Name: Hele cel electrofysiologie van primaire gekweekte lymfkliertest Enterochromaffin cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Leer hele-cel elektrofysiologie van primaire gekweekte enterochromaffine cellen uit de lymfklier. Deze methode maakt gedetailleerd onderzoek naar celopwekbaarheid en hormoonafgifte in het maagdarmkanaal mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs bedanken Mrs. Lyndsay Busby voor administratieve bijstand en Mr. Robert Highet van Mayo Clinic Division of Engineering voor ontwerp en 3D-printen van de cultuur schotel invoegen. Dit werk werd gesteund door de NIH K08 AB (DK106456), piloot en haalbaarheid subsidie aan AB van Mayo Clinic Center voor cel signalering in de gastro-enterologie (NIH P30DK084567) en 2015 Amerikaanse Gastoenterologische vereniging Research Scholar Award (AGA RSA) AB en NIH R01 aan GF (DK52766).

<ol><li>Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%22normal%22+endocrine+cell+of+the+gut%3A+changing+concepts+and+new+evidences%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).</li>
<li>Rogers, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+activity-triggered+glucagon-like+peptide-1+secretion+from+primary+murine+L-cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells.</a> The Journal of Physiology. 589, Pt 5 1081-1093 (2011).</li>
<li>Strege, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+channel+NaV1.3+is+important+for+enterochromaffin+cell+excitability+and+serotonin+release%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Sodium channel NaV1.3 is important for enterochromaffin cell excitability and serotonin release.</a> Scientific Reports. 7 (15650), (2017).</li>
<li>Bellono, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterochromaffin+cells+are+gut+chemosensors+that+couple+to+sensory+neural+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways.</a> Cell. 170 (1), 185-198 (2017).</li>
<li>Alcaino, C., Knutson, K., Gottlieb, P. A., Farrugia, G., Beyder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+ion+channel+Piezo2+is+inhibited+by+D-GsMTx4%5BTitle%5D)+AND+%22Channels%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive ion channel Piezo2 is inhibited by D-GsMTx4.</a> Channels. 11 (3), 245-253 (2017).</li>
<li>Kim, M., Javed, N. H., Yu, J. G., Christofi, F., Cooke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+activates+Galphaq+signaling+pathways+and+5-hydroxytryptamine+release+from+human+carcinoid+BON+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation activates Galphaq signaling pathways and 5-hydroxytryptamine release from human carcinoid BON cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 108 (7), 1051-1059 (2001).</li>
<li>Modlin, I. M., Kidd, M., Pfragner, R., Eick, G. N., Champaneria, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+characterization+of+normal+and+neoplastic+human+enterochromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The functional characterization of normal and neoplastic human enterochromaffin cells.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (6), 2340-2348 (2006).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+ion+channel+Piezo2+is+important+for+enterochromaffin+cell+response+to+mechanical+forces%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive ion channel Piezo2 is important for enterochromaffin cell response to mechanical forces.</a> The Journal of Physiology. 595 (1), 79-91 (2017).</li>
<li>Li, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+cellular+origins+for+serotonin-expressing+and+enterochromaffin-like+cells+in+the+gastric+corpus%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Distinct cellular origins for serotonin-expressing and enterochromaffin-like cells in the gastric corpus.</a> Gastroenterology. 146 (3), 754-764 (2014).</li>
<li>Psichas, A., Tolhurst, G., Brighton, C. A., Gribble, F. M., Reimann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+primary+cultures+of+murine+small+intestine+intended+for+the+study+of+gut+hormone+secretion+and+live+cell+imaging+of+enteroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), 55687(2017).</li>
<li>Raghupathi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+unique+release+kinetics+of+serotonin+from+guinea-pig+and+human+enterochromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Identification of unique release kinetics of serotonin from guinea-pig and human enterochromaffin cells.</a> The Journal of Physiology. 591, Pt 23 5959-5975 (2013).</li>
<li>Nozawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPA1+regulates+gastrointestinal+motility+through+serotonin+release+from+enterochromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">TRPA1 regulates gastrointestinal motility through serotonin release from enterochromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3408-3413 (2009).</li>
<li>Reimann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+functional+role+of+voltage+gated+cation+conductances+in+the+glucagon-like+peptide-1+secreting+GLUTag+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line.</a> The Journal of Physiology. 563, Pt 1 161-175 (2005).</li>
</ol>

Volledig inzicht in functie van de cel EG vereist een kwalitatief hoogwaardige primaire cultuur-methode voor het genereren van cellen voor hele cel electrofysiologie. Primaire culturen van GI epitheel had van oudsher moeilijk als gevolg van lage overleven. Deze storende factor te verlichten, levert de huidige methode culturen van enkelvoud EG cellen uit kleine of grote darm die kunnen overleven voor meerdere dagen.
Wij vonden dat essentieel is voor de verbetering van de kwaliteit van culturen ...

