Name: Onderdrukken van Gene transcriptie door cellulaire machines met chemische epigenetische Modifiers omleiden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Ontdek een methode voor genexpressiecontrole door chromatin-modificerende machines te rekruteren met chemische epigenetische modifiers in muizen embryonale stamcellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedank de leden van de Hathaway en Jin laboratoria voor hun nuttige discussies. De auteurs worden Dan Crona en Ian MacDonald ook bedanken voor hun kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door Grant R01GM118653 van de Amerikaanse National Institutes of Health (aan N.A.H.); en door subsidies R01GM122749, R01CA218600, en R01HD088626 van de Amerikaanse nationale instituten voor gezondheid (bij J.J.). Dit werk werd ook ondersteund door een tier 3 en een student van het UNC-Eshelman Instituut voor innovatie verlenen (N.A.H en A.M.C, respectievelijk). Extra financiering van een T-32 GM007092 (A.M.C) ondersteund dit werk. Stroom cytometry gegevens is verkregen op de UNC-Stroom Cytometry Core faciliteit gefinancierd door een P30 CA016086 Cancer Center Core ondersteuning subsidie aan de UNC-Lineberger uitgebreide Cancer Center.

1) lijn celkweek voor het produceren van Lentivirus
<ol><li>Groeien vers, lage-passage (minder dan een passage 30) 293T menselijke embryonale nier (HEK) cellen in hoge-glucose Dulbecco Eagle gewijzigd van het medium (DMEM) base media aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 10 mM HEPES, 1 x van niet-essentiële aminozuren (NEAA), Pen / STREP, 2-mercaptoenthanol in een incubator 37 ° C met 5% CO2. De cellen splitsen elke 3-5 d en voordat ze > 95% heuvels.</li>
	<li>Passage 293T HEK cellen met 18 x 10-6 per plaat van 15 cm (één 15-cm plaat voor elke virus geproduceerd).<ol>
<li>Voor een 15 cm formaat, gecombineerd de oude media, voeg toe 10 mL, 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), gecombineerd de PBS en voeg 3 mL trypsine van 0,05%. Incubeer de cellen in trypsine gedurende 8 minuten bij 37 ° C, schommelen en tik op de cellen halverwege de incubatie. Opmerking: Het doel van deze stap is om de cellen in een suspensie van eencellige.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wanneer de cellen 60-80 procent confluentie de volgende dag bereikt hebben, uitvoeren van een polyethylenimine (PEI) transfectie met 13,5 µg het plasmide psPAX2, 4.5 µg van de plasmide pMD2.G en 18 µg lentivirale-compatibele levering vector met het gen van belang (d.w.z. , FKBP-Gal4), 108 µL van PEI, en 1.8 mL van transfectie media.<ol>
<li>Voorzichtig mengen van het DNA, PEI en transfectie media in een conische buis 15 mL, Incubeer het monster bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten en ontkleuring toevoegen aan de plaat van 15 cm. Opmerking: Gelieve gebruik juiste veiligheid maatregelen en volg alle institutionele en laboratorium veiligheidsprocedures na deze stap, als alle gebruikte reagentia zal bevatten een levend virus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na 16 h van transfectie en incubatie in een incubator 37 ° C met 5% CO2, gecombineerd de media en verse 293 HEK media (voorverwarmde in een waterbad 37 ° C) voorzichtig toe te voegen aan de platen van 15 cm. Incubeer de cellen in een incubator van de 37 ° C met 5% CO2 gedurende 48 uur nadat de media hebt gewijzigd. Het virus is vervolgens klaar om te worden geoogst.</li>
</ol>2) infectie van muis embryonale stamcellen (mESC) met Lentivirus
<ol><li>Lage-passage (minder dan een passage 35) groeien, feeder-gratis aangepast CiA mESCs in hoog-glucose DMEM base media aangevuld met 20% ESC-grade FBS, 10 mM HEPES, 1 x NEAA, Pen/Strep, 2-mercaptoenthanol en 1:500 leukemie remmer factor (LIF) in een incubator 37 ° C met 5% CO2. Opmerking: De LIF wordt verkregen uit het supernatant van COS LIF-producerende cellen, die zijn verzameld in batch en bevroren bij-80 ° C.<ol>
<li>Het groeien van cellen op platen die zijn gepreïncubeerd voor 1-3 h met 0,1% gelatine in 1 x PBS, en vervolgens met 1 x PBS gewassen. De cellen dagelijks voeden en splitsen ze elke 2-3-d, afhankelijk van hun dichtheid. Opmerking: Morfologisch, embryonale stamcellen (ES) kolonies moeten kleine, ronde, en verschillend van elkaar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MESC passage in een formaat van 12-well plaat (100.000 cellen per putje) 1 d voorafgaand aan de infectie.<ol>
<li>Telt de cellen met een hemocytometer. Voor cellen gekweekt in het formaat van een 10-cm, gecombineerd de oude media, voeg 5 mL 1 x PBS gecombineerd de PBS en voeg 1 mL trypsine van 0,25%. Incubeer de cellen in trypsine gedurende 8 minuten bij 37 ° C, schommelen en tik op de cellen halverwege de incubatie. Het doel van deze stap is om de cellen in een suspensie van eencellige.</li>
	</ol>
</li>
	<li>48 uur na het wijzigen van de media van de 293T15-cm virale verpakking van cellen uit stap 1.4, verwijderen en het supernatant overbrengen in een conische buis van 50 mL.</li>
	<li>Centrifugeer het supernatant bij 300 x g gedurende 5 min naar pellet cel puin.</li>
	<li>De bovendrijvende vloeistof door een membraan van 0,45 µm filter. Opmerking: Maak gebruik van de oppervlakteactieve stof-vrije cellulose acetaat (SFCA) membranen, zoals sommige andere materialen kunnen behouden van virus en opbrengsten aanzienlijk te verminderen.</li>
