Karakterisatie van MLKL-gemedieerde plasmamembraan Rupture in Necroptosis
7 augustus 2018
Wij rapporteren methoden voor karakterisering van MLKL-gemedieerde plasmamembraan breuk in necroptosis met inbegrip van conventionele en confocal microscopie van live-cel imaging, scanning elektronen microscopie, en NMR gebaseerde lipide bindend.
Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de rol van de pseudokinase gemengd-lijn kinase-domein zoals MLKL in necroptose zoals membraantranslocatie en permeabilisatie bij lipidbinding. Het grote voordeel van deze technieken is dat ze MLKL direct impliceren als de uitvoerder van plasmamembraanruptuur in necroptose. Live-celbeeldvorming heeft het veld van celdoodonderzoek gerevolutioneerd, vooral voor MLKL-gemedieerde necroptose.
Kernspinresonantie is een krachtige techniek voor het bewaken van lipidbinding aan eiwitten zoals hier voor MLKL is aangetoond. Begin met het aanleggen van vijf keer 10 tot de vierde MLKL knockout muis embryonale fibroblasten of MEF's die het executordomein van MLKL expresseren, gefuseerd met een oligomerisatiecassette en Venus in één milliliter aangevuld DMEM in 24-well platen voor hun overnachtelijke incubatie in een celcultuurincubator. De volgende ochtend, behandel de cellen met doxycycline gedurende 12 uur om expressie van het transgen te induceren, gevolgd door de toevoeging van standaard DMEM aangevuld met FK506-bindend eiwit dimerisator en membraan-impermeable groene fluorescerende kleurstof om necroptose te induceren.
Om de celdood te monitoren, plaats de plaat in een geschikte beeldvormingseenheid die zich in een incubator voor zoogdierweefselcultuur bevindt en open de software van het beeldvormingssysteem. Selecteer het tabblad Schedule Upcoming Scans en selecteer de tray, vaat, soorten scans en scanpatroon in het tabblad Physical Layout. Selecteer snelle fluorescentie in het tabblad Eigenschappen en klik op het tijdlijnvenster en het totale aantal tijdstippen en frequentie van acquisitie om de scantijd toe te voegen.
Klik vervolgens op Toepassen om de beeldacquisitie te starten. Om de necroptose te kwantificeren, selecteer het paneel Taken en beweeg de muiscursor over de achtergrond van verschillende afbeeldingen om de objecttelling voor nieuwe analyse met vaste segmentatiedrempel boven het achtergrondniveau in te stellen. Selecteer vervolgens Previewing om de fluorescerende objecten in de huidige afbeelding te bekijken en de drempelniveaus indien nodig bij te stellen.
Zorgvuldige selectie van de drempel kan worden uitgevoerd door meerdere wells op de plaat te observeren en de Preview-functie in de software te gebruiken. Wees gewoon op de hoogte om dezelfde drempelinstelling voor alle wells in de plaat te gebruiken. Om de groene fluorescentietellingen te integreren, selecteert u onder het tabblad Launch New Analysis het tijdsbereik en de wells die moeten worden geanalyseerd en voert u de naam van de analysetaak in.
Klik vervolgens op OK en dubbelklik op de taaknaam om de gegevens te exporteren voor aanvullende analyse in een geschikt grafieksoftwareprogramma. Voor lipidbinding van de MLKL door nucleaire magnetische resonantiespectroscopie of NMR, gebruik luchtdichte spuiten om één milligram per milliliter van de fosfolipiden van belang in schone glazen buisjes te verdelen voor individuele NMR titratieseries en plaats de buisjes onder een gasvormige stroom argon of stikstof gedurende vijf tot 30 minuten. Het doseren van lipiden uit vluchtige oplosmiddelen zoals chloroform of methanol moet snel worden uitgevoerd vanuit voorraden die op droogijs worden bewaard om inconsistenties in lipideconcentraties tussen monsters als gevolg van oplosmiddelverdamping te minimaliseren.
Aan het einde van de verdampingsperiode, gebruik grote pincetten om de buisjes aan de onderkant van een Büchnerkolf te rangschikken. Verzegel de kolf met een rubberen stop en bevestig plastic slangen verbonden met een vacuümlijn om de inhoud van de buisjes onder mild vacuüm gedurende een nacht te evacueren om eventuele resterende organische stoffen te verwijderen. De volgende ochtend, voeg NMR-buffer aangevuld met detergent toe bij de juiste experimentele concentratie aan elke glazen buis met een lipidelaag en soniceer de buis in een waterbad gedurende maximaal 30 minuten, waarbij de sonicatie elke 10 minuten wordt gestopt om de solubilisatie van de lipidelaag te controleren.
Aan het einde van de sonicatie, laat de buisjes 15 minuten afkoelen en voer een seriële verdunning uit van de lipide-detergentmicellen in detergent-positieve NMR-buffer, door de 1:1-mengsels voor de gewenste concentratiereeks te sonificeren. Bereid controle en referentie NMR-monsters van eiwit en additieven voor in respectievelijk detergent-negatieve en detergent-positieve NMR-buffers, door eiwit en additieven toe te voegen aan elke lipideverdunning in detergent-positieve buffer. Breng vervolgens het juiste volume monsters over naar geschikte NMR-buisjes en laad de monsters op het NMR-instrument.
Complete necroptose van MLKL-knockout MEF's kan worden waargenomen binnen een uur na dimeer-gemedieerde oligomerisatie van doxycycline pre-incubeerde cellen die het gefuseerde transgen expresseren. Deze snelle kinetica necroptose ondersteunt de rol van MLKL als de veronderstelde uitvoerder van plasmamembraanruptuur, resulterend in de productie van plasmamembraan-geassocieerde Venus puncta binnen één tot twee minuten van behandeling met de dimeer en Venus codering van de celperiferie en geleidelijke afronding van de cel binnen twee tot drie minuten. Onder snelle necroptose veranderen de cellen hun morfologie van hun normale langwerpige vorm naar afgerond en opgezwollen binnen vijf minuten na oligomerisatie, gedeeltelijk gebarsten na 10 minuten en uitgebreid ontmanteld met verdwenen cytosol na 20 minuten.
