Name: In Vitro Differentiatie van muis granulocyt-macrofaag-kolonie-stimulerende Factor (GM-CSF)-produceren van T-Helper (THGM) cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Leer de differentiatie van T_H GM-cellen uit naïeve CD4+ T-cellen van muizen voor immunologisch onderzoek naar ontstekingsziekten. Dit protocol genereert meer dan 50% GM-CSF producerende cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door subsidies van de nationale universiteit gezondheid systeem van Singapore (T1-2014 okt-12 en T1-2015 Sep-10).

Alle muizen gebruikt in dit protocol werden op de genetische achtergrond van C57BL/6 en gehuisvest onder specifieke pathogenen vrije voorwaarden aan de nationale universiteit van Singapore. Alle experimenten werden uitgevoerd met behulp van protocollen die zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik van het Comité van de nationale universiteit van Singapore.
1. reagens en materiële voorbereiding
<ol><li>Het bereiden van 500 mL met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 2% foetale runderserum (FBS) en 1 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA). Opmerking: Houd de buffer op ijs gedurende de hele procedure voor optimale resultaten.</li>
	<li>Bereiden van complete RPMI media RPMI 1640 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine met 50 mL. Gebruik volledige RPMI media met 50 µM β-mercaptoethanol voor de THGM celdifferentiatie. Voeg de β-mercaptoethanol in een zuurkast.</li>
	<li>7,5 mL van een mengsel van anti-CD3e antistof bereid door verdunning van de anti-CD3e geconcentreerd voorraad tot 3 μg/mL in PBS. Jas van 48-Wells-platen door 150 μl van het mengsel van antilichaam toe te voegen aan elk putje en Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende ten minste 1 uur, of bij 4 ° C's nachts.</li>
	<li>Een paar van schaar en pincet steriliseren en houd ze in 70% ethanol tussen dissecties.</li>
</ol>2. voorbereiding van lymfkliertest Splenocytes
<ol><li>Euthanaseren van de muis (van 6-8 weken oud) met behulp van een institutioneel goedgekeurde CO2 verstikking of cervicale dislocatie. Spray de muis met 70% ethanol en mounten op een polystyreen blok op zijn rug. De muis overbrengen in een biologische veiligheidskast om door te gaan met de volgende stappen.</li>
	<li>Houd de huid met behulp van een paar pincet en de huid onder de ribbenkast aan de linkerkant voor ongeveer 4 cm, met behulp van een paar van schaar te knippen. Open de peritoneale sac bloot van de milt te steriel pincet gebruiken om uit te pakken van de milt.</li>
	<li>Plaats een 70 μm cel zeef op een tube van 50 mL en nat het vooraf met 2 mL buffer. Plaats de milt op de zeef van de cel (2 – 3 milt voor één cel zeef) en maceraat ze met behulp van het einde van een zuiger van de spuit 5 mL.</li>
	<li>Spoel de zeef en meerdere malen met 1-2 mL van de isolatie van de cel buffer buis totdat alle cellen worden gespoeld in de buis. Negeren van de cel zeef en centrifugeer de cellen bij 350 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet cel met 5 mL koud (4 ° C) ammonium-chloride-kalium (ACK) lysing van buffer (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM nb2EDTA; pH 7,2 – 7.4) en meng ze zachtjes voor 2 min. Voeg 10 mL van de volledige RPMI media te neutraliseren de ACK buffer en onmiddellijk Centrifugeer de cellen bij 350 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant na het centrifugeren.</li>
</ol>3. isolatie van CD4 + T cellen met behulp van magnetische CD4 Microbeads en een cel scheiding kolom
<ol><li>Resuspendeer de pellet cel in 5 mL van de isolatie van de cel buffer. Het filteren van de celsuspensie met behulp van een pre scheiding filter (30 μm) in een nieuwe 15mL-buis te verwijderen elke puin.</li>
	<li>Neem 10 μL van de celsuspensie en maak van een 10 x verdunning door toevoeging van 90 μL van de buffer. Neem 10 μL van de verdunde celsuspensie en meng dit met 10 μL van trypan blauw voor het tellen van de cel. De cellen in een hemocytometer om te bepalen van het rendement van levensvatbare cellen te tellen.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen bij 350 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en de vloeistof wordt weggeworpen.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in 90 μL van buffer per 107 cellen. 10 μL van magnetische CD4 microbeads per 107 cellen toevoegen. Incubeer de cellen gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C. Voor optimale resultaten, meng de celsuspensie zachtjes om de 5 min tijdens de incubatie.</li>
