Name: Een benadering In Vitro Fotodynamische therapie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 53 s
Description: Leer een betrouwbaar in vitro protocol voor fotodynamische therapie met 5-ALA en blauw licht om apoptose in huidkankercellen te bestuderen. Deze methode optimaliseert incubatieparameters voor verbeterde therapeutische strategieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs hebben geen bevestigingen.

1. bereiding van cellen
<ol><li>Plaat 20.000 cellen in 2 mL gestolde voedingsbodem in elk putje van de plaat van een 6-well met behulp van steriele techniek in een kabinet bioveiligheid.</li>
	<li>Plaats 6-Wells-platen in een bevochtigde incubator (37 ° C, 5% CO2) gedurende 24 uur zodat de cellen zich te houden aan de platen.</li>
</ol>2. voorbereiding van fotosensitizer voor behandeling van cellen
<ol><li>0,5, 1 en 2 mM 5-ALA oplossingen in een kweekvloeistof voor te bereiden. Als foetale runderserum (FBS) een ingrediënt van kweekmedium is, bereiden en behandelen van cellen met 5-ALA in cultuurmedium oplossing met 0,1% FBS voor incubations. 11 , 12 In dit geval, SCC-13 cellen vereisen geen FBS, dus 5-ALA rechtstreeks naar Keratinocyt serumvrij middellange aangevuld met boviene hypofyse uittreksel en epidermale groeifactor is toegevoegd.</li>
	<li>Het kweekmedium gecombineerd en wassen van de cellen met ten minste 2 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
	<li>PBS gecombineerd en voeg 2 mL 0, 0,5, 1 of 2 mM 5-ALA oplossingen in afzonderlijke platen of putten.</li>
	<li>Incubeer de cellen met 0, 0,5, 1, of 2 mM 5-ALA op een 36 tot en met 37 ° C verwarmen blok voor 30 min. de cellen te beschermen tegen blootstelling aan licht tijdens de incubatie met aluminiumfolie.</li>
	<li>De 0, 0,5, 1 en 2 mM 5-ALA oplossingen gecombineerd en wassen van de cellen met 2 mL PBS.</li>
	<li>PBS gecombineerd en voeg toe 2 mL gestolde voedingsbodem voor blauw licht bestraling.</li>
</ol>3. blauwe lichte fototherapie
<ol><li>Voordat het bestralen van de cellen, op het blauwe licht apparaat (b.v., light - emitting diode, TL of halogeenlicht) en voeren voor één cyclus (1.000 s) opwarmen van het apparaat. Het blauwe licht apparaat moet een golflengte van de uitvoer van 417 ± 5 nm. Waardoor het apparaat te lopen voor een cyclus voor behandelingen zorgt ervoor dat de blauwe golflengte van licht en de straling consequent door de photoactivation fase.</li>
	<li>Gebruik een fotometer voor het meten van de bestralingssterkte bij het celoppervlak. De blauwe lichte bestralingssterkte bij het celoppervlak moet 10 mW/cm2. De afstand tussen het licht en de cellen moet mogelijk worden aangepast om een bestralingssterkte van 10 mW/cm2 afhankelijk van de intensiteit van de lichtbron.</li>
	<li>0, 0,5, 1 en 2 mM ALA behandelgroepen plaats op een zwarte ondergrond onder de blauwe lichtbron. De cellen met blauw licht voor 1.000 bestralen s (16 min en 40 s) voor een totale fluentie van 10 J/cm2. De cellen zijn naar aanleiding van blauw licht photoactivation, klaar voor analyse.</li>
</ol>4. verzameling en kleuring
<ol><li>Stroom buffer volgens richtlijnen van de fabrikant (Zie Tabel of Materials) voor te bereiden.</li>
	<li>Gecombineerd kweekmedium en wassen cellen met 2 mL PBS.</li>
	<li>Voeg vervolgens 1 mL van 0,25% trypsine-EDTA en cellen los gedurende ongeveer 3 tot 5 minuten toestaan. De cellen kunnen worden onderzocht onder de Microscoop te bevestigen van mobiele-detachement.</li>
	<li>Voeg 1 mL gestolde voedingsbodem (of PBS) met foetale runderserum deactiveren van de Trypsine van 10%.</li>
	<li>Celsuspensie in gelabelde 5 mL flow buizen verzamelen.</li>
	<li>Spin 5 mL flow buis in een centrifuge op 201 x g voor 5 min. Aspirate oplossing zonder te verwijderen cel pellet.</li>
	<li>Voeg toe 200 µL van stroom buffer met geconjugeerd Annexine-V antilichaam (1 µL van Annexine-v per 39 µL van stroom buffer) aan elk monster.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen en plaats gedurende 20 min te Annexine-V-binding toestaan in de incubator (37 ° C, 5% CO2).</li>
	<li>Voeg 3 µL van 7-AAD aan elk monster. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
</ol>5. flow cytometrische analyse
<ol><li>Volg stroom cytometer fabrikant richtlijnen voor set-up (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Verzamelen en analyseren van monsters met stroom cytometry. 13
</li>
	<li>Het uitvoeren van statistische vergelijking van behandeling en controlegroepen met behulp van variantieanalyse (ANOVA)14. Vergelijk de middelen voor de behandeling in groepen naar het gemiddelde van het besturingselement met de een Dunnett-test voor post hoc analyse.</li>
</ol>

