Name: Laser-assisted lentivirale Gene levering aan muis bevruchte eieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Leer laserondersteunde lentivirale gentransfer naar bevruchte muizeieren via perforatie van de zona pellucida. Deze methode maakt snelle ontwikkeling van transgene muismodellen mogelijk zonder gespecialiseerde micromanipulatievaardigheden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek werd gesteund door de intramurale programma van het onderzoek van het National Institute of Health (NIH), National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS). Wij zijn dankbaar aan Dr Robert Petrovich en Dr. Jason Williams voor de kritische lezing van het manuscript en nuttig advies. Wij wil ook erkennen en Dr. Bernd Gloss, de Knockout kern, de Stroom Cytometry faciliteit, de fluorescentie microscopie en Imaging Center, en de faciliteiten van de vergelijkende tak van de geneeskunde van de NIEHS voor hun technische bijdrage bedanken. We zouden graag bedank Mr. David Goulding van de vergelijkende tak van de geneeskunde en Ms. Lois Wyrick van het Imaging Center op de NIEHS voor ons te voorzien van foto's en illustraties.

Alle dierlijke procedures en behandelingen in dit protocol gebruikt werden in overeenstemming met de richtsnoeren van de dierenverzorgers NIH/NIEHS en werden goedgekeurd door de zorg van het dier en gebruik Comité (ACUC) op de NIH/NIEHS, dier Protocol 2010-0004.
1. voorbereiding
<ol><li>Bereiden/aankoop van recombinante niet-teeltmateriaal lentivirussen uitvoering van uw gen van belang. In deze studie, lentivirus SBI511 uiten eenoogkreeftjes groen fluorescent proteïne (copGFP; afgekort tot GFP) vanaf een rek factor 1a promotor voor signaaltransductie werd gebruikt. 2 werden gebruikt voor de productie van standaardprotocollen en titer lentivirussen op titers hoger dan 1e8 transducing eenheden per mL (TU/mL). Opmerking: Wees voorzichtig en bleken alle materiaal dat in contact lentivirussen zijn geweest. Verwijzen naar uw instituut richtsnoeren voor veilig gebruik en behandeling van lentivirussen.</li>
	<li>Setup fokken paren van gewenste muis stam de dag vóór het oogsten van embryo's. In dit experiment, werd C57BL/6J stam van muizen gebruikt. Vrouwelijke muizen gebruikt voor eierstokken en oviduct collectie werden niet behandeld met hormonen voor superovulatie.</li>
	<li>2 – 24 h vóór de oogst muis bevrucht de eieren, bereiden verschillende kalium Simplex geoptimaliseerd Medium24 (KSOM) drop platen als volgt: Voeg een druppel van de 50 μl van KSOM medium naar het midden van een 35 mm Weefselkweek behandeld schotel en dek met 2 mL Dimethylpolysiloxaan (DMPS5X) en bij 37 oC, 5% CO2, 5% O2 en 90% N2 equilibreer. Opmerking: Gebruik wegwerp steriele platen en negeren na blootstelling aan lentivirussen.</li>
	<li>Bereiden 1 x oplossing van hyaluronidase in M2 medium uit stockoplossing (100 x, 30 mg/mL, bewaren bij-20 ° C). 100 x stamoplossing bereid was in water.</li>
	<li>24 h post laser-assisted transductie van muis bevruchte eieren, instellen paren tussen het vasectomized vrouwelijke en mannelijke muizen te bereiden pseudopregnant vrouwelijke muizen fokken.</li>
</ol>2. isolatie van muis bevruchte eieren
<ol><li>16 – 24 h post paring, selecteer vrouwelijke muizen met vaginale stekkers indicatieve van succesvolle paring en humaan euthanaseren25. De muizen gebruikt in deze studie werden euthanized door cervicale dislocatie onder diepe inademing van CO2 of Isofluraan.</li>
	<li>Isoleren van de eierstokken en oviducts volgens standaardprotocollen25.</li>
	<li>De eierstokken en de oviducts overbrengen in een 35 mm-schotel met M2 media.</li>
	<li>Voor iedere eierstok, scheuren ampul uit elkaar om bevruchte eieren omgeven door cumulus cellen vrij te geven.</li>
	<li>Overdracht van bevruchte eieren en cumulus cellen tot een 35 mm schotel bevattende 1 x hyaluronidase in M2 medium en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3-5 minuten.</li>
	<li>Pipetteer bevruchte eieren op en neer om de cumulus cellen vrij te geven.</li>
	<li>Bevruchte eieren overbrengen in een 35 mm-schotel met M2 media en Pipetteer op en neer naar hyaluronidase afwassen.</li>
	<li>Bevruchte eieren overbrengen in een 35 mm-schotel met KSOM en Pipetteer omhoog en omlaag om de resterende M2 media en hyaluronidase afwassen.</li>
