li>
		<li>Kromme die past een 4-parameter logistische regressie bij standaard verdunningen en interpoleren metingen van monsters. Opmerking: De stabiliteit van trastuzumab(MMAE)2 kan worden beoordeeld met behulp van hetzelfde protocol door het veranderen van de bepaling die is beschreven in punt 3.3 voor een commerciële ELISA-kit voor het meten van de concentratie van de ADC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. beoordeling van de cytotoxiciteit van de ADC
Opmerking: Dit protocol is gebaseerd op de eerder gemelde assays23,26 met enkele wijzigingen.
<ol><li>Ontdooi SK-BR-3 en MCF-7 cellen en laten zich te vestigen in p25 kolven met volledige medium, dat wil zeggen DMEM aangevuld met 10% warmte geïnactiveerd foetale runderserum, 100 eenheden/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine.</li>
	<li>Hiermee splitst u cellen bij 80-90% samenvloeiing (elke 3-4 dagen) minstens 2 maal vóór de bepaling.</li>
	<li>Twee dagen voorafgaand aan de test, de buitenste wells van een 96-wells-plaat met water vullen. Vervolgens lift cellen met 0,05% trypsine in 0.5 mM EDTA, centrifuge 3 min 250 x g resuspendeer in nieuw medium en zaad van 3000 cellen in 100 µL per putje van de (lege) in de 96-wells-platen.</li>
	<li>Twee dagen na het zaaien van de cellen, maak 10 seriële verdunningen van alle monsters in drievoud met 0,1% DMSO in volledige medium. Overweeg de volgende monsters en besturingselementen: trastuzumab(MMAE)2, trastuzumab(CypK)2, trastuzumab wild type, tetrazine-vcMMAE en MMAE.</li>
	<li>Voeg 100 µL van elk monster in elk putje en incubeer gedurende 5 dagen bij 37 ° C en 4-5% CO2.</li>
	<li>Op dag 5, meet u de levensvatbaarheid van de cellen. Te dien einde gebruik een commerciële kit lyse de cellen en meten van de ATP uitgebracht. Het percentage van signaal met betrekking tot de controle cellen behandeld met 0,1% DMSO uitzetten. Opmerking: ADCs kunnen worden gedurende 5 dagen in serum geïncubeerd en vehiculumcontrolegroep cytotoxiciteit te bewijzen van functionele stabiliteit. Let op: De MMAE is zeer giftig. Daarom gebruiken handschoenen en bril bij het verwerken van MMAE derivaten. Als u ongewijzigde MMAE als een besturingselement in uw experiment, gebruikt bij het voorbereiden van de stockoplossing in DMSO, omgaan met de solide product in een zuurkast.</li>
</ol>

