Plaat gebaseerde grootschalige teelt van Caenorhabditis elegans: bereiding van de monsters voor de studie van de metabole veranderingen bij Diabetes
24 augustus 2018
Dit protocol beschrijft een methode voor de grootschalige teelt van Caenorhabditis elegans op solide media. Als alternatief voor vloeibare cultuur kunnen dit protocol verkrijgen van parameters voor verschillende schalen onder plaat gebaseerde teelt. Dit verhoogt de vergelijkbaarheid van de resultaten door het weglaten van de morfologische en metabole verschillen tussen vloeibare en vaste mediacultuur.
In het C.elegans-gebied kan deze methode helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen die de productie van grote populaties en monsters van nematoden vereisen met behulp van plaatcultuur. De belangrijkste voordelen van dit protocol zijn de eenvoudige implementatie en de gemakkelijke beschrijving, inclusief valkuilen en toepassingen. Na het verkrijgen van een gesynchroniseerde populatie van nematoden, voegt u ongeveer een milliliter M negen buffer toe aan de platen en verdeelt u de buffer voorzichtig door de platen te schudden.
Verzamel de nematoden vervolgens in een buis van 15 milliliter. Draai nu de buis om en gebruik een microscoop om de dichtheid van de nematoden te evalueren. Pas de dichtheid van de suspensie aan zoals nodig, en blijf deze onder de microscoop evalueren.
Breng 150 microliter van de suspensie direct op de platen aan met aangepaste pipettips. Om een gelijkmatige verdeling van nematoden tussen de platen te garanderen, draait u de suspensiebuis op regelmatige intervallen om. Was eerst de nematoden met een aangepaste pipettip met ongeveer 500 microliter M negen buffer.
Gebruik dezelfde buffer en blijf de nematoden losmaken totdat de meeste dieren in suspensie zijn verzameld. Neem vervolgens de nematoden op met een aangepaste pipettip en breng ze over naar een plaat met OP50. De aangepaste pipettips verminderen de schuifspanning en schade aan de nematoden door een grotere diameter.
Laat vervolgens de plaat drogen. Bereid vloeibare stikstof voor om de verzamelde nematoden snel te bevriezen voordat u monsters verzamelt. Plaats vervolgens M negen buffer op ijs.
Breng een milliliter M negen buffer aan op elke plaat en draai voorzichtig om om elke plaat te wassen. Neem vervolgens het volume van M negen buffer op en breng het over naar nieuwe buizen van 15 milliliter. Centrifugeer de buis kortdurend bij 800 keer g, voordat u het grootste deel van de M negen buffer verwijdert.
Was vervolgens de monsters drie keer met 10 milliliter M negen buffer om eventuele bacteriën te verwijderen. Gebruik een glazen pipet om elke pellet over te brengen naar een lege buis van 1,5 milliliter. Gebruik de glazen pipet om een milliliter M negen buffer uit de tweede buis van 1,5 milliliter op te nemen om de nematoden van de buiswand te spoelen.
Was vervolgens de resterende nematoden uit de buizen van 15 milliliter en breng ze over naar de monsterbuizen. Centrifugeer vervolgens de monsterbuizen gedurende één minuut bij 19.000 keer g en verwijder zoveel mogelijk supernatant. Verzegeld vervolgens elke buis met paraffinefolie en bevries ze onmiddellijk in vloeibare stikstof.
Bewaar de buizen bij min 80 graden Celsius tot de lysate-voorbereiding. Voeg dezelfde volumes van 0,5 millimeter zirkoniumoxidekralen en tweemaal het volume van lysatebuffer met een proteïnase-remmercocktail toe aan elk bevroren monster. Plaats vervolgens de buizen gedurende één minuut op snelheid negen in een homogenisator.
Centrifugeer de monsters gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius en 19.000 keer g. Breng vervolgens het supernatant over naar een nieuwe buis op ijs en bewaar het bij min 80 graden Celsius voor toekomstige experimenten. In dit protocol werden grote hoeveelheden C.elegans gekweekt voor toepassingen in diabetesonderzoek.
Het aantal verzamelde nematoden correleerde met de eiwitopbrengst van de lysate, wat aantoont dat reproduceerbare kwantitatieve eiwitisolatie kan worden bereikt met behulp van dit protocol. Massaspectrometrische analyses van de reactieve metaboliet methylglyoxal en gevorderde glycosylatie-eindproducten gevormd door blootstelling aan methylglyoxal worden hier getoond. Glucose-behandelde nematoden en controles werden vergeleken.
Het overbrengen van nematoden via een pipet kan schuifspanning veroorzaken, wat mogelijk schadelijk kan zijn voor de nematoden. Oxidatieve stressniveaus in pipettende nematoden en nematoden die met een metalen draad werden overgebracht, verschilden niet bij gebruik van dit protocol. Na dit proces kunnen andere methoden zoals western blot worden uitgevoerd om aanvullende vragen in de proteomics te beantwoorden.
Dit protocol vergemakkelijkt ook experimenten die meerdere parameters met dezelfde populatie relateren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor de grootschalige kweek van Caenorhabditis elegans op vaste media. Deze aanpak vergemakkelijkt de productie van grote nematodepopulaties en monsters, waardoor de vergelijkbaarheid van de resultaten wordt verbeterd.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Microbiologie
Achtergrond
- Caenorhabditis elegans is een veelgebruikt modelorganisme.
