Neurogenese met behulp van P19 embryonale carcinoom cellen

P19 cellijn is bekend te onderscheiden in neuronen. Echter, protocol voor neuron differentiatie van P19 cellijn zijn soms ingewikkeld. Deze methode stelt ons in staat om het neurogene experiment op een gebruiksvriendelijke manier uit te voeren en de mogelijkheid van het gebruik van P19-cellijn voor de toekomst uit te breiden.

Om te beginnen, handhaven P19 cellen in onderhoud medium, bestaande uit DMEM, met 4,5 gram per liter glucose, aangevuld met 10% foetale runder serum, 100 eenheden per milliliter penicilline, en 100 eenheden per milliliter streptomycine. Incubeer de celcultuur in een 37 graden Celsius en 5%koolstofdioxide milieu totdat de cellen zijn ongeveer 80%confluent. Verwijder het gebruikte medium uit de celkweekkolf en was de cellen met twee milliliter calcium- en magnesiumvrije PBS.

Voeg een milliliter van 0,25% trypsin-EDTA toe om de monolaag van de cellen volledig te bedekken en uit te broeden op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende twee tot drie minuten. Controleer onder een microscoop of alle cellen los zijn. Resuspend de cellen in negen milliliter onderhoud medium om de trypsine te neutraliseren.

Breng de cellen in een 15-milliliter buis en centrifuge op 200 keer G en kamertemperatuur gedurende vijf minuten om de cellen pellet. Dan, aspirate de supernatant zonder verstoring van de pellet. Resuspend de pellet in 10 milliliter vers onderhoudsmedium en gebruik een cel teller om het celnummer te bepalen volgens de instructies van de fabrikant.

Zaad 20.000 cellen per vierkante centimeter in een nieuwe T-25 kolf en voeg tot 10 milliliter onderhoudsmedium toe. Incubeer bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende twee tot drie dagen. Om te beginnen trypsine spijsvertering, eerst langzaam aanzuigen van de supernatant en was de cellen met twee milliliter calcium en magnesium-vrije PBS.

Voeg vervolgens een milliliter van 0,25% trypsine EDTA toe aan de cellen en broed ze uit bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende twee tot drie minuten. Na de incubatie, om de trypsine te neutraliseren, de cellen opnieuw op te zetten in negen milliliter differentiatiemedium, bestaande uit DMEM met een hoog glucosegehalte en aangevuld met 5%foetaal runderserum, 100 eenheden per milliliter penicilline en 100 eenheden per milliliter streptomycine. Breng de cellen in een 15-milliliter buis en centrifuge op 200 keer G en kamertemperatuur gedurende vijf minuten om de cellen pellet.

Dan, langzaam aspirate de supernatant en resuspend de pellet in een milliliter van verse differentiatie medium zonder RA. Gebruik een celteller om het celnummer te bepalen volgens de instructies van de fabrikant. Voor geaggregeerde generatie, beginnen met het toevoegen van 10 milliliter differentiatie medium, aangevuld met vijf microliter ra aan een 100-milliliter, niet-behandelde kweekschotel. Zaad een miljoen cellen in de kweekschaal en broed op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende twee dagen om de vorming van aggregaten te bevorderen.

Na de incubatie, met een pipet van 10 milliliter, het medium met de aggregaten aanzuigen en overbrengen naar een buis van 15 milliliter bij kamertemperatuur. Wacht 1,5 minuten tot de aggregaten zich onderaan nestelen en gooi de supernatant weg. Voeg 10 milliliter vers differentiatiemedium toe, aangevuld met 0,5 micromolar RA. Zaad voorzichtig de aggregaten in een nieuwe 100-millimeter, niet-behandelde kweekschotel en incubbate bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende twee dagen.

Gebruik om te beginnen een pipet van 10 milliliter om de celaggregaten over te brengen naar een buis van 15 milliliter. Wacht 1,5 minuten op kamertemperatuur voor de aggregaten te vestigen op de bodem en gooi de supernatant. Was de aggregaten met serum en antibioticavrije DMEM.

Wacht tot celaggregaten zich onderaan vestigen, gooi de supernatant weg en voeg twee milliliter van 0,25% trypsin EDTA toe. Incubeer de buis in een waterbad op 37 graden Celsius gedurende 10 minuten, tikken om de twee minuten om de cellen in suspensie te houden. Voeg vervolgens vier milliliter onderhoudsmedium toe om de trypsineactiviteit en pipet 20 keer op en neer te stoppen met behulp van een pipet van één milliliter.

Tot slot, centrifugeren de cellen op 200 keer G en kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Verwijder de supernatant en resuspend de cel pellet in vijf milliliter onderhoud medium. Gebruik een celteller om het celnummer te bepalen en ga verder met het platbeteren van de cellen.

Om cellen te plaat, eerst drie milliliter per put van onderhoud medium toe te voegen aan een zes-put cultuur plaat. Zaai vervolgens de cellen met een dichtheid van 500.000 per put. Broed de plaat uit op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.

Zaad de cellen op dekbril in een zes-put cultuurplaat. Wanneer ze 20% samenvloeiing bereiken, ga je over tot immunostaining met Anti-MAP2-antilichaam. Isoleer vervolgens RNA en voer reverse transcriptie PCR uit voor MAP2, NueN, OCT4, NANOG en een GAPDH.

In deze studie wordt een vereenvoudigde methode voor neuronale differentiatie geïntroduceerd. De P19 cellijn is gekweekt in een niet-behandelde kweekschotel met 5%FBS en 0,5 micromolar RA. Na vier dagen worden de celaggregaten gescheiden met trypsine en de komende vier dagen op een aanhangende celkweekplaat gezaaid. De efficiëntie van deze methode wordt geëvalueerd door de vergelijking tussen RTPCR-analyse van de P19-cellijn in een ongedifferentieerde toestand en tijdens neurogenese.

De resultaten tonen een snelle afname van de expressie van pluripotentiegenen, zoals Oct4 en NANOG, en upregulatie van neurnomale markergenen, zoals MAP2 en NeuN. Wij geloven dat de methode ontwikkeld in deze studie is eenvoudig en zal een rol spelen bij het ophelderen van de moleculaire mechanismen van neurogenese, evenals neurodegeneratieve ziekte.