<ol><li>Beck, A., Goetsch, L., Dumontet, C., Corvaia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+and+challenges+for+the+next+generation+of+antibody-drug+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Strategies and challenges for the next generation of antibody-drug conjugates.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (5), 315-337 (2017).</li>
<li>Wakankar, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+Stability+of+the+Antibody%E2%88%92Drug+Conjugate+Trastuzumab-DM1%3A+Changes+due+to+Modification+and+Conjugation+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Physicochemical Stability of the Antibody−Drug Conjugate Trastuzumab-DM1: Changes due to Modification and Conjugation Processes.</a> Bioconjugate Chemistry. 21 (9), 1588-1595 (2010).</li>
<li>Stan, A. C., Radu, D. L., Casares, S., Bona, C. A., Brumeanu, T. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antineoplastic+Efficacy+of+Doxorubicin+Enzymatically+Assembled+on+Galactose+Residues+of+a+Monoclonal+Antibody+Specific+for+the+Carcinoembryonic+Antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Antineoplastic Efficacy of Doxorubicin Enzymatically Assembled on Galactose Residues of a Monoclonal Antibody Specific for the Carcinoembryonic Antigen.</a> Cancer Research. 59 (1), 115-121 (1999).</li>
<li>Hamblett, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Drug+Loading+on+the+Antitumor+Activity+of+a+Monoclonal+Antibody+Drug+Conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of Drug Loading on the Antitumor Activity of a Monoclonal Antibody Drug Conjugate.</a> Clinical Cancer Research. 10 (20), 7063-7070 (2004).</li>
<li>Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-Drug+Conjugates%3A+An+Emerging+Concept+in+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Antibody-Drug Conjugates: An Emerging Concept in Cancer Therapy.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (15), 3796-3827 (2014).</li>
<li>Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+and+Reprogramming+the+Genetic+Code%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expanding and Reprogramming the Genetic Code.</a> Nature. 550 (7674), 53-60 (2017).</li>
<li>Axup, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Site-Specific+Antibody-Drug+Conjugates+Using+Unnatural+Amino+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Site-Specific Antibody-Drug Conjugates Using Unnatural Amino Acids.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (40), 16101-16106 (2012).</li>
<li>Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Conjugates+with+Unnatural+Amino+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Antibody Conjugates with Unnatural Amino Acids.</a> Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).</li>
<li>Tian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+General+Approach+to+Site-Specific+Antibody+Drug+Conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A General Approach to Site-Specific Antibody Drug Conjugates.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (5), 1766-1771 (2014).</li>
<li>Kern, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+Pyrophosphate+Diesters+as+Tunable%2C+Soluble%2C+and+Bioorthogonal+Linkers+for+Site-Specific+Antibody-Drug+Conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Discovery of Pyrophosphate Diesters as Tunable, Soluble, and Bioorthogonal Linkers for Site-Specific Antibody-Drug Conjugates.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (4), 1430-1445 (2016).</li>
<li>Zimmerman, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Site-Specific+Antibody-Drug+Conjugates+Using+Optimized+Non-Natural+Amino+Acids+in+a+Cell-Free+Expression+System%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Production of Site-Specific Antibody-Drug Conjugates Using Optimized Non-Natural Amino Acids in a Cell-Free Expression System.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (2), 351-361 (2014).</li>
<li>VanBrunt, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+Encoded+Azide+Containing+Amino+Acid+in+Mammalian+Cells+Enables+Site-Specific+Antibody-Drug+Conjugates+Using+Click+Cycloaddition+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Genetically Encoded Azide Containing Amino Acid in Mammalian Cells Enables Site-Specific Antibody-Drug Conjugates Using Click Cycloaddition Chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (11), 2249-2260 (2015).</li>
<li>Xiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Incorporation+of+Multiple+Unnatural+Amino+Acids+into+Proteins+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Genetic Incorporation of Multiple Unnatural Amino Acids into Proteins in Mammalian Cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (52), 14080-14083 (2013).</li>
<li>Milles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Strategies+for+Single-Molecule+Protein+Fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Click Strategies for Single-Molecule Protein Fluorescence.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (11), 5187-5195 (2012).</li>
<li>Lallana, E., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+and+Efficient+Procedures+for+the+Conjugation+of+Biomolecules+through+Huisgen+Azide-Alkyne+Cycloadditions%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Reliable and Efficient Procedures for the Conjugation of Biomolecules through Huisgen Azide-Alkyne Cycloadditions.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (38), 8794-8804 (2011).</li>
<li>Koehler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Code+Expansion+for+Multiprotein+Complex+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic Code Expansion for Multiprotein Complex Engineering.</a> Nature Methods. 13 (12), 997-1000 (2016).</li>
<li>Lyon, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Hydrophobicity+of+Homogeneous+Antibody-Drug+Conjugates+Improves+Pharmacokinetics+and+Therapeutic+Index%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Reducing Hydrophobicity of Homogeneous Antibody-Drug Conjugates Improves Pharmacokinetics and Therapeutic Index.</a> Nature Biotechnology. 33 (7), 733-735 (2015).</li>
<li>Elliott, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+Labeling+and+Protein+Identification+in+Specific+Tissues+and+at+Specific+Developmental+Stages+in+an+Animal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Proteome Labeling and Protein Identification in Specific Tissues and at Specific Developmental Stages in an Animal.</a> Nature Biotechnology. 32, 465-472 (2014).</li>
<li>Ravasco, J. M. J. M., Monteiro, C. M., Trindade, A. F. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2017/qo/c7qo00054e">Cyclopropenes: A New Tool for the Study of Biological Systems.</a> Organic Chemistry Frontiers. 4 (6), 1167-1198 (2017).</li>
<li>Yang, J., Šečkutė, J., Cole, C. M., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-Cell+Imaging+of+Cyclopropene+Tags+with+Fluorogenic+Tetrazine+Cycloadditions%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Live-Cell Imaging of Cyclopropene Tags with Fluorogenic Tetrazine Cycloadditions.</a> Angewandte Chemie International Edition. 124 (30), 7594-7597 (2012).</li>
<li>Oller-Salvia, B., Kym, G., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+Efficient+Generation+of+Stable+Antibody-Drug+Conjugates+via+an+Encoded+Cyclopropene+and+an+Inverse-Electron-Demand+Diels-Alder+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Rapid and Efficient Generation of Stable Antibody-Drug Conjugates via an Encoded Cyclopropene and an Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reaction.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57, 2831-2834 (2018).</li>
<li>Schmied, W. H., Elsässer, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Multisite+Unnatural+Amino+Acid+Incorporation+in+Mammalian+Cells+via+Optimized+Pyrrolysyl+tRNA+Synthetase%2FtRNA+Expression+and+Engineered+eRF1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Efficient Multisite Unnatural Amino Acid Incorporation in Mammalian Cells via Optimized Pyrrolysyl tRNA Synthetase/tRNA Expression and Engineered eRF1.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (44), 15577-15583 (2014).</li>
<li>Junutula, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-Specific+Conjugation+of+a+Cytotoxic+Drug+to+an+Antibody+Improves+the+Therapeutic+Index%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Site-Specific Conjugation of a Cytotoxic Drug to an Antibody Improves the Therapeutic Index.</a> Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).</li>
<li>Junutula, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Identification+of+Reactive+Cysteine+Residues+for+Site-Specific+Labeling+of+Antibody-Fabs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid Identification of Reactive Cysteine Residues for Site-Specific Labeling of Antibody-Fabs.</a> Journal of Immunological Methods. 332 (1), 41-52 (2008).</li>
<li>Doronina, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+potent+monoclonal+antibody+auristatin+conjugates+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy.</a> Nature Biotechnology. 21 (7), 778-784 (2003).</li>
<li>Shiraishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Highly+Reactive+Cysteine+Residues+at+Less+Exposed+Positions+in+the+Fab+Constant+Region+for+Site-Specific+Conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of Highly Reactive Cysteine Residues at Less Exposed Positions in the Fab Constant Region for Site-Specific Conjugation.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (6), 1032-1040 (2015).</li>
<li>Sabourin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+Antibody+Yield+and+Modulating+Final+Product+Quality+using+the+Freedom%28TM%29%5BTitle%5D)+AND+%22CHO-S%28TM%29+Production+Platform.+BMC+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Increasing Antibody Yield and Modulating Final Product Quality using the Freedom(TM).</a> CHO-S(TM) Production Platform. BMC Proceedings. 5 (8), 102(2011).</li>
<li>Xiao, Y., Gao, X., Maragh, S., Telford, W. G., Tona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Lines+as+Candidate+Reference+Materials+for+Quality+Control+of+ERBB2+Amplification+and+Expression+Assays+in+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cell Lines as Candidate Reference Materials for Quality Control of ERBB2 Amplification and Expression Assays in Breast Cancer.</a> Clinical Chemistry. 55 (7), 1307-1315 (2009).</li>
<li>Shinmi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-Step+Conjugation+Method+for+Site-Specific+Antibody-Drug+Conjugates+through+Reactive+Cysteine-Engineered+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">One-Step Conjugation Method for Site-Specific Antibody-Drug Conjugates through Reactive Cysteine-Engineered Antibodies.</a> Bioconjugate Chemistry. 27 (5), 1324-1331 (2016).</li>
<li>Badescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+Disulfides+for+Stable+and+Defined+Antibody+Drug+Conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bridging Disulfides for Stable and Defined Antibody Drug Conjugates.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (6), 1124-1136 (2014).</li>
<li>Vazquez-Lombardi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+of+human+antibodies+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transient expression of human antibodies in mammalian cells.</a> Nature Protocols. 13 (1), 99-117 (2018).</li>
<li>Baldi, L., Hacker, D. L., Meerschman, C., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaldi%2C+L+%22Protein+Expression+in+Mammalian+Cells%3A+Methods+and+Protocols%22">Protein Expression in Mammalian Cells: Methods and Protocols</a>. Hartley, J. L. , Humana Press. 13-26 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De procedure van de voorbijgaande expressie tot trastuzumab(CypK)2 beschreven in dit protocol is eenvoudig en zorgt voor hoge modulariteit. De opbrengsten die verkregen zijn binnen degene verwacht in een academische instelling27 en stabiele cellijnen kunnen worden gegenereerd om te verder stimuleren de productie opbrengst21. Tijdens de expressie lagere concentraties van CypK dan 5 mM in lagere ncAA opneming resulteren kan, en hogere bedragen kunnen beïnvloeden van celgroei en verlagen van antilichaam opbrengsten. CypK als een vrije aminozuur heeft laag water oplosbaarheid, dus het moet eerst ontbonden op 100 mM in 0,1 M NaOH en vervolgens toegevoegd aan het kweekmedium. Na verdunnen CypK op middellange en voordat u het aan cellen toevoegt, is het essentieel om te neutraliseren het medium met de HCl en filter te steriliseren. Vervolgens met behulp van de transfectie reagentia opgegeven in dit protocol en na de incubatie tijd die door de fabrikant aanbevolen is belangrijk voor een hoge opbrengst-expressie. Voor meer informatie over de voorbijgaande expressie van menselijke antilichamen, wordt de lezer verwezen naar andere gepubliceerde protocollen31,32.
Wanneer het antilichaam wordt gezuiverd, is een hoge overmaat van EiwitA hars vereist zoals aangegeven om ervoor te zorgen volledige antilichaam pull-down van de bovendrijvende substantie. Om te voorkomen dat de neerslag van trastuzumab tijdens elutie, is het aan te bevelen te gebruiken van een oplossing met hoge buffer capaciteit, verdunde onmiddellijk met PBS en de buffer voor het vermijden van buitensporige concentratie te wisselen. Houd altijd het antilichaam < 5 mg/mL.
De vervoeging van trastuzumab(CypK)2 met tetrazine-vcMMAE is sneller dan de meeste reacties met andere bioorthogonal handvatten voor ADCs gerapporteerd. Bovendien, deze cycladdition vindt plaats onder zeer milde omstandigheden: kamertemperatuur of lager en fysiologische pH. Het is belangrijk om te verdunnen de DMSO stamoplossingen van de reactanten met acetonitril vóór toevoeging van PBS en het antilichaam; anders neerslaat de tetrazine-derivaten. Acetonitril is vereist alleen te wijten aan de hoge hydrophobicity van MMAE en TAMRA, maar minder hydrofobe moleculen wellicht niet de toevoeging van een co-solvent. Tetrazine-vcMMAE kan als alternatief worden vervoegd zonder acetonitril en slechts 2 molair equivalenten van tetrazine-vcMMAE binnen 20 uur. Deze kleine hoeveelheid toxine kan betrekking hebben op een substantiële afname van de productiekosten van ADC in vergelijking met de huidige ncAA gebaseerde technologieën. Trastuzumab(CypK)2 is volledig reactief gedurende ten minste 4 maanden wanneer bewaard bij 4 ° C.
HPLC-HIC kunt een nauwkeurige bepaling van DAR aangezien MMAE zeer hydrofobe is en biedt een uitstekende resolutie van de pieken die overeenkomt met de geconjugeerde antilichaam met 0, 1 en 2 toxines. Spoorverontreiniging tetrazine-vcMMAE GC ongeveer 13.7 min en wordt gedetecteerd bij 280 nm. Deze techniek vereist een grondstof met hoge zuiverheid. Bovendien, het is niet aan te bevelen om de reactie met andere tetrazine-reactieve moleculen zoals BCN-OH quench aangezien zij de retentietijden en de vorm van de pieken veranderen kunnen. Het is essentieel dat de zoutconcentratie van de monsters overeenkomt met de in de mobiele fase aan het begin van het verloop om het verkrijgen van een goede scheiding, vooral als meer dan 10-20 µL worden geïnjecteerd.
Met betrekking tot de analyse van de LC-MS is deglycosylation van de monsters van antilichaam nodig om verkijgen een één piek op deconvolutie van het ruwe spectrum. De nauwkeurigheid van de totale antilichaam en ADC massa's kan variëren afhankelijk van de kalibratie van het instrument. Vandaar, om te berekenen van de massa van de wijziging, aftrekken de massa verkregen voor de ongewijzigde antilichamen van verkregen voor de ADC. Moderne high-resolution massaspectrometers dient een relatieve fout onder 1:10000. Hoewel LC-MS kan ook worden gebruikt voor de berekening van de verhouding tussen de verschillende soorten, is deze waarde meestal een overschatting omdat de wijziging van invloed kan zijn op de capaciteit van ionisatie van de soorten gegenereerd en lage hoeveelheid onzuiverheden worden niet gedetecteerd.
De stabiliteit van de linker in ADCs is essentieel, omdat de voortijdige vrijlating van de drug in hogere toxiciteit en lagere werkzaamheid resulteert; de gratis cytotoxin schade gezonde weefsels en de naakte antilichaam concurreert met de gewapende is voor de doelgroep bandplaatsen op zieke cellen. Een release minder dan 5%, die binnen de variabiliteit van de bepaling van de stabiliteit, mag worden verwacht.
Tot slot de selectiviteit van een ADC targeting HER2 zoals trastuzumab(MMAE)2 kan worden beoordeeld door vergelijking van de cytotoxiciteit wordt in SK-BR-3 cellen (HER2 hoog) en MCF-7 cellen (HER2 lage) sinds de laatste 15-fold minder HER2-receptoren dan de voormalige28 express . De immunoconjugate naar verwachting leiden tot in een levensvatbaarheid van de cellen ten minste 2 ordes van grootte lager in SK-BR-3 vergeleken met MCF-7. De EG-50 in SK-BR-3 moeten in het bereik van de twee-cijferige nanomolar als gevolg van de hoge potentie van deze ADC29,30. Het ongewijzigde antilichaam, trastuzumab(MMAE)2 of trastuzumab, geen toxiciteit in deze test moet weergeven. Tetrazine-vcMMAE moet een effect 3 ordes van grootte lager dan de ADC aangezien de linker de activiteit van de toxine van het peptidomimetic verwijdert. Omgekeerd, omdat MMAE kunnen doordringen in het celmembraan30 is, het moet hebben een gelijkaardige toxiciteit voor de ADC maar geen discriminatie tussen HER2 hoge en lage cellijnen HER2 weergeven. Bovendien, als deze test wordt uitgevoerd na een 5-daagse incubatie van de ADC in serum, het kan worden gebruikt een functionele bewijs levert voor de stabiliteit van de linker: een release van de toxine zou leiden tot hetzij een afname van ADC efficiëntie van SK-BR-3 als MMAE werd uitgebracht met p kunst van de linker- of een verlaging van de selectiviteit als de linker was gekloofd in een spoorloze mode.
De technologie van de ADC hierin beschreven kunnen de efficiënte en site-specifieke opneming van een cyclopropeen afgeleide van lysine in IgG1s. Na een zuivering van de facile, antilichamen kunnen snel worden vervoegd met tetrazine-bevattende moleculen, opbrengst van homogene producten. Vanwege de kleine omvang en hoge reactiviteit van minimale handgreepsteun cyclopropeen, moet deze methode de vervoeging van sterically gehinderd payloads inschakelen. De resulterende immunoconjugates zijn stabiel in serum en zijn zeer krachtige en selectieve. CypK kunnen over het algemeen een snel en stabiel en site-specific bioorthogonal koppeling voor antilichaam en andere eiwit geconjugeerde moet worden gebruikt bij de behandeling of diagnose.