	<li>Het concentreren van het virus met ultracentrifugatie, met behulp van een centrifuge met een SW32 rotor, en draaien het op 20.000 rpm (~ 72.000 x g) gedurende 2,5 uur bij 4 ° C.</li>
	<li>Terwijl het virus zich onder ultracentrifugatie concentreert, behandelen de mESCs van de CiA in de 12-well plaat met verse ES medium met 5 µg/mL polybrene.</li>
	<li>Wanneer de concentratie van het virus is voltooid, zorgvuldig gecombineerd het supernatant en Suspendeer de pellet virus in 100 µL van 1 x PBS (Vermijd overtollige bubbels).</li>
	<li>Het virus en 1 x PBS toevoegen aan een 1.5-mL microfuge buis. Vortex/schudden de buis bij 300 x g (of op de laagste instelling) om het virus volledig te schorsen. Spin naar beneden de buis in een centrifuge mini tafelblad voor 5-10 s te verwijderen van de bubbels.</li>
	<li>Voeg 30 µL van het virus aan elk putje van de plaat van een 12-well. Swirl van de plaat en vervolgens de plaat bij 1.000 x g gedurende 20 minuten centrifugeren. Opmerking: De hoeveelheid virus toegevoegd kan worden gevarieerd afhankelijk van de virale titer, die omgekeerd gerelateerd is aan de grootte van de constructie van de levering.<ol>
<li>U kunt ook flash bevriezen van het virus met vloeibare stikstof en opslaan bij-80 ° C. Als u echter bevriezing van het virus, zal de virale titer lager.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaats van de 12-well plaat terug in de 37 ° C incubator en wijzig de media de volgende ochtend (~ 16 h) later met verse ES media (zoals beschreven in stap 2.1).</li>
	<li>Na 48u van infectie, Selecteer voor cellen die de virale plasmide geïntegreerd door toevoeging van de juiste antibioticum (d.w.z., 1,5 µg/mL puromycin, 10 µg/mL blasticidin, enz.). De media dagelijks veranderen en wassen van de cellen met 1 x PBS indien een meerderheid van de cellen drijvende/doden zijn. Het medium van de selectie van de cellen gedurende 72-96 uur bewaren in een incubator 37 ° C met 5% CO2.</li>
</ol>3) chemische epigenetische Modifiers (CEM) s voorbereiding en behandeling
<ol><li>Schorten de poedervorm CEM in dimethylsulfoxide (DMSO) een voorraad concentratie van 1 mM en een werkende concentratie van 100 µM.</li>
	<li>Na de cellen hebben ondergaan de selectie voor 72-96 h, de mESCs splitsen in een formaat van 12-well met 100.000 cellen per putje. Incubeer de cellen in een incubator van de 37 ° C met 5% CO2 voor 24 h. daarna, bereid een media-oplossing van 100 nM CEM met ES media. Gebruik deze media om de feed van de CiA mESC met 1 mL/goed. Houden om te dienen als een besturingselement, een putje van cellen zonder enige toegevoegde CEMs.<ol>
<li>Wijzig de media door zuigen oude media en toevoeging van 1 mL/goed van vers bereide CEM-bevattende of ES CEM-vrije media elke 24 uur voor de duur van een experiment.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4) analyse van de expressie door microscopie en Stroom Cytometry
<ol><li>Na 48 uren van CEM behandeling, het beeld van de cellen zonder CEM behandeling en de cellen die zijn behandeld met 100 nM CEM met behulp van een fluorescentie Microscoop. Het nemen van representatieve beelden met behulp van fase of helderveld opnemen de mESC morfologie bij 20 X vergroting; de cellen moeten ronde kolonies, met een paar gedifferentieerde cellen hebben gevormd. Onder het FITC fluorescentie kanaal, het imago van beide voorwaarden cel.</li>
	<li>De controle- en CEM-behandelde cellen voor stroom cytometry isoleren door de media aspirating, wassen van de cellen met 1 mL 1 x PBS, aspirating van de PBS en toevoeging van 0,25 mL trypsine van 0,25% met EDTA voor 8-10 min.</li>
	<li>Controleer of de cellen niet langer in grote klontjes zijn door te kijken in de Microscoop. Gebruik een 20 X vergroting. Als de cellen niet lijken te worden een schorsing van de eencellige, Pipetteer zachtjes op en neer met een P1000 pipet om de cellen volledig te trypsinize.</li>
	<li>Doven van de trypsine met 1 mL verse media en resuspendeer de cellen op hoge snelheid met een serologische Pipet (of met behulp van een pipet P1000 en tip) totdat de cellen in een suspensie van eencellige.</li>
	<li>Spin down de cellen bij 300 x g gedurende 5 min. Aspirate het supernatant. Spoel met 1 x PBS en recentrifuge van de cellen. Gecombineerd het supernatant PBS.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet cel in 200 mL FACS buffer (1 mM ethyleendiamminetetra zuur [EDTA], 1 x PBS en 0,2% bovien serumalbumine [BSA]).<ol>
<li>Het totale volume van FACS buffer zullen afhankelijk van hoeveel cellen aanwezig zijn, maar de concentratie moet 1000-3000 cellen / µL. tellen het aantal cellen in 3 monsters en het gemiddelde van de concentratie van cellen. Voeg meer FACS buffer indien nodig.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stroom cytometry uitvoeren op > 50.000 cellen met de zwevende cellen, houden van de cellen op ijs, wanneer zij niet worden geanalyseerd. Een 530/40-filter (FITC, AF488, GFP, etc.) gebruiken voor het vastleggen van de wijzigingen in de expressie. Bepalen van de juiste TL spanning met behulp van een onbehandelde cel controlemonster en stel de spanning te hebben van de fluorescerende piek in het midden van het spectrum opgenomen intensiteit. De monsters worden uitgevoerd met een schede snelheid van ongeveer 5.000 cellen/s.</li>
