Beoordeling van de synaptische Interface van primaire menselijke T-cellen uit perifeer bloed en lymfoïde weefsel

De benadering waarover we het vandaag hebben, is afgeleid om eigenschappen en functionele activiteiten van uit weefsel afkomstige en perifere bloed T-cellen te vergelijken. De betekenis van het onderwerp wordt geïllustreerd door het feit dat perifere bloed T-cellen slechts 20%van de totale T-cellen in een lichaam vertegenwoordigen. Het is zeer essentieel om een klein aantal uit weefsel afkomstige T-cellen te kunnen bestuderen, en dat is precies wat we hebben bereikt.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een kleiner aantal cellen en kleinere volumes aan reagentia vereist dan traditionele technieken. Begin met het gebruik van polypropyleen schaartype pincetten om glazen dekvlakken 25 tot 30 minuten onder te dompelen in vers bereide zure piranha-oplossing. Aan het einde van de wassing, spoel de dekvlakken zeven keer in een vers volume ultrapuur water voor elke wassing.

Leg vervolgens de natte dekvlakken opzij om het resterende water van het schone glas te laten rollen. Wanneer de dekvlakken droog zijn, verdeel twee microliters van de uiteindelijke liposoommixtuur nauwkeurig in het midden van een zelfklevende glijbaankanaal op een zelfklevende schuif binnen een steriele flowhood. En richt onmiddellijk maar voorzichtig een schone en droge dekglas met de schuif uit om de dekglas voorzichtig op de plakzijde van de schuif te laten zakken.

En gebruik de buitenring van de polypropyleen schaartype pincetten om een zachte druk uit te oefenen op de perifere contact van het dekglas met de schuif, zorg ervoor dat de schuif stevig aan de schuif is bevestigd om lekkage te voorkomen. Draai vervolgens de schuif om en gebruik een permanente marker om vier stippen rond de bilayer op de externe zijde van de schuifsamenstelling te tekenen. Voor de eerste injectie, wijst u een poort van het kanaal aan als de invoerpoort en de andere als de uitvoerpoort, en behoudt deze aanduiding gedurende het hele experiment.

Om bubbeltjesvorming te voorkomen, steekt u het uiteinde van de pijpettentip direct in de invoerpoort totdat u voelt dat het rubberen afdichting van het schuifkanaal met de punt wordt doorboord. Vul het kanaal langzaam met 50 microliter warm assaybuffer. Injecteer 200 microliters nikkel(II)chloride in caseïne-blokkeeroplossing in de invoerpoort.

En verwijder 50 microliters van de buffer van de uitvoerpoort. Verwijder na een incubatie van 45 minuten de overtollige caseïne-oplossing van de uitvoerpoort. Injecteer 100 microliters van een ICAM-1 in streptavidine-oplossing in de invoerpoort voor een incubatie van 45 minuten bij kamertemperatuur.

Aan het einde van de incubatie, verwijder de overtollige eiwit-oplossing van de uitvoerpoort. En was de bilayer twee keer met 100 microliter assaybuffer per wassing. Label vervolgens de bilayers met 100 microliters fluoro-4-geconjugeerd anti-CD3 antilichaam gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.

Gevolgd door twee wasbeurten in 100 microliter assaybuffer per wasbeurt zoals gedemonstreerd. Om T-cel bilayer interacties te beeld, plaats de schuif op de verwarmde fase van 37 graden Celsius van een totale interne reflectiefluorescentie-, of TIRF-microscoop. En pas de fase aan met behulp van de inktmarkeringen om de bilayer te centreren op het 100-machtsobjectief.

Voor beeldvorming van de afgifte van korrels, voeg fluorescentie-geconjugeerd anti-CD107A antilichaam FAB-fragmenten toe aan de CD4 T-cel suspensie. En suspendeer de gelabelde cellen in 50 microliter assaybuffer voor injectie in de invoerpoort van de glijbaankanaal. Selecteer vervolgens het juiste aantal experimentele velden en neem beelden van elk veld op een keer per minuut gedurende 30 minuten na de injectie.

In dit representatieve experiment werden geen verschillen waargenomen tussen CD8 T-cellen die klassieke immunologische synapsen vormden op de lipide bilayers gebouwd in zowel de flowcell als de multi-kanaal flow slide. Na de lipide bilayer interactie, vestigden CD4 T-cellen volwassen immuunsynapsen, maar ze kunnen korrels afgeven of niet, korrels afgeven zonder de vorming van volwassen synapsen, of noch synapsen vormen noch korrels afgeven. Opmerkelijk is dat perifeer bloed mononucleaire cel-afgeleide CD4 T-cellen korrels bijna twee keer zo snel kunnen beginnen af te geven als CD4-cellen afkomstig van lymfeklieren.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om een constante temperatuur te handhaven en langzaam te pipetten zodat er geen bubbels worden gevormd. Naast onze mogelijkheden om een T-cel bilayer interface te onderzoeken, zou deze aanpak ons ook toestaan om een intercellulaire kleuring van de T-cellen uit te voeren die de bilayer hebben aangeraakt. Dit zou aanzienlijk faciliteren een hoeveelheid informatie die kan worden gebruikt om specifieke T-cellen te beschrijven die afkomstig zijn van lymfatisch weefsel of andere weefsels.

Vergeet niet dat het werken met piranha-oplossing uiterst gevaarlijk is, en het is van cruciaal belang dat u de juiste PPE draagt tijdens het uitvoeren van deze procedure.