	<li>Terwijl de cellen aan het broeden zijn, plaatst u de kolom van een scheiding op de magnetische stand. Vooraf nat de kolom met 2 mL buffer.</li>
	<li>Aan het eind van de incubatie cel/kraal, wassen van de cellen met 5 mL buffer en centrifugeer ze bij 350 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in 1 mL buffer, het monster te laden in de kolom van de cel scheiding en laten doorstromen. Gebruik een centrifugebuis van 15 mL voor het verzamelen van de Fractie van de CD4-cel. Voeg 1 mL buffer te wassen het reservoir voordat het droog is. Herhaal de stap wassen 2 x.</li>
	<li>Verwijder de cel scheiding kolom uit de magnetische standaard en plaats deze op een nieuwe 15 mL centrifugebuis. Voeg 2 mL isolatie van de cel buffer naar de cel scheiding kolom en de zuiger stevig te dwingen de cellen uit de kolom van toepassing.</li>
	<li>Centrifugeer de breuk bij 350 x g gedurende 5 min bij 4 ° C tot het verkrijgen van CD4 +-cellen. Verwijder het supernatant.</li>
</ol>4. zuivering van de naïeve CD4 + T cellen (CD4+CD25-CD44loCD62LHallo) door fluorescentie-geactiveerde cel Sorteren en THGM differentiatie
<ol><li>Resuspendeer de pellet verkregen CD4 + cel in 500 µL van buffer. Meng de cellen met een mengsel van de TL-geconjugeerde antilichamen met CD4-PerCp (2,8 µg/mL), CD44-APC (2,4 µg/mL), CD25-PE (2 µg/mL), en CD62L-FITC (10 µg/mL) (tabel 1). Incubeer de cellen op het ijs gedurende 20 tot 30 minuten, terwijl het hen te beschermen tegen licht. Opmerking: De concentratie van de antistoffen waren eerder geoptimaliseerd in het lab. Het aantal antilichamen vermeld is voor cellen van 1-2 muizen.</li>
	<li>Na de incubatie, de cellen met 5 mL buffer wassen en centrifugeren van de cellen bij 350 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 500 µL van buffer. De cellen weer met behulp van een nylon gaas filteren.</li>
	<li>De celsuspensie overbrengen in een FACS buis voor het sorteren van de cel. De collectie FACS buizen met 500 µL van buffer precoat.</li>
	<li>Verkrijgen van een CD4+CD25-CD44loCD62LHallo bevolking (van naïeve CD4+ T cellen) door FACS sorteren. Gate op CD4+CD25- eerste en selecteer vervolgens CD44loCD62LHallo cellen uit deze populatie.</li>
	<li>Verzamelen van de naïeve CD4+ T cel breuken tot een nieuwe 15 mL centrifugebuis. Centrifugeer de cellen bij 350 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en de vloeistof wordt weggeworpen.</li>
	<li>Resuspendeer de naïeve CD4 + T-cellen bij een concentratie van 106 cellen/mL in volledige RPMI media met 50 µM β-mercaptoethanol.</li>
	<li>Gecombineerd de antilichamen van de anti-CD3e voor precoating in de 48-well-plaat gebruikt. Zaad 0,25 miljoen (250 µL) cellen in elk putje met IL-7 (2 ng/mL), anti-CD28 (1 µg/mL) en anti-IFNγ (10 µg/mL) (tabel 1). Opmerking: De concentraties van cytokine en antistoffen waren eerder geoptimaliseerd in het laboratorium voor een THGM celdifferentiatie.</li>
	<li>Incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% CO2 voor 3 dagen. Wijzig het medium niet tijdens de incubatie.</li>
</ol>5. analyse van de muis THGM cellen gegenereerd In Vitro
<ol><li>Met behulp van een Microscoop, Controleer de celdifferentiatie 3 d na de differentiatie. Oogsten van de cellen samen en centrifugeer ze bij 350 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Wassen van de cellen 2 x met volledige RPMI media. Opmerking: Gedifferentieerde cellen zijn groter in omvang dan de naïeve CD4 + T cellen.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in 1 mL van volledige RPMI media. Neem 10 μL van celsuspensie en het goed mengen met 10 μL van trypan blauw aan het bepalen van het aantal cellen met een hemocytometer. Gedifferentieerde cellen verdelen in drie drankjes voor een restimulation en analyse. Nota: De intracellulaire cytokine kleuring en ELISA vitrotests vereisen ≥0.5 miljoen cellen en qPCR analyse vereist ≥ 1 miljoen cellen.</li>
	<li>
Opleving voor de intracellulaire cytokine kleuring, de cellen met de phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) (100 ng/mL) en ionomycin (1 μg/mL) in aanwezigheid van een eiwit vervoer inhibitor (1 µL/mL) voor 4 – 6 h.
	<ol>
<li>Oogsten van de cellen en vlekken hen met anti-CD4 antilichaam (PerCP-geconjugeerde, 0,2 mg/mL, 1:100 verdunning; of FITC-geconjugeerd, 0,5 mg/mL, 1:100 verdunning) voor 30 min.</li>
		<li>Het herstellen van de cellen met de 200 μL van fixatie buffer voor 20 – 60 min. Na de fixatie, het wassen van de cellen 2 x met 1 mL permeabilization buffer.</li>