Geconjugeerde (ADCs) van de antilichaam-drug combineren de selectiviteit van het biotherapeutics en de potentie van kleine cytotoxische moleculen. Meeste ADCs streven naar het verlagen van de bijwerkingen van traditionele chemotherapie richten op geneesmiddelen die van invloed zijn op DNA of microtubuli polymerisatie op kanker cellen1. Eerste generatie ADCs goedgekeurd door de Food and Drug Administration (FDA) is afhankelijk van de wijziging van lysines en cysteines, die mengsels van moleculen die op verschillende posities met verminderde farmacokinetische eigenschappen2gewijzigd genereert. Daarentegen, kan site-specific vervoeging van drugs aan de antilichamen genereren verbindingen met verbeterde therapeutische indeces3,4. Die inspelen op de uitdaging van de productie van homogene ADCs, verschillende selectieve chemische en enzymatische wijzigingen geweest gerapporteerde1,5. Echter kunnen huidige methoden richten op alleen bepaalde positie op het antilichaam, lijden aan laag eiwit expressie, linkers voorzien van lage stabiliteit of traag en lage opbrengst reacties afhankelijk.
Opneming van de niet-canonieke aminozuren (ncAA) door middel van uitbreiding van de genetische code maakt de site-specifieke installatie van een overvloed aan bioorthogonal reactieve groepen in eiwitten, potentieel het overwinnen van de beperkingen van andere methoden die worden gebruikt voor het genereren van ADCs. NcAAs in reactie op een target (stop) codon-codering is afhankelijk van aminoacyl-tRNA synthetase/tRNA paren die loodrecht op de endogene paren die canonieke aminozuren6 nemen. Verschillende ncAAs zijn overgenomen in de antilichamen voor het genereren van ADCs. Maar meest lijdt aan verschillende verplichtingen voor toepassingen in therapeutische drug Woordherkomst en-opbouw. p-acetylphenylalanine (pAcF)7,8 is niet volledig bioorthogonal, vereist lage pH (4.5) en lange reactietijden (> 60 h), terwijl aziden zoals p-azidophenylalanine (pAzF)7,9,10, p-azidomethylphenylalanine (pAMF)11, en een azide derivaat van lysine (AzK)12,13 in de cel14kunnen worden verminderd, en de koper gebruikt voor het katalyseren van Huisgen cycloaddities oxidatieve schade kan veroorzaken 15.
Hoewel alternatieve ncAAs gebaseerd op trans-Cycloocteen (TCO), cyclooctyne (SCO) en bicyclo [6.1.0] none (BCN) onlangs zijn gecodeerd in een antilichaam voor bio-imaging doeleinden, de expressie systeem lijdt aan zeer lage opbrengst (0,5 mg/L)-16. Bovendien, cyclooctenes en cyclooctynes zijn groot en hydrofobe grepen die kunnen het verhogen van de gevoeligheid van de ADC voor aggregatie -ADC laadvermogens zijn traditioneel hydrofobe en de fysisch-chemische eigenschappen van de linker is aangetoond dat ze sterk invloed op de farmacokinetiek en de therapeutische index17. Daarentegen zijn 1,3-disubstitued cyclopropenes kleine reactieve groepen die minimale verandering in de eiwit structuur en physichochemical eigenschappen18moeten veroorzaken. Cyclopropenes reageren selectief en snel met tetrazines via een omgekeerde elektron-vraag Diels-Alder cycloadditie19. In dit protocol maken we gebruik van een derivaat van lysine (CypK, Figuur 1b) lager een methyl-cyclopropeen thats minder beïnvloed door sterische hinder dan grotere gespannen onverzadigde cycli en heeft een constante snelheid reactie in de volgorde van 1.30 M-1s -1 in waterige media18,20.
Onlangs berichtten we hoe CypK geïntegreerd antilichamen voor het genereren van ADCs door dit minimale bioorthogonal handvat met tetrazine-bevattende moleculen21te reageren. Hier beschrijven we de ADC voorbereiding procedure meer in detail met nadruk op de meest uitdagende stappen. De opneming van CypK wordt geleid met behulp van een pyrrolysyl-tRNA synthetase (PylRS) / tRNACUA(PylT) koppelen in reactie op een amber codon geïntroduceerd in de zware keten van antilichaam (HC)22. We gebruiken hier twee plasmiden voorbijgaande transfectie (Figuur 1a), de zware keten van het antilichaam-codering en de andere de lichtketting (LC), zowel die van de cassette PylRS/PylT coderen. Anderzijds kan een stabiele cellijn waarmee hogere antilichaam opbrengsten worden gegenereerd door middel van een meer moeizame procedure21.
De bovengenoemde expressiesystemen kunnen produceren de therapeutische anti-HER2 immunoglobulin 1 (IgG1) met CypK op vergelijkbare niveaus het wild type antilichaam trastuzumab. We kozen de eerste positie van het domein van CH1 op de zware ketting voor het coderen van de ncAA (HC-118TAG). Dit is de meest voorkomende gemodificeerde site in ADCs23 en staat bekend als HC-118 (EU nummering) maar heeft ook aangeduid als HC-121 (de positie van de reeks) en HC-114 (Kabat nummering)24. Aangezien dit standpunt wordt bewaard gedurende alle IgG1s, moeten deze expressiesystemen worden vatbaar voor meest therapeutische antistoffen.
Laten we trastuzumab(CypK)2 kunt gemakkelijk gezuiverd worden door eiwit een gevolgd door snelle proteïne vloeistofchromatografie met een hydrofobe interactie kolom (FPLC-HIC). Vervolgens is het antilichaam covalent gekoppeld binnen 3 uur naar de microtubuli polymerisatie remmer monomethylether auristatin E (MMAE), die wordt gebruikt in de FDA-goedgekeurde ADC Adcetris. Hier gebruiken we een benzyl-tetrazine-derivaat van MMAE (tetrazine-vcMMAE) met een linker bestaande uit een glutarate spacer en een protease-labiele onderdeel van valine-citrulline, gevolgd door een p- aminobenzylalcohol self-immolative eenheid; Deze linker is gekloofd door Cathepsin B in het lysosoom op de internalisering van de ADC resulterend in de spoorloze release van de toxine25. Om aan te tonen de brede opzet van de reactie, dat het antilichaam is ook gekoppeld aan de fluorophore tetramethylrhodamine (TAMRA). Wij leggen uit hoe om te controleren de identiteit van de geconjugeerde door vloeibare chromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (LC-MS) en voor het berekenen van de drug-naar-antilichaam ratio (DAR) met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie met een hydrofobe interactie kolom (HPLC-HIC) .
Als onderdeel van de karakterisering van de antilichaam-prestaties beschrijven we hoe te testen van de stabiliteit van de koppeling van de dihydropyridazine in menselijk serum. Deze parameter is gemakkelijker in trastuzumab-TAMRA beoordeeld omdat het door een eenvoudige ELISA kan worden gekwantificeerd en de interpretatie van de resultaten niet wordt bemoeilijkt door de protease labile component van trastuzumab(MMAE)2. Tot slot wordt de selectiviteit en de werkzaamheid van trastuzumab(MMAE)2 beoordeeld door vergelijking van de cytotoxiciteit van de ADC over cellijnen uiting van verschillende niveaus van HER2. Deze bepaling biedt ook een functionele bewijs van de stabiliteit van de ADC wanneer uitgevoerd na het broeden van de immunoconjugate in menselijk serum.