- Kweek op platen biedt voordelen ten opzichte van vloeibare cultuur.
- Inzicht in de populatiedynamiek van nematoden is cruciaal voor diverse onderzoekstoepassingen.
- Deze methode beantwoordt belangrijke vragen binnen het vakgebied van C.elegans.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar protocol vast te stellen voor het kweken van C.elegans op vaste media.
- Om de productie van gesynchroniseerde nematodepopulaties mogelijk te maken.
- Om experimenten te vergemakkelijken waarbij grote steekproefgroottes vereist zijn.
Gebruikte methoden
- Synchronisatie van nematodepopulaties.
- Toevoeging van M9-buffer aan de platen.
- Microscopische evaluatie van de nematodedichtheid.
- Aanpassing van de suspensiedichtheid indien nodig.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vestiging van nematodeculturen op grote schaal.
- Verbeterde vergelijkbaarheid van resultaten uit kweek op platen.
- Identificatie van potentiële valkuilen in het protocol.
- Toepassingen in diverse onderzoekcontexten.
Conclusies
- Dit protocol biedt een robuuste methode voor de kweek van C.elegans.
- Het verbetert de mogelijkheid om grootschalige experimenten uit te voeren.
- De methode is eenvoudig en reproduceerbaar.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Grootschalige kweek van C. elegans maakt reproduceerbare kwantitatieve proteïne-isolatie mogelijk voor de ontdekking van diabetesgerelateerde biomarkers, wat de validatie van targets bij neurodegeneratieve complicaties ondersteunt. Deze methode biedt een schaalbare workflow met minimale schuifspanning voor proteomische analyse van AGEs en ROS, die direct toepasbaar is op mechanistische risicoreductie in vroege stadia van geneesmiddelenontwikkeling. Door het faciliteren van gesynchroniseerde populatiepreparatie onder gecontroleerde omstandigheden, verhoogt het de voorspellende betrouwbaarheid in preklinische modellen van diabetische pathologie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken die glucoseblootstelling koppelen aan de vorming van AGE en ROS in neuronale modellen.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie door middel van een reproduceerbare correlatie tussen eiwitopbrengst en het aantal nematoden.
- Voorspellende waarde: Faciliteert portfolio-triage door kwantitatieve proteomische gegevens te leveren voor de identificatie van lead-compounds in pathways van diabetescomplicaties.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream western blot- en massaspectrometrie-applicaties.
- Reproduceerbaarheid: Standaardiseert de monsterbereiding om de fysiologische impact te minimaliseren en consistente proteomische resultaten te garanderen.
- Schaalbaarheid: Maakt integratie van meerdere analyses onder identieke kweekomstandigheden mogelijk voor compatibiliteit met high-throughput screening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeeld: Ondersteunt het onderzoek naar diabetische complicaties via C. elegans-modellen die AGE- en ROS-accumulatie vertonen, onafhankelijk van vasculaire storende variabelen.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekking en preklinische validatie door een consistente monstervoorbereiding over verschillende experimentele condities mogelijk te maken.
- Risicogebaseerde vooruitgang: Levert betrouwbare lysaten voor biomarkeranalyse, waardoor het aantal fout-positieven bij de prioritering van targets wordt verminderd.
Integratie van pipeline en workflow
Deze methode bevindt zich binnen het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetoetsing via lead-identificatie tot preklinische validatie, en is specifiek bedoeld ter ondersteuning van onderzoek naar diabetesgerelateerde neurodegeneratie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van metabole veranderingen bij diabetes via kwantitatieve eiwit- en metabolietanalyse.
- Screening: Levert assay-klare monsters met gestandaardiseerde dichtheid en minimale schuifspanning voor betrouwbare evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Maakt massaspectrometrische meting van methylglyoxaal en AGEs mogelijk, wat kwantitatieve uitslagen biedt voor de vergelijking van condities.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt de ontdekking van het neuronale fenotype met preklinische continuïteit door consistente proteomische workflows.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor grootschalige kweek van nematoden in meerdere diabetes-gerelateerde studies.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in doelvalidatie door mechanistische ambiguïteit in modellen van diabetische complicaties te verminderen.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en reproduceerbaarheid in proteomische workflows, waardoor variabiliteit bij de bereiding van lysaten wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door betrouwbare biomarkergegevens, wat het biologische risico in een laat stadium van diabetesprogramma's vermindert.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van reproduceerbare gegevens over AGE- en ROS-modulatie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het hanteren en synchroniseren van C. elegans.
- Toegang tot centrifuges, homogenisatoren en vloeibare stikstof is noodzakelijk voor de monsterverwerking.
- Vereist cross-team standaardisatie van de beoordeling van de suspensiedichtheid en de wasprotocollen.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen bij overdracht tussen platen met verschillende experimentele condities.
- Bevat praktische beperkingen met betrekking tot het verminderen van schuifspanning tijdens pipetteerstappen, wat wordt opgelost door het gebruik van gemodificeerde tips.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Title
0:27
Large Scale Culture on Plates
1:15
Transfer of Large Amounts of Caenorhabditis elegans
1:52
Harvest of a Large Caenorhabditis elegans Sample
3:20
Protein Isolation for Mass Spectrometry
3:56
Results: Reproducible Quantitative Protein Isolation and Further Applications of Large-scale C. elegans Culture
4:47
Conclusion