	<li>Exporteren van de gegevens en het analyseren van de FCS-bestanden op een stroom cytometry programma (dat wil zeggen, FlowJo) door het gating eerst op voorwaartse scatter vs. kant scatter voor levende cellen en vervolgens op forward scatter hoogte vs. gebied voor onderhemden. Vervolgens Visualiseer GFP kanaal gegevens in een histogram kunt bepalen van de relatieve GFP-expressie in de gerichte populaties.</li>
</ol>5) analyse van chromatine door chromatine Immunoprecipitation (ChIP) gevolgde door qPCR
<ol><li>Splitsen van de mESCs in een 10-cm plaat met 3 miljoen cellen en 10 mL van ES media (één 10-cm plaat voor elk experimenteel of besturingselement voorwaarde). De volgende dag, voeg 10 mL van CEM-bevattende of CEM-vrije media. Na 48 uren van CEM behandeling, gecombineerd de oude media. Wassen en de cellen met 5 mL 1 x PBS gecombineerd. Vervolgens distantiëren van de cellen met 0,25% trypsine en doven van de trypsine met 10 mL ES media. Tellen en isoleren van een steekproef van 10 miljoen cellen per voorwaarde.</li>
	<li>Spin down elk van de 10 miljoen celsteekproeven bij 300 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Resuspendeer elke pellet in 10 mL 1 x PBS en recentrifuge van de cellen bij 300 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Resuspendeer elke pellet in 10 mL CiA Fix buffer (50 mM pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 0.5 mM ethyleenglycol-bis [ß-aminoethyl ether]-N, N, N', N'-Dinatriumethyleendiaminetetra [EGTA] pH 8, en 100 mM natrium zuurchloride [NaCl]). Voeg vervolgens 1 mL van 11% formaldehyde-oplossing en meteen omkeren de monsters 5 x - 10 x. Incubeer het monster bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Voeg 0,5 mL 2,5 M glycine. De monsters onmiddellijk omkeren en Incubeer het monster op het ijs gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Centrifugeer het monster bij 1.200 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. De bovendrijvende substantie gecombineerd.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 10 mL CiA Rinse 1 (50 mM HEPES pH 8, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8, 10% glycerol, 0,5% Nonidet P-40 [NP40], en 0,25% Triton X100). Incubeer het monster op het ijs voor 10 min. na het centrifugeren op 1200 x g gedurende 5 minuten bij 4 ° C.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 10 mL CiA Rinse 2 (10 mM tris [hydroxymethyl] aminomethane [Tris] pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 0.5 mM EGTA pH 8, en 200 mM NaCl). Centrifugeer het monster bij 1.200 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Zachtjes Voeg 5 mL van de CiA schuintrekken buffer (0,1% SDS 1 mM EDTA en 10 mM Tris pH 8) langs de zijkanten van de conische buis afwassen zout zonder de pellet te verstoren. Centrifugeer het monster bij 1.200 x g gedurende 3 minuten bij 4 ° C. Herhaal de stap wassen.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 90 µL van CiA schuintrekken buffer en verse proteaseinhibitors (gebruik een mengsel van leupeptin, chymostatin en pepstatin A samen op 10mg/mL elke in DMSO ontbonden te maken van een 1.000 x stockoplossing, waardoor een eindconcentratie van 10 µg/mL). Voeg toe 10 µL van ultrasoonapparaat-verbetering nanodroplets terwijl het houden van alles over ijs13,14.</li>
	<li>Breng 100 µL van de oplossing op een glazen buis en dop van de tube.</li>
	<li>Bewerk de monsters gedurende 3,5 minuten ultrasone trillingen ten (bepaald op basis van het aantal cellen en cellijn). Voorkom oververhitting en installeer de monsters door de monsters in 2-min-maximale cyclustijden verwerken als de totale ultrasoonapparaat keer groter is dan 2 min. Opmerking: De gerichte ultrasonicator gebruikt hier functies op een hoge frequentie (500 kHz). Start de machine op een akoestische kracht van 55 W. De ultrasoonapparaat duur moet worden bepaald door elke afzonderlijke lab.</li>
	<li>Elk monster sonicated chromatine overbrengen in een nieuwe 1.5-mL microcentrifuge buis. Draai de buizen bij 8.000 x g gedurende 2 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Ga als volgt te van de chipfabrikant kit protocol om te analyseren de shearing efficiëntie en te kwantificeren van de relatieve hoeveelheid chromatine. Opmerking: Bepaal de concentratie van DNA spectrophotometrically (bijvoorbeeldmet behulp van een instrument van DNA nanodrop), en stormloop ~ 200 ng van DNA op een 1% agarose gel om te verifiëren dat de chromatine is sonicated tot ongeveer 200-500 basepairs (bp) in grootte.</li>
	<li>Voor het uitvoeren van immunoprecipitation en isoleren van de chromatine, volg de ChIP kit fabrikant protocol. Opmerking: Voor de immunoprecipitation van monsters met hogere concentraties van DNA, de elutie buffer bij 37 ° C warm en elueer de monsters 2 x met 30 µL van elutie buffer (spinnen voor 1 min elke keer).</li>
	<li>Voor het uitvoeren van qPCR, de reagentia in een 384-well plaat te laden. Voeg 5 µL van 2 x asymmetrische cyanine kleurstof master mix, 2,5 µM van elk primer, water en 0.1 - 10 ng van DNA voor elke reactie.<ol>