<ol><li>Morton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((European+Dermatology+Forum+guidelines+on+topical+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">European Dermatology Forum guidelines on topical photodynamic therapy.</a> European Journal of Dermatology. 25 (4), 296-311 (2015).</li>
<li>Ozog, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy%3A+A+clinical+consensus+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Surgery%3A+Official+Publication+for+American+Society+for+Dermatologic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy: A clinical consensus guide.</a> Dermatologic Surgery: Official Publication for American Society for Dermatologic Surgery. 42 (7), 804-827 (2016).</li>
<li>Abrahamse, H., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+photosensitizers+for+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">New photosensitizers for photodynamic therapy.</a> Biochemical Journal. 473 (4), 347-364 (2016).</li>
<li>Josefsen, L. B., Boyle, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+and+the+development+of+metal-based+photosensitisers%5BTitle%5D)+AND+%22Metal-Based+Drugs%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy and the development of metal-based photosensitisers.</a> Metal-Based Drugs. 2008, 276109(2008).</li>
<li>Ohgari, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+involved+in+%CE%B4-aminolevulinic+acid+%28ALA%29-induced+photosensitivity+of+tumor+cells%3A+Relation+of+ferrochelatase+and+uptake+of+ALA+to+the+accumulation+of+protoporphyrin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms involved in δ-aminolevulinic acid (ALA)-induced photosensitivity of tumor cells: Relation of ferrochelatase and uptake of ALA to the accumulation of protoporphyrin.</a> Biochemical pharmacology. 71 (1-2), 42-49 (2005).</li>
<li>Kessel, D., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+photodamage+and+PDT-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology+B%3A+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial photodamage and PDT-induced apoptosis.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 42 (2), 89-95 (1998).</li>
<li>Goldberg, D. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18940541">Photodynamic therapy in skin rejuvenation.</a> Clinics in Dermatology. 26 (6), 608-613 (2008).</li>
<li>Sakamoto, F. H., Lopes, J. D., Anderson, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+for+acne+vulgaris%3A+A+critical+review+from+basics+to+clinical+practice%3A+Part+I.+Acne+vulgaris%3A+When+and+why+consider+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Academy+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy for acne vulgaris: A critical review from basics to clinical practice: Part I. Acne vulgaris: When and why consider photodynamic therapy.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 63 (2), 183-193 (2010).</li>
<li>Boen, M., Brownell, J., Patel, P., Tsoukas, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+photodynamic+therapy+in+acne%3A+An+evidence-based+review%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Dermatology%22%5BJournal%5D)">The role of photodynamic therapy in acne: An evidence-based review.</a> American Journal of Clinical Dermatology. 18 (3), 311-321 (2017).</li>
<li>Allison, R. R., Moghissi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncologic+photodynamic+therapy%3A+Clinical+strategies+that+modulate+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+and+Photodynamic+Therapy%22%5BJournal%5D)">Oncologic photodynamic therapy: Clinical strategies that modulate mechanisms of action.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 10 (4), 331-341 (2013).</li>
<li>Koo, E., Austin, E., Mamalis, A., Jagdeo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+ultra+short+photodynamic+therapy%3A+heating+fibroblasts+during+sub-30-minute+incubation+of+5-aminolevulinic+acid+increases+photodynamic+therapy-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Surgery%3A+Official+Publication+for+American+Society+for+Dermatologic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Thermal ultra short photodynamic therapy: heating fibroblasts during sub-30-minute incubation of 5-aminolevulinic acid increases photodynamic therapy-induced cell death.</a> Dermatologic Surgery: Official Publication for American Society for Dermatologic Surgery. , (2017).</li>
<li>Koo, E., Austin, E., Mamalis, A., Jagdeo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+ultra+short+sub-30+minute+incubation+of+5-aminolevulinic+acid+photodynamic+therapy+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Efficacy of ultra short sub-30 minute incubation of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy in vitro.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 49 (6), 592-598 (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5650/annexin-v-and-propidium-iodide-labeling">Cell Biology. Annexin V and Propidium Iodide Labeling.</a> JoVE. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li>Mamalis, A., Koo, E., Sckisel, G., Siegel, D., Jagdeo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-dependent+impact+of+thermal+aminolaevulinic+acid+photodynamic+therapy+on+apoptosis+and+reactive+oxygen+species+generation+in+human+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Temperature-dependent impact of thermal aminolaevulinic acid photodynamic therapy on apoptosis and reactive oxygen species generation in human dermal fibroblasts.</a> British Journal of Dermatology. 175 (3), 512-519 (2016).</li>
<li>Gilaberte, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+intrinsic+factors+involved+in+the+resistance+of+squamous+cell+carcinoma+to+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Cellular intrinsic factors involved in the resistance of squamous cell carcinoma to photodynamic therapy.</a> Journal of Investigative Dermatology. 134 (9), 2428-2437 (2014).</li>
<li>Yoon, H. K., et al. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cm403505s">Nanophotosensitizers engineered to generate a tunable mix of reactive oxygen species, for optimizing photodynamic therapy, using a microfluidic device.</a> Chemistry of Materials. 26 (4), 1592-1600 (2014).</li>
<li>Chen, Y. -C., Lou, X., Zhang, Z., Ingram, P., Yoon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cancer+cell+sphere+formation+for+characterizing+the+efficacy+of+photo+dynamic+therapy+in+3D+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput cancer cell sphere formation for characterizing the efficacy of photo dynamic therapy in 3D cell cultures.</a> Scientific Reports. 5, 12175(2015).</li>
<li>Campos, C., Inada, N., Kurachi, C. <a target="_blank" href="https://www.spiedigitallibrary.org/conference-proceedings-of-spie/10476/104760S/Low-dose-PDT-on-breast-cancer-spheroids/10.1117/12.2290915.short?SSO=1">Low-dose PDT on breast cancer spheroids.</a> Optical Methods for Tumor Treatment and Detection: Mechanisms and Techniques in Photodynamic Therapy XXVII. , (2018).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+temperature+on+5-aminolevulinic+acid-based+photodynamic+reaction+in+keratinocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Photodermatology%2C+Photoimmunology+%26+Photomedicine%22%5BJournal%5D)">The influence of temperature on 5-aminolevulinic acid-based photodynamic reaction in keratinocytes in vitro.</a> Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. 26 (2), 83-88 (2010).</li>
<li>Juzeniene, A., Juzenas, P., Kaalhus, O., Iani, V., Moan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+effect+on+Accumulation+of+protoporphyrin+IX+after+topical+application+of+5-aminolevulinic+acid+and+its+methylester+and+hexylester+derivatives+in+normal+mouse+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Temperature effect on Accumulation of protoporphyrin IX after topical application of 5-aminolevulinic acid and its methylester and hexylester derivatives in normal mouse skin.</a> Photochemistry and Photobiology. 76 (4), 452-456 (2002).</li>
<li>Novak, B., Heesen, L., Schary, N., Lubbert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+different+illumination+parameters+on+protoporphyrin+IX+induced+cell+death+in+squamous+cell+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+and+Photodynamic+Therapy%22%5BJournal%5D)">The influence of different illumination parameters on protoporphyrin IX induced cell death in squamous cell carcinoma cells.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 21, 385-392 (2018).</li>
</ol>

