Methoden voor de evaluatie van de rol van c-Fos en Dusp1 in afhankelijkheid van de oncogen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van kankertherapeutisch, zoals de identificatie van belangrijke genen die betrokken zijn bij oncogene afhankelijkheid. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gebruik maakt van de oncogene afhankelijkheid die gemeenschappelijk is voor veel kinase gedreven kankers daarom is het van toepassing op meerdere tumortypes. Hoewel deze methode inzicht kan geven in leukemie, kan het ook worden toegepast op andere systemen, zoals vaste tumoren zoals longkanker, hersentumoren en alvleeskliertumoren.

Over het algemeen, individuen nieuw op deze methode zal worstelen als gevolg van gebrek aan ervaring in moleculaire biologie en cellulaire fysiologie. Om te beginnen, oogst de beenbeenderen van een geëuthanaseerde muis. Reinig de weefsels van de botten met een scalpel.

Plaats vervolgens de botten in koude PBS op ijs en plet de botten met een stamper. Filtreer hierna de celsuspensie door een celzeef van 70 micrometer in een 50 milliliter schroefdopbuisbuis met een pipet van 10 milliliter. Was de mortel en stamper meerdere keren met koude PBS en voeg de cel suspensie toe aan de 50 milliliter buis.

Volgende centrifugeren het beenmerg en verwijder de supernatant met vacuüm en glazen pipet. Resuspend de cel pellet in 5 milliliter PBS. Voeg met behulp van een pipet langzaam het zwevende beenmerg toe aan de bovenkant van de kamertemperatuur poly-sacharose.

Draai hierna de poly-sacharose 20 minuten op 400 Gs met de rem uitgeschakeld. Na centrifugatie, verzamel de troebele totale mono-nucleaire cel interface met een pipet en breng het naar een nieuwe 15 milliliter buis. Breng het volume met PBS op 10 milliliter en verwijder 20 microliter om te tellen.

Gooi na centrifugatie de supernatant weg en leg de pellet op ijs. Vervolgens resuspend de cel pellet in PBS met EDTA en BSA. Voeg CD117 microbeads toe aan de celopening en vortex om te mengen.

Daarna, incubeer de schorsing gedurende 10 minuten op 4 graden Celsius. Breng het volume vervolgens tot 10 milliliter met meer PBS met EDTA en BSA en centrifuge bij 1200 G's bij 4 graden Celsius gedurende 5 minuten. Gebruik een vacuüm om de supernatant te verwijderen en de celpellet in PBS op te schorten met EDTA en BSA.

Voeg vervolgens 3 milliliter PBS met EDTA en BSA toe aan een magneetstandaard met een magnetische kolom en laat deze in een opvangbuis stromen. Nadat de buffer door de kolom is gestroomd, voegt u de celsuspensie toe en laat deze door de kolom in de verzamelingsbuis stromen. Voeg vervolgens nog 5 milliliter PBS met EDTA en BSA toe aan de kolom en spoel deze onmiddellijk door met de zuiger.

Verwijder de zuiger en herhaal de flush voor het tellen van de cellen. Na het centrifugeren van de cellen, verwijder de supernatant en schort de celpellet in volledige IMDM voor cultuur op. Kweek de cellen 's nachts bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide.

Combineer eerst het retrovirale plasmide DNA met de verpakking plasmid, calciumchloride en water in een buis van 1,5 milliliter. Voeg vervolgens 500 microliter HBS toe aan een andere buis van 1,5 milliliter. Voeg het transfectiemengsel druppelgewijs toe aan de buis met HBS terwijl u zich tegelijkertijd mengt met de vortexer die is ingesteld op de laagste stand.

Incubeer het transfectiemengsel gedurende 20 tot 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg tijdens de incubatietijd chloroquine toe aan de HEK-cellen en bewaar ze in de couveuse. Na het toevoegen van de transfectie mix, incubeer de cellen gedurende 8 uur in een 37 graden Celsius 5%CO2 incubator het veranderen van de cel media door het toevoegen van 14 milliliter verse DMEM10 media zeer langzaam.

Pipetten langzaam tegen de wand van de schotel helpt om te voorkomen dat er ontsteige heid van HEK-cellen. Vervolgens broeden de cellen 's nachts in de 37 graden Celsius 5%CO2 incubator. Gebruik een 10 milliliter spuit om de virale supernatant te verzamelen.