<li>Ontwerp inleidingen tot het versterken van 50-100 bp waarbij en CT-waarden zijn genormaliseerd naar een house-keeping gen, intracisternal A-type deeltjes (IAP). Opmerking: Zie voor verdere qPCR methoden, van de fabrikant van de kit protocol. De set van de primer gebruikt te richten op de locus Oct4 was: (F) de CACATGAAGCAGCACGACTT; (R) CCTTGAAGAAGATGGTGCGC. De primer van de controle instellen doel IAP gewend was: (F) de ATTTCGCCTAGGACGTGTCA; (R) ACTCCATGTGCTCTGCCTTC.</li>
		<li>Gebaseerd op de inleidingen en het gewenste product, de qPCR met 40 cycli van een onthardende temperatuur van 60 ° C voor 1 min lopen. Opmerking: De resulterende gegevens was quantitated met behulp van de delta-delta Ct vergelijkingen tussen de monsters, met CiA:Oct4 over IAP genormaliseerd. De uiteindelijke analyseresultaten worden weergegeven als gemiddelden van drievoudige experimentele monsters, met de fout weergegeven als de standaarddeviatie van het gemiddelde.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Alabert, C., Groth, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22358331">Chromatin replication and epigenome maintenance.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).</li>
<li>Venkatesh, S., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+exchange%2C+chromatin+structure+and+the+regulation+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).</li>
<li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li>
<li>Gräff, J., Tsai, L. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation%3A+molecular+mnemonics+on+the+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 97-111 (2013).</li>
<li>Verdin, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((50+years+of+protein+acetylation%3A+from+gene+regulation+to+epigenetics%2C+metabolism+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).</li>
<li>Hathaway, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+memory+of+heterochromatin+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics and memory of heterochromatin in living cells.</a> Cell. 149 (7), 1447-1460 (2012).</li>
<li>Ren, J., Hathaway, N. A., Crabtree, G. R., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethering+of+Lsh+at+the+Oct4+locus+promotes+gene+repression+associated+with+epigenetic+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Tethering of Lsh at the Oct4 locus promotes gene repression associated with epigenetic changes.</a> Epigenetics. 13 (2), 173-181 (2018).</li>
<li>Stanton, B. Z., Hodges, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smarca4+ATPase+mutations+disrupt+direct+eviction+of+PRC1+from+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Smarca4 ATPase mutations disrupt direct eviction of PRC1 from chromatin.</a> Nature Genetics. 49 (2), 282-288 (2017).</li>
<li>Koh, A. S., Miller, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+chromatin+repression+by+Aire+provides+precise+control+of+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Rapid chromatin repression by Aire provides precise control of immune tolerance.</a> Nature Immunology. 19 (2), 162-172 (2018).</li>
<li>Chen, T., Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+Controlled+Epigenome+Editing+through+an+Inducible+dCas9+System%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chemically Controlled Epigenome Editing through an Inducible dCas9 System.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (33), 11337-11340 (2017).</li>
<li>Braun, S. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reversible+epigenome+editing+by+endogenous+chromatin+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators.</a> Nature Communications. 8 (1), 560(2017).</li>
<li>Butler, K. V., Chiarella, A. M., Jin, J., Hathaway, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Gene+Repression+Using+Novel+Bifunctional+Molecules+to+Harness+Endogenous+Histone+Deacetylation+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeted Gene Repression Using Novel Bifunctional Molecules to Harness Endogenous Histone Deacetylation Activity.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), (2018).</li>
<li>Kasoji, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavitation+Enhancing+Nanodroplets+Mediate+Efficient+DNA+Fragmentation+in+a+Bench+Top+Ultrasonic+Water+Bath%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath.</a> PLoS ONE. 10 (7), 0133014(2015).</li>
<li>Chiarella, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavitation+enhancement+increases+the+efficiency+and+consistency+of+chromatin+fragmentation+from+fixed+cells+for+downstream+quantitative+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications.</a> Biochemistry. 57 (19), 2756-2761 (2018).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+transcriptional+modulation+with+orthogonal+and+inducible+dCas9+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators.</a> Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We beschreven hier, de onlangs ontwikkelde CEM systeem wordt toegepast voor het regelen van genexpressie en chromatine omgeving op een specifiek gen op een dosis-afhankelijke manier. Wij bieden een nauwkeurige methode om te studeren van de dynamiek die betrokken zijn bij het reguleren van de genexpressie door de selectieve aanwerving van specifieke endogene chromatine regelgevende eiwitten. Dit is een zeer modulair technologie die kan worden toegepast om te onderzoeken hoe de verschillende eiwit - en chromatine-aanpassen...