DUSA/Sun farmaceutische geboden 5-ALA en de BLU-U lichtapparatuur. Dit manuscript werd gesteund door Dr. Jagdeo de resterende financiering. De inhoud vertegenwoordigen niet de mening van het Amerikaanse Department of Veterans Affairs of de regering van de Verenigde Staten.

Er was een aanzienlijke toename van de SCC-13 apoptosis na 30 min incubations van 0,5, 1 en 2 mM 5-ALA gevolgd door 1.000 s van blauw licht. Deze resultaten zijn in overeenstemming met onze eerder gepubliceerde onderzoek waaruit blijkt dat 5-ALA incubations van 30 min, gevolgd door blauw licht activering leidt tot een verhoging van de dosis-afhankelijke in het percentage van de cellen van de fibroblast ondergaan apoptosis12, 14.
Deze experimentele aanpak te bestuderen PDT heeft voordelen en beperkingen. De beschreven methoden voldoen aan klinische praktijk als een commercieel beschikbare PS en lichtbron werden gebruikt. Onderzoekers kunnen de methoden met verschillende soorten cellen, PSs, lichtbronnen en bestraling parameters aanpassen. Er zijn echter beperkingen aan deze benadering als dit protocol is ontworpen voor Adherente cellen gekweekt in een enkelgelaagde. In de klinische praktijk, verschillen in weefsel architectuur of ziekte pathologie (dat wil zeggen, hyperkeratosis of fibrose) PS absorptie kunnen afnemen of lichte penetratie15. Dientengevolge, kunnen de behandeling doses en experimentele bevindingen niet rechtstreeks overeen met klinische praktijk. Sferoïde tumor modellen en microfluidic chip zijn bestudeerd als een methode om te repliceren nauwer tumor microenvironments16,17,18. Spheroïden hebben innerlijke en uiterlijke cellulaire niches die differentieel kunnen nemen van de photosensitizers en vertegenwoordigen heterogene tumor het platform. Andere onderzoekers hebben microfluidic chips met scherm behandeling voorwaarden en vasculaire verstrekking van photosensitizers gebruikt. Microfluidic chips kunnen echter duur te ontwikkelen of moeilijk uit te voeren voor onderzoekers niet vertrouwd zijn met de techniek. Bovendien kunnen spheroïden en microfluidic-chips niet overeen met de klinische behandeling van huidkanker waarin photosensitizers direct op het oppervlak van de tumor zonder vasculaire verspreiding toegepast worden. Onderzoekers wellicht te evalueren van de voors en tegens van enkelgelaagde cultuur, sferoïde tumor modellen, en microfluidic-chips voor studeren PDT in andere ziekte systemen. Als er nog geen immune cellen of de extracellulaire matrix, is het niet mogelijk om te bepalen hoe PDT beïnvloedt complexe cel interacties. Onderzoekers wellicht in vitro experimentele resultaten met behulp van diermodellen en klinisch onderzoek te bevestigen. Om te bereiken hoge validiteit van Inter test, is het belangrijk om consistent incubatie en lichte parameters bij het uitvoeren van in vitro PDT experimenten.
Temperatuur is bekend dat de effectiviteit van PDT19wijzigen. Één studie aangetoond dat celdood, 5-ALA opname, PP-IX vorming en cytokine release kunnen worden verbeterd door het broeden van cellen met 5-ALA bij temperaturen van tot en met 44 ° C19. Incubatie temperaturen boven de 44 ° C kunnen leiden tot thermische veroorzaakte celdood en incubatie temperaturen lager dan 20 ° C mag niet leiden tot significante 5-ALA opname- en accumulatie19. Het is raadzaam dat onderzoekers PS incubations op een blok