	<li>Bevruchte eieren over te brengen naar de bereid KSOM drop platen vanaf stap 1.3. Opmerking: Muis bevruchte eieren in KSOM moeten worden bewaard in een incubator weefselkweek bij 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 en 90% N2 equilibreer. Het verwijderen van platen uit de incubator voor langer dan 15 min zal resulteren in schade aan embryo's.</li>
	<li>Toestaan dat bevruchte eieren te herstellen voor 2 h in de incubator voordat u naar de volgende stap.</li>
</ol>3. perforatie van muis bevruchte eieren met XYClone Laser
<ol><li>Setup en kalibreren van XYClone laser volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Andere lasers, doorgaans gebruikt voor in vitro bevruchting, kunnen worden vervangen voor XYClone laser perforate bevruchte eieren.<ol>
<li>De laser controller vak draad aan de laser apparatuur op de Microscoop te koppelen.</li>
		<li>Bevestig het vak laser controller op de computer met de laser software via een USB-poort. 3.1.3. Sluit de laser-controller en de server inschakelt.</li>
		<li>Kijkend door het oculair, perforate een test sample (bijvoorbeeld droge wissen markeringen op een glasplaatje).</li>
		<li>Gebruik een kleine schroevendraaier (inbegrepen in de laser kit) om te passen van de X- en Y-positie van de laser aan de LED licht zichtbaar door het oculair Microscoop en kalibreren van de laser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaats een KSOM drop plaat met muis bevruchte eieren in het werkgebied van de Microscoop. Houd niet de plaat buiten de incubator voor langer dan 15 min.</li>
	<li>Kijk door de Microscoop oculair en ervoor zorgen dat de embryo's zona zitten scherpgesteld is en de laser LED-licht zichtbaar.</li>
	<li>Het stadium van de Microscoop te richten op de zona met de LED-licht/laser verplaatsen</li>
	<li>Met behulp van de computersoftware ingesteld XYClone laser op 250 µs.</li>
	<li>De LED licht grootte naar de gewenste afmetingen (het opzetten van 5 in dit experiment) aanpassen.</li>
	<li>De zona van elke bevruchte eicel perforate driemaal met de laser. De zona kan worden doorboord of verdund. Met behulp van de bovenstaande instellingen, zal de laser produceren een gat met een diameter van 10 μm (Figuur 2). Opmerking: Gericht dicht bij het lichaam van polar houdt laser van de embryonale cel is verwijderd.</li>
	<li>Toestaan dat bevruchte eieren te herstellen voor 2 h in de weefselkweek incubator voordat u naar de volgende stap.</li>
</ol>4. transductie van muis bevruchte eieren na XYClone Laser perforatie
<ol><li>Pipetteer 2 μL van geconcentreerde lentivirus (groter dan 1e8 TU/mL titer) in de 50 μl KSOM drop. Doen niet Pipetteer omhoog en omlaag. Bevruchte eieren hechten gemakkelijk aan het uiteinde van de pipet. Gebaseerd op onze ervaring, 1e5-5e5 transducing eenheden van lentivirus in een volume van minder dan 3 μL is optimaal voor de levering van het gen.</li>
	<li>Toestaan dat bevruchte eieren blastocyst ontstaan voor 4 dagen in de incubator. Geen behoefte om te veranderen van de media.</li>
</ol>5. niet-chirurgische overdracht van getransduceerde muis embryo's aan pseudo-zwangere muizen
<ol><li>Gebruik pseudopregnant muizen, 3,5 dag na de paring, bereid in stap 1.5.</li>
	<li>Gebruik niet-chirurgische Embryo Transfer (NSET) apparaat om te inplanteren muis embryo's in pseudopregnant muizen.<ol>
<li>Voeg met behulp van een Microscoop chirurgische of ontleden een vaginaal speculum om de baarmoederhals te visualiseren.</li>
		<li>De niet-chirurgische Embryo Transfer (NSET) apparaat ongeveer 5 mm in de baarmoederhals en storting embryo's in een volume van ongeveer 2 μL invoegen. Opmerking: Een steriele NSET apparaat gebruikt voor elke overdracht en verwijderd na de ingreep. Alle reagentia gebruikt in de manipulatie van de embryo's moet steriel zijn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 – 15 gezonde blastocyst in 2 μL hoeveelheid KSOM overbrengen in elke pseudopregnant muizen.</li>
	<li>Blijven volgen en meten van de gewichtstoename bij pseudopregnant muizen in de daaropvolgende dagen om te bepalen of de NSET voltooid is.</li>
	<li>Herstellen pups door waardoor de zwangere muizen om geboorte te geven natuurlijk of het uitvoeren van een keizersnede 17 dagen na de embryotransfer26. Een C-section is vaak noodzakelijk als zeer weinig embryo's aanwezig zijn en ze te groot voor natuurlijke geboorte groeien.</li>
	<li>Weefsel van pups voor genotypering om te bepalen van het aantal Transgenese27verzamelen.</li>
</ol>