		<li>Uitvoeren van intracellulaire kleuring met antilichamen tegen GM-CSF (PE-geconjugeerde, 0,2 mg/mL, 1:100 verdunning), IL-17A (FITC-geconjugeerd, 0,5 mg/mL, 1:100 verdunning; APC-conjugated, 0,2 mg/mL, 1:100 verdunning), IL-4 (APC-geconjugeerde, 0,2 mg/mL, 1:100 verdunning) en IFNγ (APC-geconjugeerde, 0,2 mg/mL, 1:100 verdunning; PE-conjugated, 0,2 mg/mL, 1:100 verdunning) gedurende 30 min. in het donker.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor een analyse van de qPCR van de cytokine genexpressie door gedifferentieerde cellen, activeert u de cellen met plaat-gebonden anti-CD3e (3 μg/mL) (precoating de plaat zoals beschreven in stap 1.3). Oogst de cellen isoleren totaal RNA, cDNA voorbereiden op de qPCR van een fenol RNA extractie reagens met 3 uur na de stimulatie. De primers en programma gebruikt voor de qPCR staan in de tabellen 2 en 3, respectievelijk.</li>
	<li>Opleving voor de analyse van de cytokine eiwit secretie door gedifferentieerde cellen, cellen met plaat-gebonden anti-CD3e (3 μg/mL) gedurende 24 uur (precoating van de plaat zoals beschreven in stap 1.3). Oogst de celcultuur supernatant voor IL-17 en GM-CSF ELISA om te bepalen hun concentraties.</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, J., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4+T+cells%3A+fates%2C+functions%2C+and+faults%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD4 T cells: fates, functions, and faults.</a> Blood. 112, 1557-1569 (2008).</li>
<li>Kara, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailored+immune+responses%3A+novel+effector+helper+T+cell+subsets+in+protective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity.</a> PLoS Pathogens. 10, e1003905(2014).</li>
<li>Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Immunology+meets...Immunology%3A+Modified+cancer+cells+as+professional+APC+for+priming+naive+tumor-specific+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells.</a> Oncoimmunology. 6, e1356149(2017).</li>
<li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TH17+cells+in+development%3A+an+updated+view+of+their+molecular+identity+and+genetic+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming.</a> Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).</li>
<li>Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-17+and+Th17+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-17 and Th17 Cells.</a> Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).</li>
<li>Sheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT5+programs+a+distinct+subset+of+GM-CSF-producing+T+helper+cells+that+is+essential+for+autoimmune+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation.</a> Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).</li>
<li>Codarri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RORgammat+drives+production+of+the+cytokine+GM-CSF+in+helper+T+cells%2C+which+is+essential+for+the+effector+phase+of+autoimmune+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation.</a> Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).</li>
<li>El-Behi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+encephalitogenicity+of+T%28H%2917+cells+is+dependent+on+IL-1-+and+IL-23-induced+production+of+the+cytokine+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF.</a> Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).</li>
<li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+nuclear+receptor+RORgammat+directs+the+differentiation+program+of+proinflammatory+IL-17%2B+T+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells.</a> Cell. 126, 1121-1133 (2006).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+subset+of+helper+T+cells+promotes+immune+responses+by+secreting+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF.</a> Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).</li>
<li>Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+in+Neuroinflammation%3A+Licensing+Myeloid+Cells+for+Tissue+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage.</a> Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We beschreven hier een protocol van een in vitro THGM differentiatie van muis naïef CD4 +-cellen, gevolgd door een analyse van de gedifferentieerde cellen voor het valideren van de methode. Opmerking, kan zowel de milt en de lymfeklieren worden aangewend voor naïef CD4 + T cel zuivering en THGM differentiatie. De cytokine-expressie bepaald door intracellulaire cytokine kleuring gecombineerd met stroom cytometry bleek dat ongeveer 55% van de cellen werden aangezet tot GM-CSF-uiting van celle...