Chromatine bestaat van DNA, histone octamer eiwitten die de kern nucleosoom particle vormen gewikkeld. Regulering van de chromatine verdichting is een essentieel mechanisme voor goede DNA reparatie, replicatie en expressie1,2,3. Unidirectioneel in die cellen het toegangsniveau verdichting is door de toevoeging of verwijdering van verschillende posttranslationele Histon staart wijzigingen. Twee dergelijke wijzigingen omvatten lysine (1) acetylation, die wordt meestal geassocieerd met gene activering, en (2) lysine methylering, die kan worden gekoppeld aan gene activering of onderdrukking, afhankelijk van de context van het aminozuur. De toevoeging van de acetylation en methylation merken wordt gekatalyseerd door Histon acetyltransferases (hoeden) en Histon methyltransferases (HMTs), respectievelijk, overwegende dat de opheffing van het merk wordt gedaan door Histon deacetylases (HDACs) en Histon demethylases (HDMs ), respectievelijk4,5. Hoewel het bestaan van deze eiwitten is gekend voor decennia, veel mechanismen van hoe chromatine-aanpassen machines blijven werken voor het goed regelen van genexpressie vast te stellen. Aangezien chromatine regelgevingsprocessen dysregulated in vele ziekten bij de mens, kunnen nieuwe mechanistische inzichten leiden tot toekomstige therapeutische toepassingen.
De chromatine in vivo test (CiA) is een recent beschreven techniek die een chemische inductor van nabijheid (CIP gebruikt) om controle van machines werving chromatine-aanpassen aan een specifieke locus6. Deze technologie is gebruikt om te bestuderen van een groeiende lijst van chromatine dynamiek, waaronder eiwitten Histon-aanpassen, chromatine remodelers en transcriptie factoren6,7,8,9. CIP gebaseerde chromatine binden van exogenously uitgedrukt eiwitten is ook uitgebreid verleden CiA te moduleren van niet-gemodificeerde genetische loci door gebruik met een gedeactiveerde geclusterd regelmatig Interspaced korte palindromische wordt herhaald CRISPR-geassocieerde proteïne (dCas9) 10 , 11. in het systeem van de CiA, mESCs zijn gewijzigd om een verslaggever GFP-gen op de locus van Oct4 , een zeer uitgesproken en strikt gereguleerde gebied van het genoom mESC express. Eerder, dit systeem is toegepast om te beschrijven de dosisafhankelijk en omkeerbare aanwerving van exogenously uitgesproken heterochromatin eiwit 1 (ML1), een enzym dat bindt H3K9me3 en repressieve merken (bvH3K9me3) wordt doorgegeven en DNA Methylation van6. Om te bereiken dit soort rekruteringsstrategie, zijn de mESCs besmet met een plasmide die een FK506-bindend-proteïne (FKBP), gekoppeld aan een Gal4, die een DNA-proteïne-anker dat zich aan een scala van Gal4-bindende stroomopwaarts van het GFP-verslaggever bindt uitdrukt. De cellen zijn ook besmet met een FKBP-rapamycin-bindend domein (FRB) verbonden met HP1. Wanneer de mESCs worden blootgesteld aan lage nanomolar concentraties van het CIP, rapamycin, zowel FRB en FKBP, zijn samengebracht op de locus van het doel. Binnen enkele dagen van rapamycin behandeling, expressie van het target-gen wordt onderdrukt, zoals blijkt uit de fluorescentie microscopie en stroom cytometry en Histon acetylation daalt, aangetoond door ChIP en bisulfiet sequentiebepaling. Terwijl de ontwikkelings- en valideringsfase van deze aanpak aanzienlijke vooruitgang op het gebied van chromatine onderzoek en regelgeving zijn, een nadeel is de vereiste exogene uitdrukking van chromatine-aanpassen machines.
Te maken van de technologie op basis van werving van alleen endogene fysiologisch relevante enzymen en maken een meer modulair systeem, we ontworpen en gekenmerkt roman bifunctionele moleculen, systemen voor continue emissiemeting (Figuur 1)12genoemd. Een onderdeel van het CEMs bevat FK506 die, vergelijkbaar met rapamycin, strak en specifiek bindt aan FKBP. De CEMs zullen dus nog steeds worden aangeworven om de locus Oct4 in de mESCs van de CiA. De andere component van het CEMs is een groep die endogene chromatine-aanpassen machines bindt. In een pilot-studie, we getest CEMs die HDAC remmers bevatten. Hoewel het concept van het gebruik van een inhibitor van de omwenteling te werven HDACs contra-intuïtief lijkt, is de Inhibitor van de omwenteling toch kunnen aanwerven HDAC activiteit naar het gen van belang. Dit wordt bereikt door (1) het omleiden van de HDAC naar de locus, het vrijgeven van het enzym, en het verhogen van de dichtheid van niet-geremde HDACs in het gebied en (2) handhaving HDAC inhibition op de locus, maar het werven repressieve complexen die zich aan de geremde HDACs binden, of (3) een combinatie van beide. In een eerdere studie, we toonden dat het CEMs kundig voor met succes het onderdrukken van het GFP-verslaggever op een dosis - en tijd-afhankelijke manier, alsmede op een wijze die was snel omkeerbaar (dat wil zeggen, binnen 24 uur)12. We het vermogen van de technologie van de CEM hier gepresenteerd aan controle genexpressie met behulp van fluorescentie microscopie, cytometry van de stroom en de mogelijkheid om te controleren de chromatine-omgeving met behulp van de ChIP-qPCR6gekenmerkt. Hier beschrijven we een methode voor het gebruik en karakteriseren van het CEMs, die de aanpassing van dit systeem vergemakkelijken zal te beantwoorden van aanvullende vragen met betrekking tot de chromatine biologie.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013CV</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (voor weefselkweek)</td><td>Corning</td><td>25-060-Cl</td><td></td></tr><tr><td>BME (2-Mercaptoethanol)</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlantic Biologicals</td><td>S11550</td><td>Afzonderlijke partijen getest op kwaliteit</td></tr><tr><td>Covaris buizen</td><td>ThermoScientific</td><td>C4008-632R</td><td></td></tr><tr><td>Covaris doppen</td><td>ThermoScientific</td><td>C4008-2A</td><td></td></tr><tr><td>PEI (polyethyleenimine)</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>Transfectie media (Opti-mem)</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Virus centrifuge buizen</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Virus filtermembraan</td><td>Corning</td><td>431220</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC134220</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsine</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>met EDTA</td></tr><tr><td>0,05 % Trypsine</td><td>Gibco</td><td>25400-054</td><td>met EDTA</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-bl</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green Master Mix (asymmetrische cyanine kleurstof)</td><td>Roche</td><td>4913914001</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab4729</td><td></td></tr><tr><td>(ChIP kit) ChIP-IT Hoge Gevoeligheid Kit</td><td>Active Motif</td><td>53040</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Covaris</td><td>E110</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Optima</td><td>XPN-80</td><td></td></tr><tr><td>SW-32 centrifuge rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>14U4354</td><td></td></tr><tr><td>SW-32 Ti centrifuge emmers</td><td>Beckman Coulter</td><td>130.2</td><td></td></tr><tr><td>LentiX 293 Menselijke Embryonale Nier</td><td>Clontech</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher</td><td>BP9700</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher</td><td>G33-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>Roche</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>MP Biomedicals</td><td>807426</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>Fisher</td><td>BP2474-1</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (voor ChIP)</td><td>Fisher</td><td>BP310-100</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer, Attune NxT</td><td>Thermo Fisher</td><td>A24858</td><td></td></tr><tr><td>FKBP-Gal4 plasmid</td><td>Addgene</td><td>44245</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2 plasmid</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G plasmid</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Nanodroplets</td><td>MegaShear</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DNA Nanodrop</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND1000</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitors (Leupeptin)</td><td>Calbiochem/EMD</td><td>108975</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitors (Chymostatin)</td><td>Calbiochem/EMD</td><td>230790</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitors (Pepstatin)</td><td>Calbiochem/EMD</td><td>516481</td><td></td></tr><tr><td>CiA:Oct4 mESC</td><td>De vriendelijke gift van G. Crabtree</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lif-1C-alpha - producerende Cos cellen</td><td>De vriendelijke gift van J. Wysocka</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