<table><tbody><tr><td>Expi293F</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A14527</td><td>HEK suspensiecellen</td></tr><tr><td>Expi293 Expression Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1435101</td><td>Expressiemedium</td></tr><tr><td>Antibiotic-antimycotic</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15240062</td><td>Penicilline-streptomycine-amfotericine B</td></tr><tr><td>125mL Polycarbonaat Erlenmeyer Kolb met Vent Cap</td><td>Corning</td><td>431143</td><td>Schudkolven</td></tr><tr><td>Brunswick S41i incubator</td><td>Eppendorf</td><td>S41I230011</td><td>CO2-incubator met schudder</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide 4 mol/l (4 N) in waterige oplossing</td><td>VWR</td><td>191373M</td><td></td></tr><tr><td>Cyclopropeen lysine</td><td>Sichem</td><td>SC-8017</td><td>In deze studie werd het gesynthetiseerd zoals beschreven door Elliot et al. 2014</td></tr><tr><td>Steriflip-GP, 0,22 &micro;m, polyethersulfone, gamma bestraald</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM, Reduced Serum Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985070</td><td>Medium met verminderd serum</td></tr><tr><td>ExpiFectamine 293 Transfectie Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A14525</td><td>Transfectie reagens</td></tr><tr><td>5810 R centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5811000460</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP Spuitfilter Unit, 0,22 &micro;m, polyethersulfone, 33 mm, gamma gesteriliseerd</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Proteïne A hars</td><td>Sino Biological</td><td>10600-P07E-RN-25</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Prep Chromatografie Kolommen, Pak van 50</td><td>Bio-Rad</td><td>7311550</td><td>Polypropyleen chromatografie kolom</td></tr><tr><td>Econo-Column Trechter</td><td>Bio-Rad</td><td>7310003</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitraat</td><td>Fluka</td><td>71635</td><td></td></tr><tr><td>&Auml;KTA explorer FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiTrap HIC Selectie Kit</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4110-07</td><td>Inclusief HiTrap 1 mL Butyl HP</td></tr><tr><td>Ammoniumsulfaat</td><td>VWR</td><td>2133.296</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Honywell</td><td>34863-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Tetrazine-vcMMAE</td><td>ChemPartner</td><td>-</td><td>Op bestelling gesynthetiseerd</td></tr><tr><td>Tetrazine-5-TAMRA</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-017-05</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel 1,0mm x 10 putjes</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>UltiMate 3000 HPLC</td><td>ThermoFisherScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific MAbPac, HIC-20, 4,6 x 100 mm, 5 &micro;m</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>088553</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>New England BioLabs</td><td>P0704S</td><td></td></tr><tr><td>NanoAcquity</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C4 BEH 1-5 &micro;m 1,0 x 100 mm UPLC kolom&nbsp;</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well microplates voor celcultuur</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>156545</td><td></td></tr><tr><td>Humain serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4522-20mL</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Panasonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HER2 ECD</td><td>Sino Biological</td><td>10004-HCCH</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TAMRA</td><td>Abcam</td><td>an171120</td><td></td></tr><tr><td>Anti-muis HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>TMB</td><td>BioLengend</td><td>421101</td><td></td></tr><tr><td>Zwavelzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84727-500ML</td><td></td></tr><tr><td>PHERAstar FS</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>Platelezer</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5671-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SK-BR-3</td><td>ATCC</td><td>HTB-30</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>CellTiterGlo 2.0 Assay</td><td>Promega</td><td>G9242</td><td>Celviabiliteitstest op basis van de meting van ATP vrijgegeven na cellyse. Het uitvoersignaal is luminescentie.</td></tr><tr><td>Monomethyl Auristatin E</td><td>Cayman Chemical</td><td>16267</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>ThermoFisherScientific</td><td></td><td>Microvolume spectrofotometer</td></tr><tr><td>Human IgG ELISA Kwantificatie Set</td><td>Bethyl</td><td>E80-104</td><td></td></tr><tr><td>MaxEnt1 in MassLynx</td><td>Waters</td><td></td><td>Software toepassing voor massaspectrum deconvolutie</td></tr><tr><td>IntantBlue</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td>Coomassie-gebaseerde kleurstof</td></tr><tr><td>Intact MMAE-ADC ELISA Kit (Sandwich Assay)</td><td>Epitope Diagnostics, Inc.</td><td>KTR 782</td><td></td></tr><tr><td>Buis 50 mL, 114x28mm, PP</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>Conische buis</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Centrifugaal Filter Units 50.000 NMWL</td><td>Merck</td><td>UFC905024</td><td>Centrifugatie filtratie concentrator (naar protein A pull down)</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Centrifugaal Filter Units 50.000 NMWL</td><td>Merck</td><td>UFC805024</td><td>Centrifugatie filtratie concentratoren (naar FPLC of HPLC zuivering)</td></tr><tr><td>Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0,5 mL</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>89882</td><td>Grootte uitsluiting spin kolommen</td></tr><tr><td>Tube PCR 0,2ml Platte Dop</td><td>Thistle Scientific Ltd</td><td>AX-PCR-02-C-CS</td><td>PCR buisjes</td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp&ordf; platte bodem</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>44-2404-21</td><td>Platen voor ELISA</td></tr></tbody></table>