CD4 + T-helper (TH) cellen zijn essentiële onderdelen van het immune systeem, cruciale rol in de verdediging van de gastheer tegen microbiële ziekteverwekkers, in kanker toezicht, en autoimmuniteit1,2,3. Na activatie van T-cel receptor (TCR), naïef CD4 + T cellen kunnen worden onderscheiden in TH1, TH2, TH 17, of regelgevende T (Walter) cellen onder de invloed van verschillende cytokine milieus2,4, 5. onlangs een nieuwe subset van TH cellen, die overwegend GM-CSF produceert, werd geïdentificeerd en THGM6genoemd. De differentiatie van THGM cellen wordt gedreven door IL-7 door middel van de activering van een signaal transducer en een activator van transcriptie 5 (STAT5). Deze cellen een grote hoeveelheid GM-CSF express terwijl het hebben van een lage uitdrukking van andere TH-cell handtekening cytokines zoals IFNγ en IL-176. GM-CSF bleek te spelen een cruciale rol in de ontwikkeling van CD4 + T cellen gemedieerde neuroinflammation7,8. In vergelijking met IFNγ - of IL-17-uiting van autoreactieve T cellen, cellen GM-CSF-uiting van T overgedragen naar wild-type (WT) muizen veroorzaakt een eerdere ziekte en de hogere ziekte-ernst. Daarnaast mislukte Csf2- / - T-cellen voor het opwekken van experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE) na wordt adoptively doorgegeven aan ontvangers die WT, overwegende dat T-cellen ontbreekt IFNγ of IL-17A behouden de mogelijkheid om te bemiddelen EAE7. Bovendien, een blokkade van GM-CSF met behulp van neutraliserende antilichamen verbeterd EAE ziekte ernst8. Bovendien, een tekort aan STAT5 in T-cellen in muizen resulteerde in een verminderde THGM-generatie en, vandaar, een weerstand van de muizen EAE ontwikkeling6. Deze bevindingen onderstrepen het belang van GM-CSF-uiten TH cellen in auto-immune neuroinflammatoire ziekte. Dus, tot vaststelling van een methode om te differentiëren van GM-CSF-uiten TH cellen van naïeve CD4 + T cellen zou belangrijk in de studie van de pathogenese van auto-immune neuroinflammation en T cel-gemedieerde immuun reacties. Echter, een protocol dat efficiënt hervormt THGM cellen lymfkliertest naïef die CD4 + is niet vastgesteld.
Hier presenteren we een methode die lymfkliertest THGM cellen uit naïef CD4 + T cellen onderscheidt. Dit protocol beschrijft de hele procedure, met inbegrip van de winning van de milt van de muis, de voorbereiding van een eencellige schorsing, de CD4-positieve selectie, de fluorescentie-activated cell sorting (FACS) en de cel TH differentiatie en analyse. De gedifferentieerde T-helper cellen worden geanalyseerd door intracellulaire cytokine kleuring gecombineerd met stroom cytometry om te bepalen van de cytokine-expressie op het niveau van eencellige, door een kwantitatieve PCR in real time om te bepalen van de expressie van cytokine mRNA niveau, en door ELISA te beoordelen van de cytokine-expressie op het niveau van de eiwitten. Deze methode kan worden toegepast op de studies van de biologie van de cel van THGM onder verschillende omstandigheden, zoals EAE, waar GM-CSF een belangrijke rol in de pathogenese speelt.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Biowest</td><td>L0500-500</td><td></td></tr><tr><td>FBS Heat Inactivated</td><td>Capricorn</td><td>FBS-HI-12A</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>1st Base</td><td>BUF-2040-10</td><td>Verdund tot 1x PBS in steriele water</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>1st Base</td><td>BUF-1053-100ml-pH8.0</td><td></td></tr><tr><td>10x ACK buffer</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td>verdund in steriele water</td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>SPL Life Sciences</td><td>93070</td><td></td></tr><tr><td>CD4 microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-201</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>LS column</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>magnetic stand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>Terumo</td><td>SS+01T</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Sony SY3200 cell sorter</td><td>Sony</td><td>Sony SY3200 cell sorter</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical centrifuge tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>210261</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical centrifuge tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>FACS tube</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>24 well cell culture plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710</td><td>eBioscience</td><td>46-0041-82</td><td></td></tr><tr><td>PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55)</td><td>eBioscience</td><td>12-0251-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-human/mouse CD44 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0441-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse CD62L FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0621-85</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer-improved counting chamber</td><td>Marienfeld</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Trypan Blue Solution</td><td>GE healthcare Life Sciences</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td>microscope</td><td>Nikon</td><td>Nikon Elipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Purified&nbsp;anti-mouse CD3e&nbsp;antibody</td><td>Biolegend</td><td>100314</td><td></td></tr><tr><td>Purified hamster anti-mouse CD28</td><td>BD Biosciences</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>Purified Rat&nbsp;anti-mouse IFN&gamma; &nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>16-7312-85</td><td></td></tr><tr><td>Purified anti-mouse IL-4 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>504102</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse IL-7 Protein</td><td>R&amp;D system</td><td>407-ML</td><td></td></tr><tr><td>recombinant human TGF-beta</td><td>R&amp;D system</td><td>240-B-010</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Merck Millipore</td><td>19-144</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>GolgiPlug protein transport inhibitor</td><td>BD Biosciences</td><td>51-2301KZ</td><td></td></tr><tr><td>Intracellular Fixation&amp;Permeabilization buffer set</td><td>eBioscience</td><td>88-8824-00</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse GM-CSF PE</td><td>eBioscience</td><td>12-7331-82</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-mouse IL-17A</td><td>Biolegend</td><td>506908</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-mouse IFN-gamma</td><td>Biolegend</td><td>505810</td><td></td></tr><tr><td>GO Taq qPCR master mix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td></td></tr><tr><td>mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go!</td><td>invitrogen</td><td>88-7334-88</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-17A Uncouted ELISA</td><td>invitrogen</td><td>88-7371-22</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro differentiatie van muis granulocyt-macrofaag-kolonie-stimulerende factor (gm-csf)-produceren van t-helper (thgm) cellen