onderdrukken van gene transcriptie door cellulaire machines met chemische epigenetische modifiers omleiden

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulering van de chromatine verdichting is een belangrijk proces dat genexpressie in hogere eukaryoten regelt. Hoewel chromatine verdichting en genregulatie expressie zijn vaak verstoord in veel ziekten, heeft een locus-specifieke, endogene en omkeerbare methode te bestuderen en deze controlemechanismen van actie ontbroken. Om aan te pakken dit probleem, hebben wij ontwikkeld en nieuwe gen-regulering bifunctionele moleculen gekenmerkt. Een onderdeel van het bifunctionele molecule bindt aan een DNA-proteïne-anker zodat het naar een allele-specifieke locus zullen worden aangeworven. De andere component bezighoudt endogene cellulaire chromatine-aanpassen machines, werven van deze eiwitten aan een gen van belang. Deze kleine moleculen, chemische epigenetische modifiers (CEMs), genaamd zijn geschikt voor het beheren van genexpressie en de chromatine milieu dosisafhankelijk en omkeerbare wijze. Hier, detail wij een CEM-aanpak en de toepassing ervan om genuitdrukking en Histon staart acetylation op een verslaggever van de groen fluorescente proteïne (GFP) gelegen op het Oct4 locus in muis embryonale stamcellen (mESCs) te verlagen. We karakteriseren de leiding CEM (CEM23) met behulp van fluorescentie microscopie en stroom cytometry chromatine immunoprecipitation (ChIP), gevolgd door een kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR). Terwijl de kracht van dit systeem is gedemonstreerd op de locus Oct4 , conceptueel, de technologie van CEM is modulair en kan worden toegepast in andere celtypes, en op andere genomic loci.