<ol><li>Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors%3A+basic+to+translational%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors: basic to translational.</a> Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).</li>
<li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titration+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protocols in Human Genetics. , Chapter 12 Unit 12 10 (2007).</li>
<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li>
<li>Filipiak, W. E., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+transgenic+rat+production%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Advances in transgenic rat production.</a> Transgenic Research. 15 (6), 673-686 (2006).</li>
<li>McGrew, M. J., Sherman, A., Lillico, S. G., Taylor, L., Sang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+conservation+between+rodents+and+chicken+of+regulatory+sequences+driving+skeletal+muscle+gene+expression+in+transgenic+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional conservation between rodents and chicken of regulatory sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens.</a> BMC Developmental Biology. 10, 26(2010).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+transgenic+pigs+mediated+by+pseudotyped+lentivirus+and+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Production of transgenic pigs mediated by pseudotyped lentivirus and sperm.</a> PLoS One. 7 (4), e35335(2012).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+quail+production+by+microinjection+of+lentiviral+vector+into+the+early+embryo+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Transgenic quail production by microinjection of lentiviral vector into the early embryo blood vessels.</a> PLoS One. 7 (12), e50817(2012).</li>
<li>Wassarman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zona+pellucida+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annul+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Zona pellucida glycoproteins.</a> Annul Review of Biochemistry. 57, 415-442 (1988).</li>
<li>Clift, D., Schuh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restarting+life%3A+fertilization+and+the+transition+from+meiosis+to+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (9), 549-562 (2013).</li>
<li>Fong, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastocyst+transfer+after+enzymatic+treatment+of+the+zona+pellucida%3A+improving+in-vitro+fertilization+and+understanding+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation.</a> Human Reproduction. 13 (10), 2926-2932 (1998).</li>
<li>Nijs, M., Van Steirteghem, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+different+isolation+procedures+for+blastomeres+from+two-cell+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Assessment of different isolation procedures for blastomeres from two-cell mouse embryos.</a> Human Reproduction. 2 (5), 421-424 (1987).</li>
<li>Ribas, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+zona+pellucida+removal+on+DNA+methylation+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effect of zona pellucida removal on DNA methylation in early mouse embryos.</a> Biology of Reproduction. 74 (2), 307-313 (2006).</li>
<li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li>
<li>Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+knockout+by+electroporation+of+engineered+endonucleases+into+intact+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos.</a> Scientific Reports. 4, 6382(2014).</li>
<li>Hosokawa, Y., Ochi, H., Iino, T., Hiraoka, A., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoporation+of+biomolecules+into+single+cells+in+living+vertebrate+embryos+induced+by+a+femtosecond+laser+amplifier%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Photoporation of biomolecules into single cells in living vertebrate embryos induced by a femtosecond laser amplifier.</a> PLoS One. 6 (11), e27677(2011).</li>