Het gastro-intestinaal epitheel (GI) is een diverse Gemeenschap, bestaande uit verschillende celtypes. Enteroendocrine cellen bestaan uit ongeveer 1% van alle epitheliale cellen, en enterochromaffin (EG) cellen zijn de grootste enteroendocrine cel bevolking1. Recente studies tonen aan dat enteroendocrine2 en EG3,4 cellen elektrisch prikkelbaar zijn. Wij zijn geïnteresseerd in het begrijpen van de primaire EG cel electrofysiologie. Dus, het doel van deze studie was om primaire EG celculturen geoptimaliseerd voor hele cel electrofysiologie.
Bestaande EG-cel lijnen die produceren en afscheiden van 5-HT (bijvoorbeeld QGP-1-5, BON6, KRJ-1-7) en zijn gebruikt voor het onderzoeken van de elektrofysiologie5,8 zijn meestal gegenereerd op basis van vereeuwigd neoplastische weefsels. Terwijl de informatie overgenomen van deze cellijnen waardevolle5,8 is, zijn studies van de primaire cel electrofysiologie noodzakelijk om goed te begrijpen EG celfysiologie. De elektrofysiologie van primaire cellen van de EG is vereist voor de isolatie en de cultuur van één epitheliale cellen, die heeft is beperkt door lage levensvatbaarheid van epitheliale culturen.
De methode van de cultuur gepresenteerd in deze studie is gebaseerd op transgene muizen met fluorescently geëtiketteerde EG-cellen, zoals Tph1-GVB9, gebruikt in deze studie. De methode optimaliseert gemengde primaire epitheliale culturen ontwikkeld eerder2,,10 voor eencellige electrofysiologie3. Vorige methoden gebruikt combinaties van trypsine/EDTA plus Collagenase A of EDTA en DTT voor enzymatische spijsvertering en dichtheid verlopen te specifiek isoleren en cultuur cavia11 en rat EG cellen12. Meer recentelijk, intestinale organoids werden gegenereerd en mechanisch verstoord voor elektrofysiologische opnames4. Culturen met behulp van deze methoden zijn geschikt voor serotonine loslaat van experimenten, RT-qPCR analyse en, terwijl ze kunnen worden gebruikt voor electrofysiologie, zijn afhankelijk van het succes van tijdrovende organoid generatie, dichtheid verlopen EG cellen, worden geïdentificeerd en de cellulaire vernietigende effecten van trypsine en EDTA. Daarentegen het protocol hier beschreven verbetert enzymatische en mechanische behandelingen, optimaliseert kweken voorwaarden en procedures voor de productie van één gezonde EG cellen en geschikt voor de hoge cellulaire normen die nodig zijn voor de elektrofysiologie stroomlijnt.
Deze methode zal worden nuttig voor wetenschappers die willen werken aan primaire cellen van de EG in gemengde culturen in plaats van vereeuwigd culturen en willen onderzoeken de elektrofysiologie van afzonderlijke cellen. Echter kan het blijken minder geschikt voor de studie van cel populaties moeten sorteren of op lange termijn culturen waarvoor survival afgelopen 72 h.

<table><tbody><tr><td>100 mm x 15 mm kweekschaaltje</td><td>Corning (Falcon)</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipet</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>10 mL serologische pipet</td><td>Corning (Falcon)&nbsp;</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conical</td><td>Corning (Falcon)&nbsp;</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conical</td><td>Corning (Falcon)&nbsp;</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>1.000 mL Barrier Pipet Tips</td><td>Thermo Scientific (Art)</td><td>2079E</td><td>Steril bewaren</td></tr><tr><td>MatTek Glass Bottom Dishes</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Steril bewaren</td></tr><tr><td>Micro-dissectie pincet - Zeer fijn, extra lange punten</td><td>Fine Science Tools</td><td>SB12630M</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische schaar - scherp</td><td>Nasco</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>Micro-dissectieschaar</td><td>Nasco</td><td>SB46568M</td><td></td></tr><tr><td>Monoject Hypo-naald, 21 G x 1" A, 100/BX</td><td>Covidien</td><td>8881250172</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Tg(Tph1-CFP)1Able/J Muizen</td><td>Jackson</td><td>Stock # 028366</td><td>Gebruik mannelijke of vrouwelijke muizen tussen de leeftijden van 4-7 weken</td></tr><tr><td>Microfil niet-metalen spuitnaalden (34 gauge, 67 mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm "M" Laboratoriumfolie</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R6101</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 mL spuit met normale luer tip</td><td>Monoject</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 mL spuit met normale luer tip</td><td>Monoject</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektrofysiologisch apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Versterker</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Data-acquisitiesysteem (daq)</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Signaal conditioner</td><td>Molecular Devices</td><td>CyberAmp 320</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.6</td><td></td></tr></tbody></table>

hele cel electrofysiologie van primaire gekweekte lymfkliertest enterochromaffin cellen