In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells

De granulocyt-macrofaag-kolonie-stimulerende factor (GM-CSF)-produceren van T-helper (THGM)-cel is een nieuw geïdentificeerde T helper cel deelverzameling die overwegend scheidt van GM-CSF zonder het produceren van interferon (IFN) γ of Interleukine (IL)-17 en komt tot spelen een essentiële rol in de auto-immune neuroinflammation. Een methode van isolatie van naïeve CD4 + T cellen van een eencellige opschorting van splenocytes en THGM cel generatie uit naïef CD4 + T cellen zou een nuttige techniek in de studie van T-cel-gemedieerde immuniteit en auto-immune ziekten. Hier beschrijven we een methode die muis naïef CD4 + T cellen in THGM cellen bevorderd door IL-7 onderscheidt. Het resultaat van de differentiatie werd beoordeeld door de analyse van de cytokines expressie met behulp van verschillende technieken, met inbegrip van intracellulaire cytokine kleuring gecombineerd met stroom cytometry, een kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (PCR), en Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Met behulp van de THGM differentiatie protocol zoals beschreven hier, ongeveer 55% van de cellen uitgedrukt GM-CSF met een minimale uiting van IFNα of IL-17. De overheersende uitdrukking van GM-CSF door THGM cellen werd verder bevestigd door de analyse van de uitdrukking van GM-CSF, IFNα en IL-17 op zowel eiwitten als mRNA niveaus. Dus, deze methode kan worden gebruikt om te onderscheiden van de naïeve CD4 + T cellen aan THGM cellen in vitro, die nuttig zal zijn in de studie van biologie van de cel van de THGM.