van de temperatuur-regelbare verwarming bij een constante temperatuur te controleren uitvoeren voor het potentieel verstorende thermische effecten. Daarnaast is het belangrijk om de fotosensitizer Incubeer gedurende een voldoende hoeveelheid tijd te maken voor de omzetting van 5-ALA in PP-IX. In dit protocol, werden SCC-13 cellen geïncubeerd met 5-ALA gedurende 30 minuten, die met succes cel apoptosis geïnduceerde. Wij hebben eerder aangetoond dat een 10 min incubatie van 5-ALA apoptosis in fibroblast in vergelijking met onbehandelde fibroblasten11,14niet aanzienlijk te verhogen. PP-IX begint zich ophopen in de huid van de muis na 5-ALA is incubatie gedurende zes minuten bij 37 ° C. Dus na tien minuten 5-ALA incubatietijd, er mogelijk niet voldoende accumulatie van PP-IX voor het opwekken van cel apoptosis20. Wij raden een minimale incubatietijd van 20 tot 30 min voor 5-ALA op basis van onze vorige studies11,14. Onderzoekers wellicht optimaliseren incubatieperiode op basis van het laboratorium instellen, fotosensitizer van belang, celtype en klinische indicatie. Antilichaam titratie en optimalisatie experimenten kunnen worden uitgevoerd voor de beste resultaten met behulp van richtlijnen van de fabrikanten. Andere testen van belang kunnen worden uitgevoerd na blauw licht photoactivation inclusief dihydroethidium stroom cytometrische kwantificering van ROS. 14
Variatie in de hoeveelheid licht geleverd per eenheid van oppervlakte (dat wil zeggen, bestralingssterkte) en totale bestraling dosis (dat wil zeggen, fluentie) tijdens de photoactivation fase ROS vorming en cel apoptosis21kan beïnvloeden. De relatie tussen fluentie, bestralingssterkte en tijd kan worden beschreven door de volgende vergelijking:
Fluentie (J/cm2) = bestralingssterkte (W/cm2) x tijd (s)
Zoals fluentie afhankelijk van de tijd is, kan verlenging of verkorting van de photoactivation-fasen behandeling werkzaamheid veranderen. De bestralingssterkte is evenredig aan de afstand tussen de lichtbron en het doelweefsel kwadraat. Dientengevolge, als het licht is te ver weg, er mogelijk niet voldoende licht energie geleverd aan het gerichte weefsel te prikkelen de PS. als alternatief, de bestralingssterkte kan worden verhoogd door licht weerkaatst op de omringende oppervlakken. Daarom raden we uitvoeren van lichte bestralingen met de cel cultuur platen geplaatst op een zwarte ondergrond om te voorkomen dat licht reflectie. Onderzoekers kunnen verwerven commercieel beschikbaar of FDA-goedgekeurde blauwe lichtgevende dioden en fluorescerende apparaten gebruiken in PDT experimenten, maar deze apparaten kunnen hebben verschillende vermogens en lichte veld uniformiteit. Een specifieke golflengte fotometer moet worden gebruikt voor het meten van de bestralingssterkte bij het celoppervlak en uniformiteit van de lichte veld voor elk experiment voor consistente resultaten. Een commercieel beschikbare diffuser kan worden gebruikt om te verbeteren veld uniformiteit, indien nodig.
Kortom, hebben wij beschreven een aanpak in vitro onderzoek naar PDT door detaillering theorie, experimentele methoden, beperkingen, potentiële valkuilen en aanbevelingen voor optimalisatie. PDT is dat een nuttig klinische procedure en in vitro onderzoek kan toestaan voor de ontwikkeling van nieuwe PSs, optimalisatie van protocollen en nieuwe indicaties voor PDT.

