Gevoelige meting van Mitophagy door Stroom Cytometry met behulp van de pH-afhankelijke fluorescerende verslaggever mt-Keima

Het algemene doel van deze procedure is om een gevoelige techniek te bieden voor het meten van cellulaire mitofagie-activiteit met behulp van flowcytometrie. Hier laten we zien dat deze methode met succes werd gebruikt om de dramatische toename in HeLa-cel mitofagie te beoordelen, na behandeling met CCCP, een mitochondriaal ontkoppelingsmiddel. Deze techniek maakt het mogelijk om mitofagie-activiteit zeer snel en eenvoudig te meten.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat je mitofagie-activiteit in levende cellen gevoelig kunt meten zonder enige aanvullende kleuring. Daarom zal deze techniek uiteindelijk kunnen helpen bij het begrijpen van het mechanisme en de fysiologische rol van mitofagie. Het demonstreren van de procedure zullen Jee-Hyun Um en Young Yeon Kim uit mijn laboratorium zijn.

Begin deze procedure door de mt-Keima, een mitochondriaal gerichte Keima-lentivirus, voor te bereiden. Zaai eerst HEK293T-cellen in een met poly-L-lysine beklede kweekschaal en kweek ze een dag lang bij 37 graden Celsius in een weefselkweekincubator. Transfecteer de volgende dag HEK293T-cellen met mt-Keima-lentivirale DNA en verpakkings-DNase met behulp van een transfectie reagens volgens de instructies van de fabrikant.

Verwijder na acht uur transfectie het transfectiemedium en voeg acht milliliter verse medium toe. Verzamel het medium dat virale deeltjes bevat 48 uur later en verwijder cellulaire resten door centrifugatie. Filter vervolgens het virusbevattende medium met een 0,45 micrometer-slangfilter.

Plateer HeLa-Parkin-cellen in een 60 millimeter kweekschaal een dag voor het oogsten van het mt-Keima-lentivirus en kweek de cellen met vier milliliter groeimedium gedurende een dag bij 37 graden Celsius in een incubator. Verwijder de volgende dag het groeimedium, voeg een millimeter mt-Keima-virusmedium toe, voeg een extra twee milliliter groeimedium met 3 microliter polybreen-stockoplossing toe en incubeer de cellen gedurende een dag in een CO2-incubator. Verwijder 24 uur na infectie het virusmedium, was de cellen twee keer met PBS en voeg vier milliliter groeimedium toe.

Behandel de cellen gedurende twee dagen met twee microgram per microliter puromycine om ongeïnfecteerde cellen te verwijderen. Bereid vers medium met 10 micromolair CCCP. Verwijder het gekweekte medium en voeg vier milliliter vers groeimedium met CCCP toe.

Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in een CO2-incubator gedurende zes uur. Verwijder het groeimedium en was de cellen eenmaal met PBS. Los de cellen op door behandeling met trypsine EDTA-oplossing.

Verzamel de cellen door centrifugatie en suspendeer ze opnieuw in een milliliter PBS. Breng de cellen over in een FACS-buis en plaats ze op ijs. Schakel voor flowcytometrie de flowcytometer in en start de analysesoftware.

Genereer een nieuw experiment en selecteer BV605 voor de violette laser en PE-CF594 voor de geelgroene laser in het parametervenster. Voer eerst een controlemonster uit van cellen die niet geïnfecteerd zijn met het mt-Keima-lentivirus. Teken in de plot van forward scatter versus side scatter, met behulp van het polygoonpictogram, een poort rond de levende cellen en elimineer dode cellen en cellulaire resten.

Voer vervolgens HeLa-Parkin-cellen uit die geïnfecteerd zijn met het mt-Keima-lentivirus. Pas in de dot plot van BV605 versus side scatter de spanning aan zodat HeLa-Parkin-cellen die mt-Keima tot expressie brengen, duidelijk te onderscheiden zijn van controlecellen die geen mt-Keima tot expressie brengen. Pas vervolgens in de dot plot van PE-CF594 versus side scatter de spanning aan zodat HeLa-Parkin-cellen die mt-Keima tot expressie brengen, duidelijk te onderscheiden zijn van controlecellen.

Selecteer vervolgens in de dot plot van BV605 versus PE-CF594 de mt-Keima-positieve cellenpopulatie door een poort te tekenen met behulp van het polygoonpictogram. Maak vervolgens een andere dot plot van BV605 versus PE-CF594 die alleen mt-Keima-gated cellen toont. Teken in deze dot plot een poort rond onbehandelde mt-Keima-positieve cellen.

Deze poort wordt de lage poort genoemd. Teken vervolgens een andere poort die het gebied boven de lage poort bevat. Deze poort wordt de hoge poort genoemd omdat deze cellen met hoge mitofagie-activiteit bevat.

Selecteer vervolgens het menu Toon populatiehiërarchie. De waarde van het percentage van de ouder vertegenwoordigt het percentage cellen in de hoge poort onder de mt-Keima-positieve populatie. Voer nu elk monster uit en registreer minimaal 10.000 gebeurtenissen in de mt-Keima-stoppoort.

Flowcytometrische analyse van onbehandelde HeLa-cellen die mt-Keima tot expressie brengen, toonde een laag mitofagieniveau. CCCP-behandeling induceerde een dramatische toename van mitofagie-cellen in de hoge poort. Het percentage mitofagie-cellen nam met meer dan 10 keer toe zes uur na CCCP-behandeling.

Deze toename in mitofagie door CCCP-behandeling werd volledig afgeschaft door co-behandeling met bafilomycine A. Zodra de cellen die mito-Keima tot expressie brengen klaar zijn, kan mitofagie-meting met behulp van flowcytometrie worden uitgevoerd binnen een uur als ze goed zijn voorbereid. Voor nauwkeurige mitofagie-analyse door flowcytometrie is het belangrijk om de juiste hoge en lage poorten in te stellen. Bij het analyseren van nieuwe celtypen is het noodzakelijk om bekende cellen zoals HeLa-cellen als controle te gebruiken.

Daarnaast is het belangrijk om te onthouden dat mitofagie volledig moet worden bevestigd door aanvullende kenmerken zoals een afname van mitochondriaal eiwit en een vermindering van mitochondriaal DNA. Deze techniek kan worden toegepast op een grote verscheidenheid aan celtypen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u mitofagie door flowcytometrie kunt analyseren.