We onlangs ontwikkelde systemen voor continue emissiemeting en aangetoond dat deze technologie voor het regelen van genexpressie en de chromatine milieu op een verslaggever locus dosisafhankelijk en omkeerbare wijze kan worden toegepast. In Figuur 1wordt een model van het lood CEM, CEM23, weergegeven. HDAC machines is aangeworven om de verslaggever locus door de HDAC-inhibitor, die in dit geval de GFP-verslaggever aan de locus Oct4 ingevoegd.
<p ...

Verordening van de chromatine-milieu is een essentieel proces nodig is voor goede genexpressie. Hier beschrijven we een methode voor het beheersen van de genexpressie door de aanwerving van chromatine-aanpassen machines gen-specifieke en omkeerbare wijze.

Onderdrukken van Gene transcriptie door cellulaire machines met chemische epigenetische Modifiers omleiden

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van epigenetica, zoals de mechanismen van genreregulering en oorzaak-en-gevolgrelaties tussen verschillende chromatine-regulerende elementen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het voor het eerst mogelijk is om een chromatine loci te moduleren met fysiologisch relevante endogene enzymen. Over het algemeen individuen nieuw op deze methode zal worstelen, omdat muis ESL cultuur is inherent moeilijk voor degenen die niet zijn opgeleid in de techniek.Verdere demonstratie van deze methode is van cruciaal belang als cel virale infectie stappen zijn moeilijk te leren. De onderzoeker moet tijd twee afzonderlijke lijnen van de celcultuur en het is noodzakelijk om waakzaam toezicht op de veiligheid tijdens deze stappen. Om te beginnen met het protocol, passage 18 miljoen van 293T HEK cellen per 50 centimeter plaat.Aspirate de oude media en voeg 10 milliliter van een X fosfaat gebufferde zoutoplossing, of PBS. Aspirate de PBS en voeg drie milliliter van 0,05% trypsine. Incubeer de cellen in trypsine gedurende acht minuten bij 37 graden Celsius.Rock en tik op de cellen halverwege de incubatie. De volgende dag, wanneer de cellen 60 tot 80% samenvloeiing hebben bereikt, voert u een polyethyleen, of PEI, transfectie uit. Meng vervolgens voorzichtig het DNA, PEI en transfectiemedia in een 15 milliliter conische buis.Incubeer het monster 15 minuten op kamertemperatuur. Voeg na incubatie de oplossing dropwise toe aan de 15 centimeter plaat. Vervolgens, incubeer het monster voor 16 uur in een 37 graden Celsius incubator met 5% kooldioxide.De volgende dag, aspirate de media en voorzichtig vervangen door voorverwarmde, verse 293 HEK media aan de 15 centimeter platen. Na de media-uitwisseling, incubeer de cellen in een 37 graden Celsius incubator met 5% kooldioxide voor 48 uur. Tel de cellen met een hemocytometer.Passage eerder bereid mESC in een 12 goed plaat formaat met 100,000 cellen per put een dag voorafgaand aan infectie. Voor cellen geteeld in een 10 centimeter formaat, aspirate de oude media, voeg vijf milliliter van een X PBS, aspirate de PBS, en voeg een milliliter van 0,25% trypsine. Incubeer de cellen in trypsine gedurende acht minuten bij 37 graden Celsius en rock en tik de cellen halverwege de incubatie.48 uur na de media-uitwisseling, verwijderen en overdragen van de supernatant van de 293T HEK cellen naar een 50 milliliter conische buis. Centrifuge de supernatant op 300 keer G gedurende vijf minuten om de cel puin pellet. Vervolgens filtert u de supernatant door een membraan van 0,45 micron.Concentreer het virus via ultracentrifuge met een SW32-rotor en draai het monster twee en een half uur op 72.000 keer G bij vier graden Celsius. Terwijl het virus zich concentreert onder ultracentrifugatie, behandel de CIA mESC's in de 12 put plaat met verse embryonale stam of ES media met vijf microgram per milliliter polybrene. Wanneer de virusconcentratie is voltooid, zorgvuldig aanzuigen de supernatant en zorgvuldig opschorten het virus pellet in 100 microliter van een X PBS om overtollige bellen te voorkomen.Voeg het virus en een X PBS toe aan een 1,5 milliliter Microfuge buis. Vortex de buis op de laagste stand om het virus volledig op te schorten. Draai de buis in een mini tafelblad centrifuge gedurende vijf tot 10 seconden om bubbels te verwijderen.Voeg 30 microliter van het virus toe aan elke put van een 12 putplaat. Draai de plaat en centrifugeren de monsters op 1000 keer G gedurende 20 minuten. Plaats de 12 put plaat terug in de 37 graden Celsius incubator 's nachts.De volgende ochtend, de media uit te wisselen met verse ES-media en laat infectie plaatsvinden voor 48 uur. Na 48 uur infectie, selecteer voor cellen die de virale plasmid geïntegreerd door het toevoegen van de juiste antibioticum. Verander de media dagelijks.Houd de selectiemedia 72 tot 96 uur op de cellen in een 37 graden Celsius incubator met 5% kooldioxide. Ga verder met chemische epigenetische modifier, of CEM, voorbereiding en behandeling door de CEM en dimethylsulfoxide, of DMSO, op te schorten tot een voorraadconcentratie van één millimolar en een werkconcentratie van 100 micromolar. Nadat de cellen selectie hebben ondergaan gedurende 72 tot 96 uur, splits de mESC's in een 12 put formaat met 100.000 cellen per put.Incubeer de cellen in een 37 graden Celsius incubator met 5% kooldioxide gedurende 24 uur. Bereid na incubatie een mediaoplossing van 100 nanomolar CEM met ES-media voor. Gebruik de media om de CIA mESC te voeden met een milliliter goed.Houd een put van cellen zonder toegevoegde CEM's om te dienen als een controle. Vervolgens verander de media door het aspirating van de oude media en het toevoegen van een milliliter per goed off vers bereide CEM met of CEM gratis ES-media om de 24 uur voor de duur van het experiment. Na 48 uur behandeling cem, beeld de cellen zonder CEM behandeling in de cellen behandeld met 100 nanomolar CEM met behulp van een fluorescentie microscoop.Neem representatieve afbeeldingen met behulp van fase of helder veld om de mESC morfologie op te nemen bij 10 tot 40 keer vergroting. De cellen zouden zich rond kolonies met een paar onderscheiden cellen moeten gevormd hebben. Onder het FITC-fluorescentiekanaal geven beide celaandoeningen beeld.Vervolgens isoleer de controle en CEM behandelde cellen voor stroomcytometrie door de media te aspireren, de cellen te wassen met één milliliter van één X PBS, de PBS te aspireren en 0,25 milliliter van 0,25% trypsine toe te voegen met EDTA gedurende acht tot 10 minuten. Bevestig dat de cellen niet langer worden gebundeld in grote klonten door de microscoop met behulp van 20 keer vergroting. Als de cellen niet lijken te zijn in een enkele cel suspensie, voorzichtig pipette ze op en neer met een P1000 pipet om volledig trypsinize de cellen.Blus de trypsine met een milliliter verse media en resuspend de cellen op hoge snelheid met een serologische pipet totdat de cellen in een enkele cel suspensie. Draai vervolgens vijf minuten lang de cellen op 300 keer G bij kamertemperatuur. Aspirate de supernatant, was de cellen met een X PBS, en centrifugeren de cellen.Aspirate de PBS supernatant en resuspend de cel pellet in 200 microliters van FACS buffer. Voer stroomcytometrie uit op ongeveer 50.000 cellen met de zwevende cellen en voer de monsters uit met een schedesnelheid van ongeveer 5.000 cellen per seconde. Ten slotte exporteren van de gegevens voor verdere analyse.Fasebeelden van het CEM-systeem op de Oct4-locus en CIA mESC's worden afgebeeld na 48 uur behandeling met 100 nanomolar CEM23 of met onbehandelde cellen wijzen op specifieke GFP-onderdrukking. Fluorescerende beelden tonen een heldere GFP-expressie in de controlecellen en een verminderde GFP-expressie in mESC's behandeld met CEM23. Flow cytometrie toonde consequent een meer dan 30% afname van de GFP-expressie in de CIA mESC's behandeld met 100 nanomolar van CEM23 gedurende 48 uur.Chromatine immunoprecipitatie, of CHIP, zwelg dat 48 uur behandeling met 100 nanomolar van CEM23 het niveau van H3K27ac op de doel locus verminderde in vergelijking met controlecellen. Tijdens een poging deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om voorzichtig te zijn met de muis embryonale stamcellen. Als ze tijdens het protocol differentiëren, worden de resultaten tenietgedaan.Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van synthetische biologie om de in vivo mechanismen in het zoogdiergenoom te verkennen.