Fotodynamische therapie (PDT) is een medische procedure waarbij de broedtijd van een exogenously toegepaste fotosensitizer (PS) gevolgd door zichtbare lichte photoactivation voor het opwekken van cel apoptosis. De Federal Drug Administration (FDA) heeft goedgekeurd voor de behandeling van actinische keratose (AK) PDT en klinische richtlijnen raden PDT als behandeling voor bepaalde niet-melanoom huidkanker en acne vulgaris1,2. Opkomende niet-dermatologische toepassingen voor PDT zijn behandeling van gastro-intestinale, prostaat en gynaecologische kankers3. PDT is een voordelige therapeutische modaliteit als low-cost, niet-invasieve en geassocieerd met minimale bijwerkingen en littekens2.
In de eerste stap van PDT is een PS toegepast en toegestaan te accumuleren intracellulair2. In de Verenigde Staten, wordt actueel 5-aminolevulinic acid (5-ALA) vaak gebruikt voor de behandeling van AKs. Fase 5-ALA wordt tijdens de incubatie omgezet in protoporfyrine IX (PP-IX) via de Heem biosynthese pathway in opgenomen cellen3. Kanker en pre kanker cellen afgenomen ferrochelatase activiteit, die protoporfyrine IX (PP-IX), in het eindproduct zet, Heem. Dientengevolge, accumuleren kanker cellen PP-IX in vergelijking met normale cellen4,5. Deze opeenstapeling van PP-IX in kanker en pre-kankercellen ten opzichte van het omliggende weefsel zorgt voor PDT een gerichte aanpak met minimale bijwerkingen. Lichte bestraling leidt tot reactieve zuurstof soorten (ROS) generatie wanneer zuurstof opgewonden elektronen uit PP-IX accepteert. PP-IX heeft de absorptie van een piek in het ultraviolette spectrum met kleinere pieken in het zichtbare licht spectrum, met inbegrip van blauw en rood licht2. ROS vorming kan uiteindelijk leiden tot cel apoptosis, verstoring van de membraan, mitochondriale schade, immuun modulatie, Keratinocyt proliferatie en collageen omzet6,7,8,9 , 10.
PDT werd ontwikkeld in de jaren 1970 en is een evoluerend therapeutische modaliteit3. Het FDA-goedgekeurde protocol voor de behandeling van AKs beveelt 5-ALA huid incubatie gedurende 14 – 18 h, maar 1 tot 2 h incubations worden vaak gebruikt in de klinische praktijk2. In vitro, hebben wij aangetoond dat kortere 15 min 5-ALA incubations fibroblast cel apoptosis in vergelijking met onbehandelde fibroblasten11,12kunnen verhogen. Bovendien, worden roman chlorin, Ftalocyanine en nanoparticle gebaseerde PSs bestudeerd om PDT werkzaamheid3. Hierin presenteren wij een methode in vitro studie PDT in een aanhangend plaveiselcelcarcinoom cellen. In dit protocol, SCC-13 cellen worden geïncubeerd met 0, 0.5, 1.0, en 2 mM 5-ALA voor 30 min en photoactivated met 417 nm blauw licht voor 1.000 s. De primaire uitkomst maatregel is apoptosis en de necrose, zoals gemeten door de Annexine-V en 7-aminoactinomycin D (7-AAD) stroom cytometry. Deze behandeling-protocol is ontworpen om te simuleren van PDT en kan worden aangepast aan het bestuderen van het gebruik van PDT met andere cellijnen, photosensitizers, incubatie temperaturen of photoactivation golflengten. Voorbereiding van extra controlegroepen wellicht nodig, met inbegrip van onbevlekt, één fluorophore gekleurd, negatieve en positieve controles voor stroom cytometry. Een uitgebreid overzicht van theorie, protocollen, proefopzet en gating voor apoptosis/necrose stroom cytometry kan worden gevonden elders13.

<table><tbody><tr><td>Keratinocyte serum free medium&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>17005042</td><td>Cultuurmedium voor SSC-13 cellen</td></tr><tr><td>DMEM low glucose glutamax</td><td>Thermofisher</td><td>10567022</td><td>Mogelijk kwetsbaar medium voor andere celtypen</td></tr><tr><td>6-well culture plates</td><td>Thermofisher</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermofisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Thermofisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Thermofisher</td><td>15250061</td><td>Voor celtelling en plateren&nbsp;</td></tr><tr><td>BLU-U light&nbsp;</td><td>DUSA</td><td>Aanvraag bij de fabrikant</td><td>Andere blauwe LED-, fluorescente of halogeenlampen kunnen worden gebruikt&nbsp;</td></tr><tr><td>5-ALA</td><td>DUSA</td><td>Aanvraag bij de fabrikant</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>C17032</td><td></td></tr><tr><td>FlowCellect Annexin Red Kit</td><td>Millipore Sigma&nbsp;</td><td>FCCH100108&nbsp;</td><td>Propidiumjodide kan 7-AAD vervangen. Wordt geleverd met annexine-V, 7-AAD en flow buffer</td></tr><tr><td>FACSCanto II</td><td>BD</td><td>Aanvraag bij de fabrikant</td><td>Elke flowcytometer kan worden gebruikt&nbsp;</td></tr><tr><td>Counting Chamber</td><td>Hausser</td><td>3120</td><td>Voor celtelling en plateren&nbsp;</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>Aanvraag bij de fabrikant</td><td>Flowcytometrie analysesoftware</td></tr></tbody></table>