<li>Horii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+microinjection+methods+for+generating+knockout+mice+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of microinjection methods for generating knockout mice by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Scientific Reports. 4, 4513(2014).</li>
<li>Hamra, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+transgenic+rats+by+lentiviral+transduction+of+male+germ-line+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).</li>
<li>Kanatsu-Shinohara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+transgenic+rats+via+lentiviral+transduction+and+xenogeneic+transplantation+of+spermatogonial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells.</a> Biology of Reproduction. 79 (6), 1121-1128 (2008).</li>
<li>Dann, C. T., Garbers, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+knockdown+rats+by+lentiviral+transduction+of+embryos+with+short+hairpin+RNA+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Production of knockdown rats by lentiviral transduction of embryos with short hairpin RNA transgenes.</a> Methods in Molecular Biology. 450, 193-209 (2008).</li>
<li>Chandrashekran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgenic+mice+by+lentivirus-mediated+modification+of+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgenic mice by lentivirus-mediated modification of spermatozoa.</a> FASEB Journal. 28 (2), 569-576 (2014).</li>
<li>Woods, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+in+vitro+fertilization+facilitates+fertilization+of+vitrified-warmed+C57BL%2F6+mouse+oocytes+with+fresh+and+frozen-thawed+spermatozoa%2C+producing+live+pups%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups.</a> PLoS One. 9 (3), e91892(2014).</li>
<li>Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+blastocyst+dissection+and+subsequent+cultivation+of+embryonic+stem+cells+in+a+serum%2Fcell+free+culture+system%3A+applications+and+preliminary+results+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model.</a> Journal of Translational Medicine. 4, 20(2006).</li>
<li>Martin, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((En+masse+lentiviral+gene+delivery+to+mouse+fertilized+eggs+via+laser+perforation+of+zona+pellucida%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">En masse lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs via laser perforation of zona pellucida.</a> Transgenic Research. 27 (1), 39-49 (2018).</li>
<li>Lawitts, J. A., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Culture of preimplantation embryos.</a> Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).</li>
<li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+oocyte+microinjection%2C+maturation+and+ploidy+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caesarean+section+and+fostering%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Caesarean section and fostering.</a> CSH Protocols. 2006 (2), (2006).</li>
<li>Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+of+plant+and+animal+samples+without+prior+DNA+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li>
<li>Bin Ali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+pregnancy+and+birth+rates+with+routine+application+of+nonsurgical+embryo+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer.</a> Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).</li>
<li>Liu, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrase-deficient+lentivirus%3A+opportunities+and+challenges+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 14 (5), 352-364 (2014).</li>
<li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het vermogen van de lentivirussen te integreren in hun genoom host maakt hen een ideale vector voor stabiele gene levering. Lentivirale vectoren kunnen maximaal 8,5 kilobase paar (kbp) van genetisch materiaal die geschikt is voor cel-specifieke of afleidbare initiatiefnemers, selectie markeringen of fluorescerende wordt. Opgenomen genomische materiaal kan repliceren als onderdeel van hun gastheer genoom en express te deactiveren op gewenste tijdstippen worden geregeld. Deze vectoren kunnen Spatio controle over genexpress...