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Enterochromaffin (EG) cellen in het gastro-intestinaal epitheel (GI) vormen de grootste subpopulatie van enteroendocrine cellen. Als gespecialiseerde zintuigcellen, EG cellen zin luminal prikkels en hen omzetten in serotonine (5-hyroxytryptamine, 5-HT) release gebeurtenissen. De elektrofysiologie van deze cellen is echter slecht begrepen, omdat ze moeilijk te cultuur en zijn te identificeren. De methode voorgesteld in dit papier contouren primaire EG celculturen geoptimaliseerd voor eencellige electrofysiologie. Dit protocol maakt gebruik van een verslaggever van de transgene cyaan fluorescente proteïne (GVB) om te identificeren muis EG cellen in gemengde primaire culturen, bevordering van de aanpak voor het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige opnames van hele cel electrofysiologie in spanning - en stroom-clamp modi.

Culturen: Primaire lymfkliertest epitheliale cellen gemaakt van een transgene Tph1-GVB model hechten aan gerechten na 4 uur en zijn klaar voor fysiologische experimenten tussen 24 tot en met 72 h. Toen kweekomstandigheden had niet geoptimaliseerd, bestond de epitheliale celcultuur uit grote bosjes, drijvende cellulaire puin, beschadigde membranen en zwak signaal van het GVB in de cellen van de EG(Figuur 1). Culturen die zi...

Enterochromaffin (EG) cellen bestaan uit een kleine subset van gastro-intestinale epitheliale cellen. EG cellen zijn elektrisch prikkelbaar en vrij serotonine, nog moeilijkheden in kweken en het identificeren van de EG cellen hebben beperkte fysiologische studies. De methode die hier gepresenteerd wordt een primaire cultuur model vatbaar voor onderzoek van afzonderlijke cellen van de EG vastgesteld door electrofysiologie.

Hele cel electrofysiologie van primaire gekweekte lymfkliertest Enterochromaffin cellen

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de enterische neurowetenschappen en gastro-intestinale fysiologie, zoals, wat zijn de mechanismen van enterochromaffin cel excitability en reactie op luminale stimuli, en wat zijn de mechanismen van gastro-intestinale hormoon release? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om enterochromaffincellen in detail te bestuderen met behulp van eencellige technieken, zoals elektrofysiologie. Het aantonen van de procedure zal co-eerste auteurs Kaitlyn Knutson en Peter Strege, de uitstekende technologen die deze technieken ontwikkeld.Om deze procedure te beginnen, plaats een zes-milliliter spuitnaald gevuld met ijskoude PBS in het lumen van het geëxtraheerde darmsegment. Gebruik de microdissection tangen, klem en verzegel de darmen rond de spuitnaald, en spoel voorzichtig zes milliliter PBS door het lumen om eventuele fecale materie weg te spoelen. Vervolgens, omkeren van het darmweefsel door zachtjes weven van de microdissection forceps door het lumen, knijpen een darmwand, en het intrekken van het weefsel proximaal aan het puntje van de tangen.Herhaal dit proces totdat het segment bin

whole-cell-electrophysiology-primary-cultured-murine-enterochromaffin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Kv dysfunctie wordt geassocieerd met hartritmestoornissen. Om de moleculaire mechanismen die leiden tot dergelijke aritmieën we een systematische protocol gebruiken voor isolatie van atriale en ventriculaire hartspiercellen uit Kv kanaal bijkomende subunit knockout muizen. Geïsoleerde cardiomyocyten kan vervolgens direct worden gebruikt voor cellulaire elektrofysiologische studies, biochemische of immunofluorescentie (IF) testen.

Isolatie en Kv Channel Opnamen in Murine atriale en ventriculaire cardiomyocyten

Arginine-vasopressine (AVP) regelt fine-tuning van het lichaam van het water homeostase door het vergemakkelijken waterherabsorptie door renale opdrachtgever cellen. Hier presenteren wij een protocol voor de teelt van primaire rat binnenste medullaire verzamelen duct cellen die geschikt zijn voor de opheldering van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen AVP-gemedieerde water reabsorptie.