Naïeve CD4 + T cellen geïsoleerd uit twee 8-week-oude mannelijke C57BL/6 muizen werden verdeeld in drie gedeelten. Een deel van de cellen werd onderscheid gemaakt tussen THGM cellen volgens het protocol beschreven. Een ander gedeelte werd gekweekt onder de voorwaarde van een THGM in aanwezigheid van anti-IL-4 antilichaam (10 µg/mL) als u wilt testen van de invloed van een blokkade van de IL-4 bij de differentiatie van THGM. Het laatste gedeelte werd gekwee...

Hier presenteren we een protocol te differentiëren lymfkliertest granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T-helper (THGM) cellen van naïef CD4 + T-cellen, met inbegrip van isolatie van naïeve CD4 + T cellen, differentiatie van THGM, en analyse van gedifferentieerde THGM cellen. Deze methode kan worden toegepast op de studies van de verordening en de functie van THGM cellen.

In Vitro Differentiatie van muis granulocyt-macrofaag-kolonie-stimulerende Factor (GM-CSF)-produceren van T-Helper (THGM) cellen

The granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing T helper (THGM) cell is a newly identified T helper cell subset that predominantly ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het CD4 T-cel veld, zoals welke subset van T-helper cellen de belangrijkste bron is van GM-CSF bij de pathogenese van inflammatoire ziekten zoals multiple sclerose. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het meer dan 50% GM-CSF expresserende T-cellen genereert vanuit naive CD4 T-cellen met geen of weinig interfererende gamma OI17 expressie cellen, wat een essentiële cellulaire bron biedt voor het onderzoek naar regressie en functie van THGM, een nieuwe subset van T-helper cellen. Het demonstreren van de procedure zal Yi Lu zijn, een afstudeerstudent uit mijn laboratorium.Begin door met behulp van een pincet de huid over de buik van een zes tot acht weken oude muis op te tillen en een snede van ongeveer vier centimeter te maken onder de ribbenkast aan de linkerkant van het dier. Open de buikvlieszak om de milt bloot te leggen en gebruik steriel pincet om de milt over te brengen naar een 70 micrometer zeef vooraf bevochtigd met twee milliliters celisolatiebuffer. Wanneer twee tot drie milten zijn verzameld, gebruik het uiteinde van een vijf milliliter spuit om het miltvlees te macereren en spoel de zeef meerdere keren met één tot twee milliliters celisolatiebuffer totdat alle cellen in de buis zijn gespoeld.Verzamel de cellen door centrifugatie en suspendeer het pellet in vijf milliliters ammoniumchloride kalium lyseerbuffer van vier graden Celsius. Na twee minuten zachtjes mengen, stop de lyse met 10 milliliters compleet RPMI medium en centrifugeer de cellen onmiddellijk. Om de CD4 positieve T-cellen te isoleren, suspendeer het witte bloedcelpellet in vijf milliliters celisolatiebuffer en filter de celsuspensie door een 30 micrometer zeef in een nieuwe 15 milliliter buis om eventueel puin te verwijderen.Na het tellen, suspendeer de cellen in een concentratie van een maal 10 tot de zevende cellen per 90 microliters buffer en voeg 10 microliters anti-CD4 geconjugeerde magnetische kralen per een maal 10 tot de zevende cellen toe voor een 15-minuten incubatie bij vier graden Celsius met mengen om de vijf minuten. Terwijl de cellen incuberen, plaats een scheidingskolom op een magnetische standaard en bevochtig de kolom met twee milliliters buffer. Was vervolgens de cellen met vijf milliliters buffer en suspendeer het pellet in één milliliter buffer.Laad het monster op de kolom en verzamel de CD4 negatieve fractie in een 15 milliliter kegelbuis. Wanneer alle cellen door de kolom zijn gegaan, was de reservoir drie keer met één milliliter buffer per wasbeurt voordat het droogt. Na de laatste wasbeurt, verplaats de kolom naar een nieuwe 15 milliliter kegelbuis en dompel de kolom met twee milliliters celisolatiebuffer om de positieve kralenfractie te verdrijven.Verzamel vervolgens de CD4 positieve cellen door centrifugatie. Voor fluorescentie-geactiveerde celsortering van de naive T-cellen suspendeer het kralen-gesorteerd CD4 positieve cellenpellet in 500 microliters buffer en meng de cellen met een