Deze methode biedt gedetailleerde instructies voor het permeabilizing van de zona zitten van muis bevruchte eieren embryonale cellen om toegankelijk te maken voor levering van het gen van lentivirussen. Lentivirussen zijn ontworpen door de natuur voor efficiënte gene levering aan zoogdiercellen. Ze verdelen en niet-delende cellen infecteren en het lentivirale genoom te integreren in hun host chromosomen1. Het cellenbereik lentivirale host is gemakkelijk uitgebreid door pseudotyping de recombinante lentivirus met de vesiculaire stomatitis virus glycoproteïne (VSV-G), vanwege de brede tropisme van de VSV-G eiwit2. Na signaaltransductie, lentivirale genen zijn stabiel geïntegreerd en uitgedrukt als onderdeel van hun gastheer chromosomen maken een ideaal hulpmiddel voor het genereren van transgene dieren. Geleverd aan de vroege fase embryonale stamcellen, is het lentivirale genoom gerepliceerd als uitgedrukt in het hele organisme. Lentivirale transductie heeft geleid tot de productie van kwartel, muizen, ratten, kip en varken3,4,5,6,7 onder andere soorten van transgenics. De typische methode van levering van de lentivirale gen, vereist echter geschoolde technici en gespecialiseerde apparatuur te overwinnen van de zona zitten barrière die de vroege fase embryo's kapselt. Het algemene doel van deze methode is om te beschrijven hoe permeabilize de zona met behulp van een laser om lentivirale gene steunverlening te vergemakkelijken.
Zoogdieren eieren zijn omringd door de zona zitten die verhardt na bevruchting de bevruchte eieren tegen polyspermy te beschermen en beperken van de milieu-interacties8,9. De zona vormt een barrière die houdt van lentivirussen weg van de embryonale cellen, totdat de embryo's zijn uitgekomen als een blastocyst. Gekweekte muis bevruchte eieren hatch na 4 dagen en pseudopregnant muizen vóór broedeieren voor normale ontwikkeling in pups moet worden ingeplant. Daarom, voor signaaltransductie, lentivirussen zijn microinjected voor broedeieren van de zona in de holte van de perivitelline, de ruimte tussen de zona en de embryonale cellen.
De zona zitten vaak voor in vitro bevruchting van menselijke eicellen te verhogen van de bevruchting tarief10verwijderd. Echter, chemische verwijdering van muis zona zitten nadelig beïnvloedt muis embryo-ontwikkeling en is schadelijk voor de embryonale cellen11,12. Andere methoden voor gene levering aan muis bevruchte eieren overwonnen de barrière van de zona zitten door directe microinjection van DNA in de cel nucleus13. Pronuclear microinjection is een efficiënt middel van het leveren van genen aan embryo's. Aangezien elk embryo wordt gehouden in de plaats individueel voor microinjection, kan de praktijk echter moeizaam en tijdrovend voor een beginnende gebruiker.
Andere methoden zoals electroporation en photoporation zijn nuttig voor van voorbijgaande aard en op korte termijn gene levering aan muis bevruchte eieren14,15,16. Deze methoden worden uitvoerig gebruikt voor het leveren van CRISPR-Cas9 componenten en recombinases. Nochtans, niet electroporation en photoporation levering van genen efficiënt worden gebruikt voor het maken van transgenics. Spermacellen die worden bijeengezocht uit geperforeerde muis bijbal kunnen ook worden getransduceerde door lentivirussen en gebruikt voor in vitro bevruchting voor de productie van transgene dieren17,18,19, 20.
In dit protocol, wordt de levering van de lentivirale gen aan muis embryo's vergemakkelijkt door de zona met behulp van een laser permeabilizing. De laser XYClone werd ontwikkeld als hulpmiddel voor in vitro bevruchting21 en teelt van embryonale stamcellen22. Het is een klein apparaat dat is eenvoudig te installeren en eenvoudig te gebruiken. Eenmaal geïnstalleerd op een Microscoop, maar de ruimte van een objectief neemt en de bijgeleverde software zorgt voor de laser gericht terwijl u door de Microscoop oculairs (Zie Protocol: hoofdstuk 3). Wanneer de zona wordt geperforeerd door de XYClone laser, kunnen lentivirussen worden toegevoegd aan de voedingsbodems voor gene levering23. Meerdere lentivirussen kunnen worden gebruikt om gelijktijdig meerdere genen voor chromosomale inbouw leveren.
Dit protocol beschrijft hoe te isoleren en cultuur muis eieren bevrucht, illustreert het gebruik van laser voor perforatie van de zona zitten en demonstreert de transductie van muis embryonale cellen door lentivirussen.