een benadering in vitro fotodynamische therapie

An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

Fotodynamische therapie (PDT) is een medische procedure waarbij de broedtijd van een exogenously toegepaste fotosensitizer (PS) gevolgd door zichtbare lichte photoactivation voor het opwekken van cel apoptosis. De Federal Drug Administration heeft goedgekeurd voor de behandeling van actinische keratose PDT en klinische richtlijnen raden PDT als behandeling voor bepaalde niet-melanoom huidkanker en acne vulgaris. PDT is een voordelige therapeutische modaliteit als low-cost, niet-invasieve, en geassocieerd met minimale bijwerkingen en schrikken. In de eerste stap van PDT is een PS toegepast en toegestaan te accumuleren intracellulair. Latere lichte bestraling induceert de vorming van reactieve zuurstof soorten, die uiteindelijk tot cel apoptosis, verstoring van de membraan, mitochondriale schade, immuun modulatie, Keratinocyt proliferatie en collageen omzet leiden kan. Hierin presenteren wij een methode in vitro studie PDT in een aanhangend cellijn. Deze behandeling-protocol is ontworpen om te simuleren van PDT en kan worden aangepast aan het bestuderen van het gebruik van PDT met verschillende cellijnen, photosensitizers, incubatie temperaturen of photoactivation golflengten. Plaveiselcelcarcinoom cellen werden geïncubeerd met 0, 0.5, 1.0, en 2 mM 5-aminolevulinic acid (5-ALA) voor 30 min en photoactivated met 417 nm blauw licht voor 1.000 s. De maatregel van de primaire uitkomst was apoptosis en de necrose, zoals gemeten door de Annexine-V en 7-aminoactinomycin D stroom cytometry. Er was een verhoging van de dosis-afhankelijke in cel apoptosis na dertig minuten incubatie van 5-ALA. Om te bereiken hoge validiteit van Inter test, is het belangrijk om consistent incubatie en lichte parameters bij het uitvoeren van in vitro PDT experimenten. PDT is dat een nuttig klinische procedure en in vitro onderzoek kan toestaan voor de ontwikkeling van nieuwe PSs, optimalisatie van protocollen en nieuwe indicaties voor PDT.

Na SCC-13 cellen werden gedurende 30 min met 0, 0,5, 1 en 2 mM 5-ALA geïncubeerd en bestraald met 1.000 s van blauw licht, was er een verhoging van de dosis-afhankelijke in cel apoptosis. Totale apoptosis (gemiddelde ± standaardafwijking van het gemiddelde) was 3.94 ± 0.34, 7.90 ± 0.52, 23.86 ± 0.52 en 38.33 ± 1.81 na 30 min van incubatie met 0, 0,5, 1 en 2 mM 5-ALA, respectievelijk, en 1000 seconden van blauw licht (Figuur 1). Wij vergeleken het gemiddelde percentage van apoptotic cel onder 0, 0,5, 1 en 2 mM 5-ALA bebroede groepen met ANOVA. Cellen met 1 en 2 mM 5-ALA behandeld had een aanzienlijke stijging in cel apoptosis in vergelijking met 0 mM 5-ALA behandelde cellen. Figuur 2A toont representatieve stroom cytometrische gating van voorwaartse spreiding (FSC) versus kant scatter (SSC) voor SCC-13 cellen geïncubeerd met 0, 0,5, 1 en 2 mM 5-ALA. De cirkel gating omsluit de SCC-13-celpopulatie. Voor dit experiment, 7500 evenementen werden verzameld en de SCC-13 poort voor de bevolking van de cel gevangen ten minste 90% van de gebeurtenissen. Figuur 2B bevat een representatieve plot van de 7-AAD op de x-as en de Annexine-V op de y-as. De cel populaties zijn gated in vier kwadranten (Q1 aan Q4) tot het discrimineren van apoptotic cellen. Q1 (hoog Annexine-v, lage 7-AAD) vertegenwoordigt cellen ondergaan vroege apoptosis. Q2 (hoog Annexine-v, hoge 7-AAD) vertegenwoordigen cellen laat apoptosis of necrose ondergaan. Q3 (lage Annexine-v, hoge 7-AAD) vertegenwoordigt cellen necrose ondergaan. Q4 (lage Annexine-v, lage 7-AAD) vertegenwoordigt cellen niet ondergaan apoptosis of necrose. Voor de berekening van het percentage cellen apoptosis ondergaan, we het percentage cellen in Q1 en Q2 toegevoegd. Inconsistentie in periodelengte 5-ALA incubatietijd, incubatietemperatuur of photoactivation bestraling dosis kan wijzigen PDT werkzaamheid. Figuur 3 toont een representatieve Annexine-V en 7-AAD stroom cytometrische plot wanneer de incubatietemperatuur is gevarieerd (dat wil zeggen, 27, 36 of 42 ° C). Er was een temperatuur afhankelijke toename apoptosis.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig1.jpg"> Figuur 1: verhoging van de dosis-afhankelijke in apoptosis na dertig minuten incubatie van 5-Ala 5-ALA bij 36 ° C geïncubeerd voor dertig minuten gevolgd door 1.000 s van blauw licht in SCC-13 cellen. De staven gemiddelde percentage Annexine-V positieve cellen in elke behandeling en de controlegroep. Experimenten werden uitgevoerd in technische drievoud. Statistische significantie werd bepaald door ANOVA, met p < 0.05 aangeduid met een sterretje (*). Foutbalken geven de gemiddelde ± standaardafwijking van het gemiddelde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58190/58190fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig2.jpg"> Figuur 2: vertegenwoordiger Flow Cytometry percelen. (A) representatieve voorwaartse scatter vs. kant scatter cytometry percelen in willekeurige eenheden (AU) voor x - en y - as voor 0, 0,5, 1 en 2 mM 5-ALA bebroede cellen. Voor dit experiment, 7500 evenementen werden verzameld en de SCC-13 poort voor de bevolking van de cel gevangen 90% van de gebeurtenissen. (B) representatieve Annexine-V vs. 7-AAD stroom cytometry percelen in AU voor x - en y - as voor 0, 0,5, 1 en 2 mM 5-ALA bebroede cellen. Q1: vroege apoptotic cellen, Q2: laat apoptotic/necrotisch cellen, Q3: necrotische cellen en Q4: levensvatbare cellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58190/58190fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig3.jpg"> Figuur 3: 5-ALA bij verschillende temperaturen aan het broeden kan het wijzigen van PDT werkzaamheid. Representatieve Annexine-V vs. 7-AAD stroom cytometry percelen in AU voor x - en y - as voor SCC-13 cellen geïncubeerd met 0,5 mM 5-ALA op 27, 36 en 42 ° C. Q1: vroege apoptotic cellen, Q2: laat apoptotic/necrotisch cellen, Q3: necrotische cellen en Q4: levensvatbare cellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58190/58190fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Fotodynamische therapie (PDT) is een medische procedure waarbij de broedtijd van een exogenously toegepaste fotosensitizer (PS) gevolgd door zichtbaar licht photoactivation te induceren van apoptose. We presenteren een in vitro PDT protocol ontworpen om te simuleren van PDT die kan worden gebruikt voor het bestuderen van de verschillen in PS incubatie en licht behandeling parameters.