In vitro lipidbindingsexperimenten, bewaakt door NMR-spectroscopie, onthullen grote structurele veranderingen in het MLKL executordomeineiwit bij lipidbinding om de remmende brace-regio te verplaatsen van de gesloten N-helicale naar de open en intrinsiek ongeordende conformatie, evenals per-residu-informatie over mengsels van beide conformeren. De percentages van gesloten en open conformeren in een bepaald monster kunnen ook worden gemonitord, wat ondersteunend bewijs levert voor de interactie van het MLKL executordomein met fosfolipiden en een directe link suggereert tussen MLKL en het plasmamembraan. Dus terwijl geprobeerd wordt celdood te kwantificeren met behulp van deze procedure, is het belangrijk om te weten en te onthouden dat de DNA-bindende kleurstof een hogere drempelfluorescentie heeft dan normaal genetisch-coderende fluorescente eiwitten.
Om deze reden kunnen ze parallel worden gebruikt. Merk ook op dat micellaire lipiden temperatuurgevoelig zijn en daarom kan de NMR-monstertemperatuur geoptimaliseerd moeten worden. Dus volgens deze procedure kunnen andere technieken worden gebruikt zoals totale interne reflectiemicrosco
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert methoden voor het karakteriseren van MLKL-gemedieerde plasmamembraanbreuk tijdens necroptose. Technieken omvatten live-celmicroscopie, scanning elektronenmicroscopie en NMR-gebaseerde lipide binding analyse.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Neurowetenschappen
- Celdood mechanismen
Achtergrond
- MLKL is een pseudokinase betrokken bij necroptose.
- Het begrijpen van MLKL's rol in membraantranslocatie en permeabilisering is cruciaal.
- Live-cel beeldvorming heeft onderzoek naar celdood gevorderd.
- NMR is effectief voor het bestuderen van eiwit-lipide interacties.
Doel van het onderzoek
- Om de rol van MLKL in necroptose te verduidelijken.
- Om de effectiviteit van verschillende beeldvormingstechnieken te demonstreren.
- Om een protocol te verstrekken voor het bestuderen van MLKL-gemedieerde membraanbreuk.
Gebruikte methoden
- Conventionele en confocale live-celmicroscopie beeldvorming.
- Scanning elektronenmicroscopie.
- NMR-gebaseerde lipide binding assays.
- Celcultuur technieken met MLKL knockout muis embryonale fibroblasten.
Belangrijkste resultaten
- MLKL wordt geïmpliceerd als de executeur van plasmamembraanbreuk.
- Live-cel beeldvorming legt effectief MLKL-gemedieerde necroptose vast.
- NMR bewaakt succesvol lipide binding aan MLKL.
- De studie levert een gedetailleerd experimenteel protocol voor verder onderzoek.
Conclusies
- De beschreven methoden zijn waardevol voor het bestuderen van necroptose.
- MLKL's rol als een sleutelrolspeler in membraanbreuk wordt versterkt.
- Toekomstige studies kunnen op deze technieken voortbouwen om celdood mechanismen te verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
MLKL-mediated necroptosis represents a critical node in inflammatory cell death pathways relevant to autoimmunity, neurodegeneration, and oncology portfolios. Quantitative characterization of MLKL's membrane translocation and lipid binding enables mechanistic de-risking and target validation for therapeutic strategies modulating necroptosis. These methods provide predictive confidence for advancing discovery programs targeting regulated cell death.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Directly implicates MLKL as the executioner of plasma membrane rupture, clarifying pathway function.
- Enables mechanistic de-risking by visualizing MLKL redistribution and membrane permeabilization.
- Supports target validation through quantitative lipid-binding and conformational analysis.
Screening & Assay Development
- Establishes live-cell imaging and fluorescence quantification for robust necroptosis readouts.
- Standardizes segmentation thresholds and analysis pipelines for reproducible assay outputs.
- Facilitates screening of modulators affecting MLKL-lipid interactions and membrane rupture.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanistic findings with disease-relevant models of inflammatory cell death.
- Enables continuity from molecular mechanism to preclinical validation of necroptosis inhibitors or activators.
- Provides quantitative endpoints for translational biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
These protocols integrate from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis testing and quantitative screening of necroptosis modulators.
- Discovery Biology: Enables direct testing of MLKL function and pathway engagement via imaging and NMR.
- Screening: Provides standardized, quantitative fluorescence and lipid-binding assays for compound evaluation.
- Analytics: Delivers per-residue conformational and binding data to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects mechanistic insights to disease models for risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: Offers reusable imaging and NMR workflows for broader regulated cell death research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in necroptosis pathway targeting and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes imaging and NMR protocols for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for necroptosis-targeted assets and enhances capital efficiency.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of inflammatory and cell death pathway programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging, fluorescence quantification, and NMR spectroscopy.
- Demands access to advanced microscopy and NMR instrumentation with analytical software.
- Necessitates cross-team standardization of segmentation thresholds and assay conditions.
- Adaptation may be needed for different cell types or lipid compositions.
- Temperature sensitivity and hazardous solvent handling must be managed per protocol guidance.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:50
Mixed Lineage Kinase Domain-like (MLKL)-mediated Necroptosis Live-cell Microscopy Imaging
3:26
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy MLKL Lipid Binding
5:35
Results: Representative MLKL: Plasma Membrane Interaction Analyses
7:26
Conclusion