Bevestig vervolgens een spuitfilter van 0,45 micrometer aan de spuit. Dompel de virale supernatant in een nieuwe collectie buis. Verzamel de virale supernatant ongeveer 16 uur later.

Voeg hierna twee milliliter recombinant human fibronectin fragment in PBS toe aan onbehandelde 6 goed kweekplaten. De volgende dag, gebruik een pipet om de fibronectin te verwijderen van de platen. Blokkeer de platen met 2%BSA in PBS en broed de platen 30 minuten op kamertemperatuur.

Gebruik een vacuüm om BSA te verwijderen en was de platen met PBS voordat u het met een vacuüm verwijdert. Voeg hierna onmiddellijk de gefilterde virale supernatant toe en centrifuge de plaat twee uur. Gebruik een vacuüm om de supernatant te verwijderen en draai de plaat opnieuw.

Verwijder vervolgens de supernatant met een vacuüm en was de virale gecoate putten met PBS. Verwijder de PBS met een vacuüm, voeg de eerder gekweekte c-Kip plus muiscellen toe aan de virale gecoate putten. Na centrifugatie, incubeer de cellen op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.

48 uur na de transductie, pellet de cellen via centrifugatie en resuspend ze in FACS buffer 1. Ontdooi eerst de methylcellulose met cytokinen voor muizen bij kamertemperatuur. Dan aliquot 3 milliliter methyl cellulose in een FACS buis.

Voeg 100 microliter van de celsuspensie toe met de juiste remmers tot 3 milliliter methylcellulose. Dan vortex de schorsing op hoog voor 10 tot 30 seconden. Nadat de meeste luchtbellen ontsnappen, gebruik een 1 milliliter spuit om 1 milliliter van de media plaat in drie repliceren platen.

Plaats de borden in een grote petrischaal samen met een open schotel met steriel water. Bedek vervolgens de grote petrischaal en broed de cellen uit op 37 graden Celsius. Bereid iodonitrotetrazoliumchloridevlek voor door 10 milligram iodonitrotetrazoliumchloride op te lossen in 10 milliliter water.

Filter steriliseer de kleuroplossing met een Luer lock spuit uitgerust met een 0,2 micrometer filter. Voeg in de weefselkweekkap 100 microliters van de kleuroplossing drop-wise toe rond de CFU-plaat. Dan incubeer de platen 's nachts op 37 graden Celsius in een cel cultuur incubator.

Tot slot, nadat de kolonies een donkerrode bruine kleur hebben gedraaid, gebruik een witte achtergrond in de steriele weefselkweekkap om foto's van de bevlekte CFU plaat te nemen. In dit protocol werden meerdere onbevooroordeelde genexpressieanalyses gebruikt om de genetische component te identificeren die oncogeneverslaving orkestreert. Om de rol van c-Fos en en Dusp1 als therapeutisch doelwit bij leukemie te valideren, werd hun overexpressie bevestigd met cellen die het BCR-ABL1 oncogeen uitdrukken.

Analyse via RT-qPCR en western blotting bevestigde dat beide werden veroorzaakt door BCR-ABL1 en dat hun expressie wordt versterkt door groeifactor IL-3. YFP plus uitdrukkende cellen werden gesorteerd via FACS voor verdere in vitro en in vivo testen. De resultaten toonden aan dat het verwijderen van c-Fos en Dusp1 alleen cfu-nummers remde.

Cellen die zowel c-Fos als Dusp1 misten, werden aanzienlijk aangetast in hun vermogen om kolonies te vormen en Imatinib-behandeling vernietigde alle C-O.'s, wat aangeeft dat het verlies van c-Fos en Dusp1 synthetisch dodelijk is voor BCR-ABL1-expressie. Na deze ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van kanker om de genetische netwerken en genen te onderzoeken die de afhankelijkheid van hulpbronnen stimuleren en hoe deze genen hun specifieke reactie op muismodellen en menselijke patiënten beïnvloeden. Vergeet niet dat het werken met retrovirussen en patiëntmonsters zeer gevaarlijk kan zijn en dat veilige laboratoriumpraktijken moeten worden nageleefd tijdens het uitvoeren van deze procedure.