Een benadering In Vitro Fotodynamische therapie

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light ...

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen over fotodynamische therapie, ook bekend als PDT, te beantwoorden. De vragen die met deze methode kunnen worden beantwoord, omvatten de duur van de incubatie van een fotosensibilisator, of het gebruik van verschillende parameters in het experiment, zoals het veranderen van de temperatuur door de cellen te verwarmen of af te koelen. Deze techniek kan helpen bij de in vitro ontwikkeling van nieuwe fotosensibilisatoren, protocollen en indicaties voor PDT.Begin door twee keer 10 tot de vierde cellen in twee milliliters kweekmedium in elke put van een zes-putsplaat te plateren met behulp van steriele techniek voor een 24-uurs incubatie bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. De volgende dag, was de cellen met minimaal twee milliliters PBS en behandel de culturen met nul, nul punt vijf, één of twee millimeter verdunning van vers bereide 5-ALA. Plaats vervolgens de plaat op een verwarmingsblok van 36-37 graden Celsius gedurende 30 minuten beschermd tegen licht.Tijdens de procedure raden we aan dat onderzoekers tijdens de incubatiefase een verwarmingsblok gebruiken om een consistente temperatuur gedurende de incubatieperiode te bereiken. Bovendien raden we aan de cellen tijdens de incubatieperiode te bedekken met aluminiumfolie om vroege activering van de fotosensibilisator te voorkomen. Aan het einde van de incubatie, was de cellen in elke put met twee milliliters PBS.En ververs de culturen met twee milliliters vers kweekmedium voor bestraling met blauw licht. Voor het bestralen van de cellen, verwarm het blauwlichtapparaat op een uitgangsgolflengte van 417 nanometer gedurende één 1.000 seconden cyclus en gebruik een fotometer om de stralingssterkte aan het celoppervlak te meten, waarbij de afstand van het licht wordt aangepast om de juiste stralingssterkte te bereiken volgens de intensiteit van de lichtbron. Plaats vervolgens de met 5-ALA behandelde cellen op een zwart oppervlak onder het blauwe licht gedurende 1.000 seconden voor een totale fluence van 10 joule per vierkante centimeter.Tijdens fotoactivering raden we aan de cellen op een zwart oppervlak te plaatsen om lichtreflectie en inconsistente dosering te voorkomen. Aan het einde van de fototherapiebehandeling, was de cellen in elke put met twee milliliters PBS en los de cellen met één milliliter 0,25% trypsin-EDTA per put. Na drie tot vijf minuten, bevestig loslating en deactiveer de trypsin met 10% FBS en PBS.Breng de cellen van elke put over in individuele vijf milliliter flow tubes en verzamel de cellen door centrifugatie. Voeg 200 microliters flow buffer met geconjugeerd annexine-V-antilichaam toe aan elk monster. Hersuspendeer de cellen en plaats de buisjes gedurende 20 minuten in de incubator om annexine-V-binding mogelijk te maken.Aan het einde van de incubatie, voeg drie microliters 7-AAD toe aan elk monster en incubeer opnieuw gedurende vijf minuten op kamertemperatuur, gevolgd door een steekproefanalyse volgens standaard flow cytometrische analyseprotocollen. Na vijf ALA en blauwlicht fototherapiebehandeling, wordt een dosisafhankelijke toename in celapoptose waargenomen. Om het percentage cellen dat apoptose ondergaat te berekenen, worden de percentages cellen in de annexine-V hoge, 7-AAD lage en annexine-V hoge, 7-AAD hoge kwadranten bij elkaar opgeteld.Inconsistenties in de duur van de vijf ALA-incubatieperiode, incubatietemperatuur of fotoactiveringsbestraling dosis kunnen de werkzaamheid van fototherapie veranderen, wat resulteert in een temperatuurafhankelijke toename van apoptose, bijvoorbeeld. Na dit proces kunnen andere technieken, waaronder RTQPCR en western blot, worden uitgevoerd om te bepalen hoe PDT de genexpressie en eiwitactiviteit verandert. Deze methode stelt onderzoekers die geïnteresseerd zijn in fotodynamische therapie in staat om de effecten op huidkankercellen en andere huidaandoeningen in vitro te ontdekken.

an-in-vitro-approach-to-photodynamic-therapy

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method for lung cancer treatment. Photosensitizers selectively accumulate in tumor tissue and lead to tumor cell death in the presence of oxygen and the proper wavelength of light. In this protocol video, PDT-based method is used to evaluate the phototoxic potential of a potential photosensitizer in lung cancer cells.