repressing-gene-transcription-redirecting-cellular-machinery-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Hier wordt een nieuwe methode gepresenteerd die de omzetting van volwassen huidfibroblasten in insulineproducerende cellen mogelijk maakt. Deze techniek is gebaseerd op epigenetische omzetting, gebruikt geen retrovirale vectoren en vereist geen verkrijging van een stabiel pluripotente toestand. Het is daarom zeer veelbelovend voor toepassingen in de translationele geneeskunde.

Epigenetische Conversie als een veilige en eenvoudige methode om insuline-afscheidende cellen van volwassen huidfibroblasten

Gedetailleerde protocollen voor de invoering van een gemanipuleerde split-TET2 enzym (appelwijn) in zoogdiercellen voor chemische afleidbare DNA-hydroxymethylation en epigenetische remodeling worden gepresenteerd.

Een gemanipuleerde Split-TET2 enzym voor chemische-afleidbare DNA Hydroxymethylation en epigenetische Remodeling

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn voor het genereren van een modelsysteem waarin de transcriptie van een endogene gen van belang voorwaardelijk kan worden gecontroleerd in de levende dieren of cellen met behulp van verbeterde lac -onderdrukker en/of tet activator systemen.

In vivo toepassing van het systeem van de afstandsbediening voor de manipulatie van de endogene genexpressie

Gerichte DNA epigenome bewerken vertegenwoordigt een krachtige therapeutische aanpak. Dit protocol beschrijft de productie, reiniging en concentratie van de alles-in-één lentivirale vectoren herbergen van de CRISPR-dCas9-DNMT3A-transgenic voor bewerken van epigenome's in menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleid van neuronen.

Lentivirale Vector Platform voor de efficiënte levering van Epigenome-bewerkingsgereedschap in mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige ziekte modellen

We presenteren hier een methode die het gebruik van chemische epigenetische wissing combineert met mechanosensing-gerelateerde signalen om efficiënt pluripotente cellen van zoogdieren te genereren, zonder de noodzaak van gentransfectie of retrovirale vectoren. Deze strategie is daarom veelbelovend voor translationele geneeskunde en vertegenwoordigt een opmerkelijke vooruitgang in stamcelorganoïde technologie.

Een strategie in twee stappen die epigenetische modificatie en biomechanische signalen combineert om pluripotente cellen van zoogdieren te genereren

Hier presenteren we een protocol voor de in vitro selectie van gemanipuleerde transcriptionele repressoren (ETR's) met een hoge, langdurige, stabiele, on-target uitschakelingsefficiëntie en een lage genoombrede, off-target activiteit. Deze workflow maakt het mogelijk om een initieel, complex repertoire van kandidaat-ETR's terug te brengen tot een shortlist, geschikt voor verdere evaluatie in therapeutisch relevante settings.

In vitro Selectie van gemanipuleerde transcriptionele repressoren voor gerichte epigenetische uitschakeling

Het protocol beschrijft methoden voor geclusterde, regelmatig tussenliggende korte palindromale herhalingen (CRISPR)-gebaseerde epigenoombewerking in menselijke cellijnen met behulp van plasmide-DNA-transfectie en mRNA-nucleofectie.

CRISPR-epigenoombewerking in menselijke cellen met behulp van plasmide-DNA-transfectie en mRNA-nucleofectieafgifte

Dit protocol beschrijft een niet-integratief, episomaal CRISPR/dCas9-gebaseerd systeem voor gerichte epigenetische bewerking in K562-cellen, waarbij dCas9-DNMT3A- en dCas9-HDAC1-effectoren worden gecombineerd met specifieke sgRNA's om locusspecifieke DNA-methylering met precisie te induceren en off-target-effecten te verminderen.

Epigenetische manipulatie van K562-cellen: dual-vector episomale strategie voor stabiele gerichte DNA-methylering met behulp van dCas9-DNMT3A en -HDAC1 fusie-eiwitten

Hierin beschrijven we protocollen voor het oogsten van muizen-alveolaire macrofagen, die aangeboren immuunsysteem cellen woonachtig zijn in de longen, en de behandeling van hun activering in reactie op de co-cultuur met polyanhydride nanodeeltjes.

Oogsten Murine alveolaire macrofagen en evalueren van cellulaire activatie geïnduceerd door polyanhydride Nanodeeltjes

In dit artikel beschrijven we een methode gebruik te maken van multi-spectraal imaging flowcytometrie om de internalisering van polyanhydride nanodeeltjes of bacteriën door RAW 264.7 cellen te kwantificeren.

Het analyseren van cellulaire internalisatie van nanodeeltjes en bacteriën door Multi-spectrale Imaging flowcytometrie

Ontdek een methode voor genexpressiecontrole door chromatin-modificerende machines te rekruteren met chemische epigenetische modifiers in muizen embryonale stamcellen.

Onderdrukken van Gene transcriptie door cellulaire machines met chemische epigenetische Modifiers omleiden

Meer video's verkennen