genetische codering van een niet-canonieke aminozuur voor de generatie van antilichaam-drug conjugaten door een snel bioorthogonal reactie

Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction

Antilichaam-drug geconjugeerde (ADCs) tegenwoordig wordt gebruikt in de klinische praktijk zijn mengsels van antilichamenmolecules gekoppeld aan een wisselend aantal toxines op verschillende posities. Preklinische studies hebben aangetoond dat het therapeutische index van deze traditionele ADCs kan worden verbeterd door de sitespecifieke koppeling van toxines. Huidige benaderingen van homogene ADCs produceren echter verschillende beperkingen, zoals lage eiwit expressie en langzame reactiekinetiek. In dit protocol beschrijven we hoe u een expressie systeem een cyclopropeen derivaat van lysine (CypK) geïntegreerd antilichamen met behulp van genetische code uitbreiding. Dit minimale bioorthogonal handvat kunt snelle vervoeging van tetrazine derivaten via een Diels-Alder-cycloadditie van inverse-vraag. Het systeem van de expressie hier gemeld kan de facile productie en zuivering van trastuzumab rekening houdend met CypK in elk van de zware kettingen. Wij leggen uit hoe het antilichaam de toxine monomethylether auristatin E koppelen en karakteriseren van het immunoconjugate door de hydrofobe interactie chromatografie en massaspectrometrie. Ten slotte, beschrijven we testen om te beoordelen van de stabiliteit in menselijk serum van de koppeling van de dihydropyridazine die voortvloeien uit de vervoeging en voor het testen van de selectieve cytotoxiciteit van de ADC voor borstkankercellen met hoge niveaus van de HER2 receptor.