geschikte fluorescentie geconjugeerde antilichaamcocktail. Na 20 tot 30 minuten op ijs beschermd tegen licht, was de cellen in vijf milliliters verse buffer en suspendeer het pellet in 500 microliters verse buffer.Filter de cellen door een nylon gaas en breng de cellen over naar een FACS buis vooraf bekleed met 500 microliters buffer. Maak een poort om de CD4 positieve CD25 negatieve en CD44 lage CD62 ligand hoge celpopulaties te selecteren. Sorteer vervolgens de naive CD4 positieve CD25 negatieve CD44 lage CD62 ligand hoge T-celfracties in een nieuwe 15 milliliter centrifugeerbuis en pellet de geïsoleerde naive CD4 positieve T-cellen door centrifugatie.Voor Granulocyten Macrofagen-Kolonie Stimulerende Factor of GM-CSF T-helper cel differentiatie, suspendeer de gesorteerd T-cellen in een concentratie van een maal 10 tot de zesde cellen per milliliter in compleet RPMI medium bevattend 50 micromolar beta-mercaptoethanol en aspibeer het anti-CD3 epsilon antilichaam uit elke put van een vooraf beklede 48-well plaat. Zaai vervolgens 2,5 maal 10 tot de vijfde cellen in elke put samen met IL7, anti-CD28 en anti-IFN gamma en incubeer de cellen bij 37 graden Celsius en 5%CO2 gedurende drie dagen. Op de derde dag van cultuur, gebruik een microscoop om de celdifferentiatie te controleren en oogst de cellen voor centrifugatie.Suspendeer het pellet in vers compleet RPMI medium voor twee wasbeurten, waarbij de cellen na de tweede wasbeurt in één milliliter vers compleet medium worden gesuspendeerd voor het tellen. Verdeel de cellen in drie gelijke volumes en re-stimuleer de eerste aliquot cellen met PMA en Ionomycin in de aanwezigheid van een eiwittransportremmer gedurende vier tot zes uur. Aan het einde van de stimulatie, oogst de cellen voor kleuring met anti-CD4 antilichaam.Na 30 minuten, fixeer de cellen met 200 microliters fixatiebuffer gedurende 20 tot 60 minuten, gevolgd door twee wasbeurten in één milliliter permeabilisatiebuffer per wasbeurt. Kleur vervolgens gedurende 30 minuten in het donker voor intracellulaire cytokine expressie. Voor kwantitatieve PCR analyse van de gedifferentieerde cel cytokine gen expressie, activeer de cellen met plaat-gebonden anti-CD3 epsilon gedurende drie uur.Gebruik vervolgens een fenol RNA extractie reagens om het totale RNA te isoleren om cDNA voorbereiding voor kwantitatieve PCR mogelijk te maken. Om de cytokine proteïne secretie door de gedifferentieerde cellen te beoordelen, re-stimuleer de cellen met plaat-gebonden anti-CD3 epsilon gedurende 24 uur en analyseer de cultuursupernaten voor IL17 en GM-CSF door middel van ELISA. Ongeveer 55%van de cellen gekweekt onder GM-CSF T-helper cel differentiatie omstandigheden drukte GM-CSF uit terwijl slechts ongeveer 2%van de cellen gedifferentieerd onder T-helper 17 omstandigheden deze cytokine tot expressie bracht.In vergelijking met T-helper 17 differentiatie omstandigheden die resulteren in IL17 productie door ongeveer 8%van de cellen, induceerden GM-CSF T-helper cel differentiatie omstandigheden IL17 expressie in slechts ongeveer 1%van de cellen. Opmerkelijk is dat slechts een fractie van de cellen IFN gamma of IL4 tot

in-vitro-differentiation-mouse-granulocyte-macrophage-colony

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates the priming of primary monocytes into macrophages. Primary human monocytes can be isolated and differentiated to an M1-like pro-inflammatory phenotype using the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) or to an M2-like anti-inflammatory phenotype using the macrophage colony-stimulating factor (M-CSF).

In Vitro Culture and Differentiation of Primary Monocytes into Macrophages

This video describes an in vitro method for generating macrophages from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Macrophage generation from iPSCs occurs in three stages: (i) aggregation of iPSCs in suspension to form three-dimensional embryoid bodies (EBs) that differentiate into mesodermal cells, (ii) formation of macrophage precursor cells from the differentiated EBs, and (iii) differentiation of the macrophage precursor cells into mature, functional macrophages.