<table><tbody><tr><td>CD510B-1 plasmid</td><td>System Biosciences</td><td>CD510B-1</td><td>gebruikt voor het packagen van het lentivirus dat EF1a-copGFP tot expressie brengt</td></tr><tr><td>Dimethylpolysiloxaan</td><td>Sigma</td><td>DMPS5X</td><td>kweken van embryo's</td></tr><tr><td>hyaluronidase</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td>gebruikt om cumuluscellen te verwijderen</td></tr><tr><td>XYClone Laser</td><td>Hamilton Thorne Biosciences</td><td></td><td>perforeert bevruchte muizeneieren</td></tr><tr><td>Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Apparaat</td><td>ParaTechs</td><td>60010</td><td>NSET van embryo's</td></tr><tr><td>KSOM medium</td><td>Millipore</td><td>MR-020P-5F</td><td>kweken van embryo's</td></tr><tr><td>Samenstelling van KSOM:</td><td></td><td></td><td>mg/100mL</td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>555</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>18,5</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td></td><td></td><td>4,75</td></tr><tr><td>MgSO4 7H2O</td><td></td><td></td><td>4,95</td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td></td><td></td><td>25</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td></td><td></td><td>210</td></tr><tr><td>Glucose</td><td></td><td></td><td>3,6</td></tr><tr><td>Na-Pyruvate</td><td></td><td></td><td>2,2</td></tr><tr><td>DL-Melkzuur, natriumzout</td><td></td><td></td><td>0,174mL</td></tr><tr><td>10 mM EDTA</td><td></td><td></td><td>100&micro;L</td></tr><tr><td>Streptomycine</td><td></td><td></td><td>5</td></tr><tr><td>Penicilline</td><td></td><td></td><td>6,3</td></tr><tr><td>0,5% fenolrood</td><td></td><td></td><td>0,1mL</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td></td><td></td><td>14,6</td></tr><tr><td>MEM Essentiële Aminozuren</td><td></td><td></td><td>1mL</td></tr><tr><td>MEM Niet-essentiële AA</td><td></td><td></td><td>0,5mL</td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td>100</td></tr><tr><td>M2 medium</td><td>Millipore</td><td>MR-015-D</td><td>kweken van embryo's</td></tr><tr><td>Samenstelling van M2:</td><td></td><td></td><td>mg/100mL</td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td></td><td></td><td>25,1</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat (watervrij)</td><td></td><td></td><td>16,5</td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td></td><td></td><td>35,6</td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat, monobasisch</td><td></td><td></td><td>16,2</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td></td><td></td><td>35</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td></td><td></td><td>553,2</td></tr><tr><td>Albumine, boviene fractie</td><td></td><td></td><td>400</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td></td><td></td><td>100</td></tr><tr><td>Na-HEPES</td><td></td><td></td><td>54,3</td></tr><tr><td>Fenolrood</td><td></td><td></td><td>1,1</td></tr><tr><td>Pyrowijnzuur</td><td></td><td></td><td>3,6</td></tr><tr><td>DL-Melzuur</td><td></td><td></td><td>295</td></tr></tbody></table>