De gerapporteerde voorbijgaande expressie systeem (Figuur 1a) levert 22 ± 2 mg trastuzumab(CypK),2 per liter kweekmedium, die 2/3 van het wild type antilichaam geproduceerd onder dezelfde voorwaarden (Figuur 1 c vertegenwoordigt). De stabiele cellijn kan dit rendement tot 31 ± 2 mg/L21verhogen.
Trastuzumab(CypK)2 kan worden vervoegd met tetrazine-vcMMAE, die quasi homogene trastuzumab(MMAE)2 binnen 3 uur bij 25 ° C (Figuur 2 levert). De hoge hydrophobicity van deze cytotoxin vereist toevoeging van 10% acetonitril bij 5 of meer molaire equivalenten van toxine per CypK worden gebruikt. U kunt ook is de cycloadditie ook binnen 20 h met gebruikmaking van 2 equivalenten van tetrazine-vcMMAE zonder acetonitril (Figuur 2 c) voltooid. Trastuzumab(CypK)2 reageert met tetrazine-TAMRA binnen 2 uur bij 25 ° C en 3-6 h zijn vereist wanneer de temperatuur daalt tot 4 ° C (Figuur 3 c).
De verwachte DAR voor trastuzumab(MMAE)2 gemeten door HPLC-HIC is 1,9 (Figuur 2b). De aanvankelijk piek in het chromatogram op 8.0 min het unconjugated antilichaam (DAR 0) vertegenwoordigt en volledig verdwenen moet zijn wanneer de reactie is voltooid. De soorten met DAR 1 GC op 9.1-9.6 min en moet een gebied < 10% na 3 uur; en het doelproduct met DAR 2 heeft een retentietijd van 10.5-11.0 met een verwachte gebied > 90%. De verschuiving van de mobiliteit en de fluorescentie in SDS-pagina gelen bevestigt de opneming van TAMRA (Figuur 3b) en de identiteit van de immunoconjugates wordt gecontroleerd door LC-MS (figuur 2d-e en figuur 3d).
Incubatie van trastuzumab(TAMRA)2 voor 5 dagen in menselijk serum en latere analyse door ELISA bevestigt dat de nettolading verbonden met het antilichaam (figuur 4b blijft). Met betrekking tot de bepaling van de cytotoxiciteit, trastuzumab(MMAE)2 toont hoge potentie in SK-BR-3 (HER2 hoge) borst kankercellen, met een halve maximale effectieve concentratie (EG50) van 55 ± 10 pM (Figuur 4 d). Trastuzumab(MMAE)2 onderhoudt de cytotoxiciteit na 5 dagen incubatie in menselijk serum (Figuur 4 c). Omgekeerd, wanneer de ADC is vehiculumcontrolegroep op MCF-7 (HER2 laag) de EG50 is 200-fold (Figuur 4 d) verlagen. De wild type antilichaam en trastuzumab(CypK)2 tetrazine-vcMMAE tonen uiterst lage toxiciteit (figuren 4 d en 4e), terwijl MMAE hoge niet-selectieve cytotoxiciteit wordt weergegeven in beide cellijnen (figuur 4e).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58066/58066fig1.jpg"> Figuur 1: voorbijgaande expressie systeem. A. relevante regio's van de plasmiden gebruikt voor voorbijgaande transfectie in HEK293 cellen. CMV: cytomegalovirus promotor, WPRE: Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional regelgevende Element, PylT: pyrrolysyl tRNA, U6: specifieke promotor, PylRS: pyrrolysil tRNA synthetase, > en <: richting van transcriptie. B. Nε-[((2-methylcycloprop-2-en-1-yl)methoxy)carbonyl]-L-lysine (CypK). C. expressie opbrengsten van wild type (WT) trastuzumab en trastuzumab(CypK)2 uitgedrukt in een western blot na eiwit een zuivering. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van biologische triplicates. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van Oller-Salvia et al. 2018-21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58066/58066fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58066/58066fig2.jpg"> Figuur 2: Vervoeging van trastuzumab(CypK)2 met tetrazine-vcMMAE. A. Inverse elektron-vraag Diels-Alder cycloadditie tussen het residu van de CypK in het antilichaam en de tetrazine-afgeleide van MMAE. De reagerende groepen worden gemarkeerd in het rood, p- aminobenzylalcohol is afgebeeld in groen en de valine-citrulline dipeptide in blauw. B. HPLC-HIC chromatogrammen toont de voortgang van de vervoeging van antilichaam. C. mate van omzetting met betrekking tot het maximale DAR van 1.9 met behulp van verschillende reagens concentraties. D-E. Deconvoluted massaspectra van het full-length antilichaam voor en na de vervoeging. Trastuzumab(CypK)2 werd verkregen met behulp van de stabiele cellijn. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van Oller-Salvia et al. 2018-21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58066/58066fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58066/58066fig3.jpg"> Figuur 3: Vervoeging van trastuzumab(CypK)2 met tetrazine-TAMRA. A. Inverse elektron-vraag Diels-Alder cycloadditie tussen het residu van de CypK in het antilichaam en de tetrazine-afgeleide van TAMRA. B. SDS-pagina gels met de verschuiving van de mobiliteit en de in-gel-fluorescentie ontstaan door de vervoeging van TAMRA. C. vervoeging kinetiek bij twee verschillende temperaturen. D. Deconvoluted massaspectrum van trastuzumab(TAMRA)2. Trastuzumab(CypK)2 werd verkregen met behulp van de stabiele cellijn. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van Oller-Salvia et al. 2018-21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58066/58066fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58066/58066fig4.jpg"> Figuur 4: stabiliteit in serum en cytotoxiciteit van trastuzumab geconjugeerde. A. Cartoon markeren de functies gewenst in een internalizing ADC. B. stabiliteit voor trastuzumab(TAMRA)2 in menselijk serum zoals gemeten in ELISA. C. de bepaling van de levensvatbaarheid van het cel met trastuzumab(MMAE)2 na 5 dagen in menselijk serum (+ serum, zwart). Een controlemonster geïncubeerd in PBS in plaats van serum (-serum, rode) werd opgenomen in de dezelfde bepaling. D. de bepaling van de levensvatbaarheid van het cel met vers verdunde antilichaam monsters. E. cel levensvatbaarheid assay met vers verdunde MMAE derivaten. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde van 3 onafhankelijke experimenten. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van Oller-Salvia et al. 2018-21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58066/58066fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Integratie van een cyclopropeen derivaat van lysine in antilichamen kan de sitespecifieke, snelle en efficiënte koppeling van tetrazine-bevattende moleculen voor het genereren van geconjugeerde antilichaam-drug.

Genetische codering van een niet-canonieke aminozuur voor de generatie van antilichaam-Drug conjugaten door een snel Bioorthogonal reactie

Antibody-drug conjugates (ADCs) used nowadays in clinical practice are mixtures of antibody molecules linked to a varying number of toxins at different ...