Kweken Primaire Rat Inner Medullary Verzamelen Duct Cells

We demonstreren een celkweekprotocol voor de directe studie van neuronale en gliale componenten van het enterische zenuwstelsel. Een gemengde neuron/glia-kweek op dekglasjes wordt bereid uit de myenterische plexus van een volwasen muis, waardoor het mogelijk is om de functie van afzonderlijke neuronen en gliacellen te onderzoeken door middel van elektrofysiologie, immunohistochemie, enz.

Een<em&gt; In-vitro</em&gt; Voorbereiding van Geïsoleerde enterische neuronen en Glia uit de myenterische Plexus van de Adult Mouse

Deze video toont een protocol voor het uitvoeren van elektrofysiologische opnames van enkele vezels op een in vitro muis colorectum-zenuwpreparaat.

In vitro functionele karakterisering van de Muis Colorectale Afferent Endings

Na verwijdering uit het lichaam, is neuronaal weefsel sterk beïnvloed door omgevingsfactoren, waardoor eventuele degradatie van het weefsel na 6-8 uur. Met behulp van een unieke incubatie werkwijze, die nauw bewaakt en regelt de extracellulaire omgeving van het weefsel, kan levensvatbaarheid van het weefsel aanzienlijk worden verlengd&gt; 24 uur.

Langdurige incubatie van Acute neuronaal weefsel voor elektrofysiologie en calcium-imaging

Dit protocol beschrijft de isolatie en kweek van gemengde muis kleine darmcellen. Deze primaire kweken intestinale maken het onderzoek signaalroutes onderliggende darm peptidesecretie behulp van een aantal technieken.

Gemengde Primaire culturen van Muizen dunne darm Bestemd voor de Studie van Gut hormoon en live cell imaging van entero-Cells

Wij presenteren een protocol dat celisolatie en volledige cilinder patch-clamp opname combineert om de elektrische eigenschappen van de primaire gedissocieerde epitheelcellen van de rat cauda epididymiden te meten. Dit protocol maakt het mogelijk om de functionele eigenschappen van primaire epididymale epitheelcellen te onderzoeken om de fysiologische rol van de epididymis verder te verduidelijken.

Hele-cel patch-klem opnames van geïsoleerde primaire epitheliale cellen uit de epididymis

We beschrijven een methode voor de voorbereiding van de enkele vers geïsoleerde detrusor gladde spiercellen van menselijke urineblaas monsters gebruik maken van een twee-stap enzymatische procedure. De verkregen levensvatbare DSM-cellen kunnen worden bestudeerd door verschillende eencellige technieken, waaronder de beschreven amphotericine-B patch-clamp elektrofysiologie om fysiologische en farmacologische eigenschappen te onthullen.

Bereiding en gebruik van vers geïsoleerde menselijke detrusor gladde spiercellen voor karakterisering van 9-Phenanthrol-Gevoelige Kationstromen

We presenteren de methodologie voor het isoleren van Murine myocyten en het verkrijgen van spannings-of calcium sporen tegelijk met sarcomere inkorten van sporen met fluorescentie fotometrie met gelijktijdige metingen van digitale cellen geometrie.

Optische beeldvorming van geïsoleerde Murine ventriculaire Myocyten

Dit protocol beschrijft een confocale beeldvormingstechniek om drie fusiemodi in boviene bijnierchromaffinecellen te detecteren. Deze fusiemodi omvatten 1) close-fusion (ook wel kiss-and-run genoemd), waarbij fusieporiën worden geopend en gesloten, 2) stay-fusion, waarbij fusieporie wordt geopend en de geopende porie wordt gehandhaafd, en 3) krimpfusie, waarbij gesmolten blaasjeskrimp betrokken zijn.

Confocale microscopie om drie modi van fusieporiëndynamiek in bijnierchromaffinecellen te meten

Deze studie schetst een protocol voor het genereren van 2D-monolagen van varkensorganoïden afkomstig van de dunne en dikke darm. De groei van deze monolagen wordt gekenmerkt door toenemende TEER-waarden, wat wijst op een robuuste epitheliale integriteit. Bovendien vertonen deze monolagen fysiologische secretoire reacties in Ussing-kamerexperimenten na de toepassing van forskolin.

Tweedimensionale darmorganoïden van varkens die de fysiologische eigenschappen van de inheemse darm weerspiegelen

Leer hele-cel elektrofysiologie van primaire gekweekte enterochromaffine cellen uit de lymfklier. Deze methode maakt gedetailleerd onderzoek naar celopwekbaarheid en hormoonafgifte in het maagdarmkanaal mogelijk.

Hele cel electrofysiologie van primaire gekweekte lymfkliertest Enterochromaffin cellen

Meer video's verkennen