laser-assisted lentivirale gene levering aan muis bevruchte eieren

Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Lentivirussen zijn efficiënte vectoren voor gene levering aan zoogdiercellen. Na signaaltransductie, het lentivirale genoom stabiel is geïntegreerd in het host-chromosoom en wordt doorgegeven aan het nageslacht. Ze zijn dus ideale vectoren voor schepping van stabiele cellijnen, in vivo levering van indicatoren, en transductie van eencellige bevruchte eieren maken van transgene dieren. Echter muis bevruchte eieren en vroege fase embryo's worden beschermd door de zona zitten, een glycoproteïne-matrix die een barrière tegen lentivirale gene levering vormt. Lentivirussen zijn te groot om door te dringen de zona en worden meestal geleverd door microinjection van virale deeltjes in de holte van de perivitelline, de ruimte tussen de zona en de embryonale cellen. De behoefte aan hoogopgeleide technologen en gespecialiseerde apparatuur heeft het gebruik van lentivirussen voor gene levering aan muis embryo's tot een minimum beperkt. Dit artikel beschrijft een protocol voor het permeabilizing van de muis bevruchte eieren door de zona perforeren met een laser. Laser-perforatie resulteert niet in enige schade aan embryo's en maakt van lentivirussen toegang te krijgen tot embryonale cellen voor gene levering. Getransduceerde embryo's kunnen uitgroeien tot een blastocyst in vitro en als geïmplanteerd in pseudopregnant muizen, uitgroeien tot transgene pups. De laser gebruikt in dit protocol is effectief en makkelijk te gebruiken. Genen geleverd door lentivirussen stabiel integreren van muis embryonale cellen en zijn germline overdraagbare. Dit is een alternatieve methode voor het maken van transgene muizen die geen micromanipulation vereist en microinjection van bevruchte eieren.

Ontwikkeling van geïsoleerd/getransduceerde muis bevruchte eieren kan worden gecontroleerd onder de Microscoop dagelijks (Figuur 1). Gezonde embryo's uitgroeien tot het blastocyst binnen 3-4 dagen. In dit protocol uitgroeien 60-70% van de onbehandelde embryo's tot blastocyst23. Uit 114 laser-geperforeerd getransduceerde embryo's 54 uitgegroeid tot blastocyst (snelheid van 47%) en 46 blastocysten uitgedrukt GFP (46/54 = 85%)<sup class="...

Muis bevruchte eieren en vroege fase embryo's worden beschermd door de zona zitten, een glycoproteïne-matrix die een barrière tegen levering van het gen vormt. Dit artikel beschrijft een protocol voor de zona perforeren met een laser transduce van embryonale cellen met lentivirale vectoren en maken van transgene muizen.

Laser-assisted lentivirale Gene levering aan muis bevruchte eieren

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...

Dit is een alternatieve en gemakkelijk te gebruiken methode voor het leveren van genen van belang aan bevruchte muizeneieren via laserperforatie van de zona pellucida en lentivirale genlevering. Laser-ondersteunde perforatie van de muisdonorprocedure kan ook van toepassing zijn op de bevruchte eieren van andere soorten om de binnenkomst van andere soorten virussen of transfectiereagentia te vergemakkelijken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het geen gespecialiseerde vaardigheden vereist voor de micromanipulatie en micro-injectie van de bevruchte muizeneieren.Het aantonen van bevruchte muis ei isolatie procedure zal Worden Page Myers, een onderzoeker van de Comparative Medicine tak aan de NIEHS. 16 tot 24 uur na de paring, isoleren van de eierstokken en eicellen van vrouwelijke muizen met vaginale pluggen, volgens de standaard protocollen. Wanneer alle weefsels zijn verzameld, scheur de ampulla van elke eierstok uit elkaar, en laat de bevruchte eieren, omgeven door cumulatieve cellen, en breng de eieren in cumuleuze cellen naar een 35 millimeter schotel met een x hyaluronidase in verse M2 medium, voor een drie tot vijf minuten incubatie bij kamertemperatuur.Pipett

laser-assisted-lentiviral-gene-delivery-to-mouse-fertilized-eggs

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze chirurgische techniek illustreert de injectie van gentherapievectoren en stamcellen in de subretinale ruimte van de muis oog.

Subretinale Injectie van gentherapievectoren en stamcellen in de Mouse Eye

Source: Lutz, D., et al. Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates viral transduction via in-utero injection in mouse embryos. A pregnant mouse is prepared for the surgery, and a midline incision is made to expose the uterine horns. A mixture of a virus containing the desired gene and a tracking dye is injected into the embryos within the uterine sacs at the...

In Utero Viral Transduction in a Mouse

Bron: Koza, P., et al. Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach. J. Vis. Exp. (2020)Deze video demonstreert de via micro-injectie ondersteunde aflevering van lentivirale vectoren in bevruchte rattenembryo's om stabiele integratie van het transgen te bereiken voor de generatie van transgene ratten.