In Vitro Phototoxicity Assay: A PDT-based Method to Evaluate the Phototoxic Potential of a Photosensitizer in Lung Cancer Cells

This video demonstrates a technique for selectively removing specific cells from a mixed 3D cell culture through near-infrared photoimmunotherapy. In this method, targeted cells are accurately identified using an antibody conjugated with an NIR photoabsorber. Subsequent irradiation with infrared light induces cell death, effectively eliminating the targeted cells from the 3D culture.

Near-Infrared Photoimmunotherapy for Targeted Cell Elimination in Mixed 3D Cultures

Het protocol hier vermeld kan de evaluatie van de effectiviteit van fotodynamische therapie (PDT) in cellijnen en de optimalisering van de PDT instellingen alvorens de therapie diermodellen.

Cytotoxische werkzaamheid van fotodynamische therapie bij osteosarcoomcellen<em&gt; In Vitro</em

Dit protocol beschrijft een methode voor de fabricage van geleidende polymeernanodeeltjes vermengd met fullereen. Deze nanodeeltjes werden onderzocht op hun potentiële toepassing als nieuwe generatie fotosensitizers voor fotodynamische therapie (PDT).

Fotodynamische therapie met Blended geleidend polymeer / Fullerene Nanodeeltje Fotosensitizers

Specifieke cellen elimineren zonder andere cellen te beschadigen is uiterst moeilijk, vooral in gevestigd weefsel, maar er is een dringende behoefte aan een methode voor cel-eliminatie op het gebied van weefselengineering. Hier presenteren we een methode voor specifieke cel-eliminatie uit een gemengde 3D-celcultuur met behulp van nabij-infrarood foto-immunotherapie (NIR-PIT).

Selectieve Cell Eliminatie van Gemengde 3D Cultuur Met behulp van een Near Infrared Photoimmunotherapy Techniek

Nabij-infrarood foto-immuuntherapie (NIR-PIT) is een opkomende kankertherapeutische strategie die gebruik maakt van een antilichaam-fotoabsorber (IR700Dye) conjugaat en NIR-licht om kankercellen te vernietigen. Hier presenteren we een methode om het antitumoreffect van NIR-PIT te evalueren in een muismodel van pleurale gedissemineerde longkanker en maligne pleuraal mesothelioom met behulp van bioluminescentie beeldvorming.

Nabij-infrarood foto-immuuntherapie voor muismodellen van pleurale verspreiding

Hier beschrijven we een nieuw, eenvoudig en goedkoop apparaat om met succes in vitro fotodynamische therapie (PDT) -testen uit te voeren met behulp van tweedimensionale HeLa-celcultuur en verteporfine als een fotosensitizer.

Een in-house gebouwd en licht-emitting-diode-gebaseerd fotodynamisch therapie-apparaat voor het verbeteren van verteporfine cytotoxiciteit in een 2D-celcultuurmodel

Dit protocol presenteert een reeks experimenten die zijn aangenomen voor de evaluatie van fotoschakelbare antikankerpeptiden, die kunnen worden gebruikt bij de preklinische screening van dergelijke verbindingen. Dit omvat cytotoxiciteitsbeoordeling in 2D- en 3D-celculturen, de evaluatie van  ex vivo (modelweefsel) foto-isomerisatie-efficiëntie en in vivo werkzaamheid.

In vitro en in vivo evaluatie van fotogecontroleerde biologisch actieve verbindingen - potentiële kandidaat-geneesmiddelen voor fotofarmacologie van kanker

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en economische methode voor het evalueren van de effectiviteit van potentiële fotosensibilisatoren bij antibacteriële fotodynamische inactivatie (aPDI), met behulp van een plaatformaat met 96 putjes in combinatie met een lichtbron van een LED-paneel. Deze benadering maakt het mogelijk om meerdere experimentele omstandigheden gelijktijdig te testen, waaronder verschillende concentraties, verbindingen en bacteriestammen.

LED-gebaseerde in-vitroscreening voor het beoordelen van fotoactiveerbare moleculen bij bacteriële fotodynamische inactivatie

Dit manuscript presenteert een nieuw, innovatief 3D-geprint verlichtingsapparaat voor het bestuderen van Rose Bengal-gemedieerde fotodynamische therapie in vitro.

Ontwikkeling van een innovatief LED-gebaseerd verlichtingsapparaat voor in vitro toepassing van fotodynamische therapie met Rose Bengal

Leer een betrouwbaar in vitro protocol voor fotodynamische therapie met 5-ALA en blauw licht om apoptose in huidkankercellen te bestuderen. Deze methode optimaliseert incubatieparameters voor verbeterde therapeutische strategieën.

Een benadering In Vitro Fotodynamische therapie

Meer video's verkennen