Differentiation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells into Macrophages

This video demonstrates the in vitro differentiation of granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor or GM-CSF-producing T helper cells (THGM). Isolated naïve T cells are stimulated for differentiation into THGM, which is confirmed by detecting high intracellular GM-CSF production and a low expression of other T helper cell-specific cytokines.

An In Vitro Technique to Differentiate GM-CSF Producing T Helper Cells from Na&iuml;ve T Cells

Muis embryonale stamcellen kunnen in vitro worden gedifferentieerd tot T-cellen met behulp van het OP9-DL1 co-cultuursysteem. Succes bij deze procedure vereist zorgvuldige aandacht voor reagens/celonderhoud en belangrijke techniekgevoelige stappen. Hier bespreken we deze kritieke parameters en bieden we een gedetailleerd protocol om de adoptie van deze technologie te stimuleren.

Afleiding van T cellen In Vitro Van muis embryonale stamcellen

Beendermergcellen gekweekt met granulocyte macrophage colony stimulerende factor (GM-CSF) genereren een heterogene cultuur die macrofagen en dendritische cellen (DC's) bevat. Deze methode benadrukt het gebruik van MHCII en hyaluronan (HA) binding om macrofagen te onderscheiden van de DC's in de GM-CSF cultuur. Macrofagen in deze cultuur hebben veel overeenkomsten met alveolaire macrofagen.

Generatie en identificatie van GM-CSF Afgeleide alveolaire-achtige macrofagen en dendritische cellen van de muis beenmerg

Er wordt een protocol gepresenteerd voor celcultuur van macrofaagkoloniestimulerend factor (M-CSF) gedifferentieerde humane monocyt-afgeleide macrofagen. Het protocol maakt gebruik van cryopreservatie van monocyten gekoppeld aan hun bulkdifferentiatie in macrofagen. Vervolgens kunnen de geoogste macrofagen worden gezaaid in kweekputjes bij de vereiste celdichtheden voor het uitvoeren van experimenten.

Cultuur van macrofaag kolonie-stimulerende factor Gedifferentieerde Human monocyt-afgeleide macrofagen

Hier worden gedetailleerde protocollen voor het kweken van de 32 quinquies/G-CSF-R cellijn van lymfkliertest myeloïde voorloper, uitvoeren van virale infecties en het uitvoeren van de proliferatie en differentiatie testen gepresenteerd. Deze cellijn is geschikt voor de studie van myeloïde cel ontwikkeling, en de rol van genen van belang in myeloïde celgroei en neutrofiele differentiatie.

Proliferatie en differentiatie van lymfkliertest myeloïde voorloper 32 quinquies/G-CSF-R cellen

In dit artikel geven wij dat een gedetailleerd protocol voor de expressie van fluorescerende fusion eiwitten in lymfkliertest beenmerg-afgeleide dendritische cellen en macrofagen. De methode is gebaseerd op de transductie van het beenmerg progenitoren met retrovirale constructies gevolgd door differentiatie in macrofagen en dendritische cellen in vitro.

Expressie van fluorescerende Fusion eiwitten in lymfkliertest beenmerg-afgeleide dendritische cellen en macrofagen

Deze studie beschrijft een methode om exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes te isoleren die immuunstimulerende granulocyten macrofaagkolonie-stimulerende factoren dragen uit embryonale stamcellen.

Isolatie van exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes met granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor uit embryonale stamcellen

Dit protocol beschrijft de robuuste generatie van macrofagen uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen, en methoden voor hun latere karakterisering. Celoppervlaktemarkerexpressie, genexpressie en functionele tests worden gebruikt om het fenotype en de functie van deze iPSC-afgeleide macrofagen te beoordelen.

Productie en karakterisering van menselijke macrofagen uit pluripotente stamcellen

Leer de differentiatie van T_H GM-cellen uit naïeve CD4+ T-cellen van muizen voor immunologisch onderzoek naar ontstekingsziekten. Dit protocol genereert meer dan 50% GM-CSF producerende cellen.

In Vitro Differentiatie van muis granulocyt-macrofaag-kolonie-stimulerende Factor (GM-CSF)-produceren van T-Helper (THGM) cellen (Video) | JoVE Journal

In Vitro Differentiatie van muis granulocyt-macrofaag-kolonie-stimulerende Factor (GM-CSF)-produceren van T-Helper (T_HGM) cellen

Meer video's verkennen