Inductie van atherosclerotische Plaques door activering van Mineralocorticoïden receptoren in apolipoproteïne E-deficiënte muizen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de pathofysiologie van vroege atherosclerose bij muizen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de efficiëntie, snelheid waarmee aldosteron de ontwikkeling van atherosclerose plaques in volwassen groei induceert. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang als sommige technische stappen zijn moeilijk te leren door middel van tekst instructie alleen.

Het aantonen van de procedure zal Caterina Mammi zijn, een stafwetenschapper van mijn lab. Het dragen van chirurgische handschoenen, bevestig de mini-pomp vulbuis aan een een milliliter spuit en laad de buis met 125 microliters van de aldosteron of voertuig oplossing. Steek de vulbuis door het gat aan de bovenkant van de minipomp totdat deze niet verder kan en vul de pomp langzaam met de aldosterone-oplossing.

Stop met het vullen van de pomp wanneer een kraal vloeistof uit het pomplichaam opkomt en verwijder voorzichtig de vulbuis. Steek de stroomregelaar in het lichaam van de minipomp, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de regelaar stevig tegen het pomplichaam wordt gezaaid en prime de gevulde pomp in een beker met steriele zoutoplossing bij 37 graden Celsius, tot 24 uur voor de implantatie. Om de pompen te implanteren, gebruik een scheermes om het haar te verwijderen van de chirurgische site en desinfecteren de blootgestelde huid met 70% isopropyl alcohol gedrenkt, niet-geweven pad materiaal.

Maak vervolgens een incisie van 0,8 tot 1 centimeter door de huid, maar niet de onderliggende weefsels en gebruik tangen om de incisie te openen. Met behulp van een trocar in de andere hand, verspreid de huid om een zak voor de pomp te creëren van de incisie in de richting van het schouderblad en steek de pomp in de incisie, met het hoofd van de regulator gericht op de voorkant van de muis, zachtjes duwen de pomp volledig in de zak, zodat er genoeg huid om de wond te sluiten zonder spanning of stretching. Zodra de pomp is ingebracht, hecht de incisie met chirurgie draad en gebruik een schoon uitstrijkje om actuele, 10%povidone jodium zalf toe te passen.

Laat de muis vervolgens herstellen op een opwarmend stadium met monitoring tot volledige recumbency. Op het juiste experimentele eindpunt, doorsnijd de muis via de linker ventrikel met behulp van zwaartekrachtperfusie met 10 tot 15 milliliter ijskoude DPBS, gevolgd door 40 tot 50 milliliter van 10% van de neutrale gebufferde geformuleerd. Na 10 tot 20 minuten, plaats de muis onder stereo-microscoop en gebruik tang en schaar om de overtollige periaort en pericardial vetweefsel te verwijderen.

Houd het vaste hart met tangen vast en snijd loodrecht op de toegang van de aortaboog, zo dicht mogelijk bij het hart, zonder schade te veroorzaken. Zodra het hart is gescheiden van de aorta, gebruik dan een scalpel om dwars te snijden langs een rechte lijn, het aansluiten van de onderste punten van het rechter en linker atrium en vul het bovenste gedeelte van het open hart met optimale snijtemperatuur verbinding. Plaats het gereseceerde weefsel met een cryo-sectie plastic mal met de as van de aorta loodrecht geplaatst op de basis van de rechthoekige mal en bedek het weefsel met verse OCT.

Backlight de mal om ervoor te zorgen dat het weefsel goed is georiënteerd, dan zorgvuldig plaats de mal op een metalen plaat op droog ijs, wikkelen de hele mal met zilverfolie voor min 80 graden Celsius opslag wanneer de OKT wit wordt. Wanneer de cryo-stat min 20 graden Celsius bereikt, zet u het bevroren hartblok op de monsterhouder met de ventriculaire naar buiten gericht en plaats het monster houder in het monster oriënteren hoofd. Pas de oriëntatie van de monsterhouder aan om het blok te doorsnijden met de aortawortel loodrecht op het blad en snijd het blok door tot de aortawortel is bereikt.

Verzamel seriële secties op glazen platen, het toezicht op de anatomische aorta wortel profiel, totdat alle drie aortakleppen verschijnen. Verzamel vervolgens zes tot acht, 10 micrometer dikke secties of totdat een van de drie kleppen verdwijnt of niet meer intact is. Voor olierode O neutrale vet vlekken, bevestig de secties in 70 milliliter van 37%formaldehyde gedurende vijf minuten, gevolgd door een grondige wassen in leidingwater.

Na twee tot drie minuten, vlekken uit toegang water en vlek de secties in 70 milliliter van 0,3% olie rood O gedurende 10 minuten. Aan het einde van de incubatie, was de glijbanen in leidingwater gedurende 10 minuten en vlek de cellen gedurende een minuut in 70 milliliter van Meyer's hematoxylin, gevolgd door een een minuut water wassen en een minuut emersion in 70 milliliter van 0,5% lithiumcarbonaat. Was vervolgens de cellen in water voor een laatste minuut en monteer de secties met een waterig montagemedium voor beeldvorming door lichtmicroscopie.

Na vier weken behandeling vertoonden apolipoprotein-E knock-outmuizen een aanzienlijke toename van het lipidegehalte, vergeleken met controlewilde dierdieren. Bovendien verhoogt de behandeling met aldosteron het macrofaaggehalte bij knock-outdieren, zoals blijkt uit mack-3-vlekken en een meer ontstoken atherosclerotische plaque bij deze dieren in vergelijking met met voertuigen behandelde muizen. Echter, aldosteron behandeling verandert niet collageen gehalte van atherosclerotische plaques.

Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat deze methode alleen wordt gevalideerd voor apolipoproteïne muizen die van nature geneigd zijn om atherosclerose te ontwikkelen wanneer ze een atherogene kleurstof worden gevoed. Daarom kan het niet worden toegepast op verschillende diermodellen. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals infrarood-kleuring worden uitgevoerd om atherosclerose in andere aortaregio's te karakteriseren en het totaal van atherosclerotische lasten te kwantificeren.

Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van atherosclerose om een vroeg mechanisme van atherogenese te onderzoeken, zoals ontsteking en endotheeldisfunctie. Vergeet niet dat het werken met vluchtige stoffen zoals isofaan en formaline zeer gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van veiligheidslab gezichtsmasker moet altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.