Lentivirale vector-gebaseerde transductie van bevruchte rattenembryo's

Bron: Chiarella, A. M. et. al., Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers. J. Vis. Exp. (2018)Deze video demonstreert de generatie van genetisch gemodificeerde embryonale stamcellen van muis met behulp van lentivirale transductie. Lentivirale deeltjes leveren een antibioticaresistentiemarker af, wat stabiele genomische integratie en selectie van getransduceerde cellen mogelijk maakt.

Genereren van met lentivirus geïnfecteerde embryonale stamcellen van de muis

This video describes the pronuclear injection of lentiviral vectors into the perivitelline space of a fertilized mouse embryo. The lentivirus contains the transgene, which is incorporated into the genome of the fertilized embryo, eventually giving rise to transgenic mice.

Lentiviral Vector-Based Perivitelline Injection: A Method to Transduce the Gene of Interest Into Fertilized Single-Cell Mouse Oocytes

In this video, we demonstrate the laser-assisted permeation of the protective layer of zona pellucida in mouse fertilized eggs for facilitating lentiviral gene delivery. Lentivirus enables the generation of transgenic animals with a gene of interest stably integrated into their genome.

Laser-Assisted Lentiviral Gene Delivery: A Technique to Permeabilize Mouse Fertilized Eggs to Facilitate Lentiviral Gene Delivery

Dit protocol laat zien hoe cytoplasmatische micro-injectie in zygoten van boerderijdieren kan worden uitgevoerd. Deze techniek kan worden gebruikt om elke oplossing in de eencellige embryo te brengen, zoals genoombewerkingstools om knock-out dieren te genereren.

Laser-assisted Cytoplasmatische Micro-injectie in Livestock Zygotes

Conventionele studies van de verlies-van-functie van genen met behulp van knock-out dieren zijn vaak kostbare en tijdrovende geweest. Electroporation gebaseerde CRISPR-gemedieerde somatische mutagenese is een krachtig hulpmiddel om te begrijpen gen functioneert in vivo. Wij rapporteren hier een methode voor het analyseren van de knock-out fenotypen in delende cellen van het cerebellum.

CRISPR-gemedieerde verlies van functie analyse in cerebellaire submodule cellen gebruiken In Utero Electroporation gebaseerde gentransfer

Hier presenteren we een protocol ter bevordering van de integratie van transgenic en productie van oprichter transgene muizen met hoge doeltreffendheid door een eenvoudige injectie van een lentivirale vector in de ruimte van de perivitelline van een bevruchte oöcyt.

Lentivirale gemedieerde productie van transgene muizen: een eenvoudige en zeer efficiënte methode voor directe studie van oprichters

Dit artikel is bedoeld om de methodologie voor lentivirale transgenese in rattenembryo's met behulp van meerdere injecties van een virussuspensie in de zygote perivitelline ruimte. Vrouwelijke ratten die zijn gepaard met een vruchtbare mannelijke stam met een andere dominante vacht kleur wordt gebruikt om pseudozwangere pleegmoeders te genereren.

Generatie transgene ratten met behulp van een Lentivirale Vector Approach

Hier presenteren we een protocol voor het ontwikkelen van genetisch gemodificeerde muismodellen met behulp van embryonale stamcellen, vooral voor grote DNA knock-in (KI). Dit protocol is afgestemd met behulp van CRISPR / Cas9-genoombewerking, wat resulteert in een aanzienlijk verbeterde KI-efficiëntie in vergelijking met de conventionele homologe recombinatie-gemedieerde lineaire DNA-targetingmethode.

CRISPR/Cas9-gemedieerde zeer efficiënte gentargeting in embryonale stamcellen voor het ontwikkelen van gen-gemanipuleerde muismodellen

Leer laserondersteunde lentivirale gentransfer naar bevruchte muizeieren via perforatie van de zona pellucida. Deze methode maakt snelle ontwikkeling van transgene muismodellen mogelijk zonder gespecialiseerde micromanipulatievaardigheden.

Laser-assisted lentivirale Gene levering aan muis bevruchte eieren

Meer video's verkennen