Deze methode biedt een belangrijk instrument op het gebied van eiwitmodificatie, waardoor de facile en efficiënte generatie van antilichaammedicijn vervoeging. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn het gebruiksgemak, de hoge opbrengst van de antilichaamproductie, de snelheid van de psychodisionreactie en de stabiliteit van de gevormde koppeling. Begin deze procedure met groeiende HEK-suspensiecellen zoals beschreven in het tekstprotocol.Wanneer de dichtheid van 2,5 miljoen cellen per milliliter wordt bereikt, bereidt u een nieuwe oplossing voor van het cyclopropeenderivaat van lysine, of CpK, in 1 molaire natriumhydroxide. Voeg 2,5 milliliter CpK toe aan expressiemedium aangevuld met antibiotica. Meng de oplossing goed en voeg 250 microliters van één kies HCl toe en steriliseer de oplossing met een filter van 22 micron.Centrifuge nu 125 miljoen cellen op de doeldichtheid gedurende vijf minuten op 500 x g. Voeg na centrifugatie het DNA-transfectiereagensammengsel toe aan het expressiemedium dat CpK bevat en gebruik dit medium om de cellen opnieuw op te splitsen. Zes tot zeven dagen na toevoeging van CpK, oogst de trastuzumab met CpK-antilichamen uit de supernatant door de cellen 15 minuten te centrifugeren bij 3,000 x g.Vervolgens filtert u de supernatant. Voeg nu 5x kraalwasbuffer toe in 250 milliliter conische buizen en meng met de supernatant en voeg het voorbedachteïne-eiwit A-hars toe. Plaats de conische buis drie uur op een roller bij kamertemperatuur om het antilichaam en het supernatant naar beneden te trekken.Na incubatie, breng eiwit A hars met de supernatant in een kolom en laat de vloeistof door te stromen. Voeg vervolgens 25 milliliter wasbuffer toe en laat dat doorstromen. Voeg een milliliter van één molaire fosfaatbuffer, 150 millimolar natriumchloride toe aan de opvangbuis en ontwijk het antilichaam met vier milliliter natriumcitraat van 1 molaire citraat pH 3.De zure oplossing wordt onmiddellijk geneutraliseerd als het komt uit de kolom door de basisoplossing al aanwezig in de collectie buis. Verdun vervolgens het antilichaam met 10 milliliter PBS. Concentreer het antilichaam tot 5 tot 1 milliliter door centrifugale filtratie en wissel de buffer drie keer uit met PBS.Zuiver de monsters door FPLC met behulp van een butylhydrofobe interactiekolom met nul tot 100% gradiënt van lage zoutbuffer in hoge zoutbuffer gedurende 30 minuten. Verzamel alle fracties en controleer de elutie op 280 nanometer. Concentreer de breuken die antilichaam bevatten door centrifugale filtratie en wissel de buffer drie keer uit met PBS.Het antilichaam kan dan worden opgeslagen op vier graden Celsius. Monomethyl auristatine E, of MMAE, is zeer giftig. Gebruik daarom handschoenen en brillen bij het hanteren van MMAE-derivaten.Als u ongewijzigde MMAE als controle gebruikt, moet u het vaste product in een rookkap hanteren bij het voorbereiden van de voorraadoplossing in de MSO. Om het antilichaam te vervoegen met tetrazinelagermolecuul, verdunt u 10 molaire equivalentie van tetrazine MMAE per antilichaam met 20 microliters acetonitril en 76 microliter PBS in een kleine conische buis. Voeg een molaire equivalent van trastuzumab lager CPK.Meng grondig en laat drie uur lang reageren bij kamertemperatuur om trastuzumab te vormen die is gekoppeld aan MMAE. Andere moleculen dan MMAE potentieel groter en meer sterically belemmerd kan worden gekoppeld aan het antilichaam met behulp van dit protocol. Voeg het hele volume van de reactie toe aan de draaikolom en centrifuge gedurende één minuut bij 1500 x g.Om de conjugaat te analyseren, moet u de HPLC HIC-kolom gedurende vijf minuten in evenwicht brengen met een zoutbuffer van 100% hoog. Meng vervolgens 15 microliters van een 1 milligram per milliliter oplossing van trastuzumab gekoppeld aan MMAE met 15 microliters van 2x hoge zoutbuffer in een flacon. Injecteer het mengsel op de HPLC-kolom.Elute in een isocratische een milliliter per minuut stroom met 100% hoge zoutbuffer voor een minuut. Volg dit met een helling van 15 minuten van 100 tot nul procent van de hoge zoutbuffer in een lage zoutbuffer. Controleer de elutie op 280 nanometer.Integreer de pieken op het chromatogram met retentietijden van respectievelijk 7,5, 9,2 en 11,5 minuten, die overeenkomen met trastuzumab met nul, één en twee geconjugeerde toxines. Ber ber nu de DAR door de gebieden van de pieken op te voegen op 9,2 minuten, die een gewicht van één en 10,5 minuten heeft, die een gewicht van twee heeft, en delen door het totale gebied van de drie pieken. Om het conjugaat door LC-MS te analyseren, deglycosylaat eerst 30 microliter van één milligram per milliliter ADC en het ongewijzigde antilichaam in niet-reducerende omstandigheden gebruikend 250 eenheden van PNGase F minstens zes uren bij 37 graden Van Celsius.Ontdooi het serum en filtreer het door een filter van 22 micron. Vul vervolgens de externe putten van een 96 putplaat met water. Meng in de centrale putten 90 microliter serum met 10 microliter van één milligram per milliliter trastuzumab tetramethylrhodamine in PBS bij een eindconcentratie van 1 milligram per milliliter.Plaats de plaat in een couveuse verzadigd met vochtigheid op 37 graden Celsius en vier procent CO2. Elke 24 uur gedurende vijf dagen, pipet elk goed te mengen en neem een vijf microliter aliquot. Flash bevriezen de aliquot met vloeibare stikstof en op te slaan op 80 graden Celsius.Zodra alle monsters zijn verzameld, ontdooien de aliquots en analyseren met behulp van een indirecte ELISA, zoals beschreven in het tekstprotocol. Als alternatief kan een commerciële ELISA-kit worden gebruikt om de concentratie van de ADC te meten. Twee dagen voor de test, vul de buitenste putten van een 96 put plaat met water.Til vervolgens cellen op met 05% trypsine in 5 millimolar EDTA. Centrifugeren de cellen drie minuten op 250 x g en resuspend in nieuw medium. Dan zaad 3,000 cellen in 100 microliter per put in 96 goed platen en plaats ze terug in de couveuse.Twee dagen na het zaaien van de cellen, bereiden seriële verdunningen van alle monsters in drievoud met 1%DMSO in compleet medium. Voeg nu 100 microliter van elk monster toe in elke put en broed gedurende vijf dagen uit bij 37 graden Celsius en vier procent CO2. Op dag vijf, meet de levensvatbaarheid van de cel.Gebruik hiervoor een commerciële kit om de cellen te lyseen en de uitgebrachte ATP te meten. Plot het percentage signaal met betrekking tot de controle cellen behandeld met 1%DMSO. ADC's kunnen worden geïncubeerd bij 37 graden Celsius gedurende vijf dagen in serum en getest voor cytotoxiciteit om functionele stabiliteit te bewijzen.Een antilichaam met een cyclopropeen handvat kan worden verkregen met behulp van deze procedure met een opbrengst van meer dan 20 milligram per liter na eiwit A zuivering. Het geproduceerde antilichaam kan snel en site-specifiek worden geconjugeerd aan een toxine met een tetrazine. Bij vervoeging van het antilichaam met een toxine, zijn de gemiddelde verhoudingen tussen geneesmiddelen en antilichamen groter dan 1,9, zoals gemeten door hydrofobe interactiechromatografie.De identiteit van de ADC wordt bevestigd door massaspectrometrie. De dihydropyridizene binding gegenereerd is stabiel in menselijk serum voor meer dan vijf dagen op 37 graden Celsius. Het antilichaam medicijn conjugaat is krachtig en doodt selectief cellen met hoge niveaus van HER2, in plaats van cellen met lage niveaus van HER2.Bovendien hebben het antilichaam zonder het toxine en het toxine dat met de tetrazine linker is gewijzigd een zeer lage toxiciteit. Het toxine alleen toont een niet-HER2 afhankelijke toxiciteit benadrukken de noodzaak van targeting om selectiviteit te bereiken. Na deze procedure kunnen we snel en efficiënt antilichaammedicatie voorbereiden voor de behandeling van tumoren.Potentieel, elk geneesmiddel gefunctionaliseerd met een tetrazine kan worden gekoppeld aan een antilichaam gericht op een kankercel biomarker. De implicaties van deze techniek gelden voor elke eiwitconjugaat die bestemd is voor therapie of diagnose.

genetic-encoding-non-canonical-amino-acid-for-generation-antibody

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

This video demonstrates the hydrophobic interaction liquid chromatography-based characterization of antibody-drug conjugates. Using a butyl ligand-based chromatography column, the antibody-drug conjugates are characterized via hydrophobic interactions with the ligand.

Butyl-Dependant Hydrophobic Interaction Liquid Chromatography: A Technique to Characterize Antibody-Drug Conjugates Based on Hydrophobic Interactions

We genetisch coderen natuurlijk aminozuur, p-azido-L-fenylalanine op verschillende gerichte posities in GPCRs en tonen de veelzijdigheid van de azidogroep in verschillende toepassingen. Deze omvatten een gerichte fotoverknoping technologie om resten in de ligand-bindingsplaats van een GPCR te identificeren, en de site-specifieke bioorthogonal modificatie van GPCR's met een peptide-epitoopmerker of fluorescente probe.

Genetisch gecodeerde Molecular Probes aan G-eiwit gekoppelde receptoren Studie

Hier wordt een procedure gepresenteerd om selectief een neuronaal eiwit te activeren met een korte lichtpuls door genetisch een foto-reactieve onnatuurlijke aminozuur te coderen in een doelneuronaal eiwit dat tot expressie wordt gebracht in neuronen in cultuur of in vivo.

Optische controle van een neuronaal proteïne met behulp van een genetisch gecodeerde Onnatuurlijke aminozuren in neuronen

Een gebruiksvriendelijk, celvrij expressieprotocol voor de residurespecifieke incorporatie van niet-canonieke aminozuuranalogen in eiwitten, inclusief downstream-analyse, wordt gepresenteerd voor medisch, farmaceutisch, structureel en functioneel onderzoek.

Residu-specifieke Opneming van noncanonical aminozuren in Eiwitten Model behulp van een<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Cell-free transcriptie-vertaalsysteem

Hier presenteren we een protocol om chemisch verkennende sondes op een specifieke plaats in een antilichaamfragment in te brengen door genetisch een azid-bevattend aminozuur in te bouwen en vervolgens het azid te koppelen aan een chemische sonde door spanningsgepromoveerde azid-alkyn cycloadditie (SPAAC).

Efficiënt en Site-specifiek antilichaam Labeling by-stam bevorderde azide-alkyn Cycloadditiereacties

Synthetische biologie waardoor de engineering van eiwitten met ongekende eigenschappen met behulp van het co-translational inbrengen van niet-canonieke aminozuren. Hier, presenteerden we hoe een spectraal rood-verschoven variant van een GFP-type fluorophore met roman fluorescentie spectroscopische eigenschappen, genoemd "goud" fluorescent proteïne (GdFP), wordt geproduceerd in E. coli via selectieve druk opneming (SPI).

Engineering 'Golden' fluorescentie door selectieve druk opneming van niet-canonieke aminozuren en eiwit analyse door massaspectrometrie en fluorescentie

Een facile fluorescentie-bepaling is bedoeld om te evalueren van de doeltreffendheid van amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA paren integratie van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen. De toepassing van ncAAs op het bestuderen van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) wordt beschreven, met inbegrip van foto-crosslinking toewijzing van bindende sites en bioorthogonal GPCR etiketten op levende cellen.

Optimaliseren van de genetische opneming van chemische sondes in GPCRs voor foto-crosslinking kartering en Bioorthogonal scheikunde in levende cellen van zoogdieren

Hier presenteren we een protocol voor de genetische opneming van L-dihydroxyphenylalanine levende van eenvoudige grondstoffen en de toepassing ervan op eiwit-vervoeging.

Genetische opneming van levende L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) en de toepassing ervan op eiwit Woordherkomst en-opbouw

In dit protocol beschrijven we de synthese van PODS, een phenyoxadiazolyl methyl-sulfon gebaseerde reagens voor de site-selectieve bevestiging van cargos aan de thiolen van biomoleculen, met name antilichamen. Daarnaast beschrijven we de synthese en de karakterisering van een Peul-bevattende bifunctionele complexvormer en zijn geconjugeerde aan een model antilichaam.

Synthese en Bioconjugation van Thiol-reactieve reagentia voor de oprichting van Site-selectief bewerkt Immunoconjugates

Genetische code uitbreiding wordt toegepast voor de introductie van een onnatuurlijk aminozuur met een biorthogonale functionele groep op een drager eiwit op een gedefinieerde site. De biorthogonale functie wordt verder gebruikt voor de plaatsselectieve koppeling van een koolhydraatantgeen om een homogeen glycoconjugaatvaccin te bieden.

Homogene Glycoconjugaat geproduceerd door gecombineerde onnatuurlijke aminozuur integratie en click-chemie voor vaccindoeleinden

Ontdek een methode voor site-specifieke modificatie van antilichamen met cyclopropeenderivaten van lysine voor de efficiënte generatie van antilichaam-drugconjugaten. Deze techniek biedt hoge opbrengst en stabiele bindingen voor gerichte kankertherapie.

Genetische codering van een niet-canonieke aminozuur voor de generatie van antilichaam-Drug conjugaten door een snel Bioorthogonal reactie (Video) | JoVE Journal

Genetische codering van een niet-canonieke aminozuur voor de generatie van antilichaam-Drug conjugaten door een snel Bioorthogonal reactie

Meer video's verkennen