Name: Implantatie van de laminectomie en het ruggenmerg in de muis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Leer een chirurgische methode voor het implanteren van een glasvenster op het ruggenmerg van een muis om proteïnedynamiek in vivo te bestuderen. Dit protocol maakt intravitaal microscopisch onderzoek van het intacte centrale zenuwstelsel mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het nationaal centrum voor de bevordering van translationele wetenschappen, National Institutes of Health, onder Grant KL2TR002002 en University of Illinois Chicago College of Medicine start-up fondsen Simon Alford wordt ondersteund door RO1 MH084874. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de NIH. De auteurs bedanken Dritan Agalliu in het departement Neurology van Columbia University Medical Center voor de TG eGFP: Claudin-5 muizen, wetenschappelijke discussies, en inzichten in de ontwikkeling van de chirurgische protocol en imaging toepassingen. De auteurs bedanken Sunil P. Gandhi in het departement neurobiologie en gedrag aan de Universiteit van Californië, Irvine voor het ontwerpen van het eerste prototype van het stereo-apparaat en de controller voor dier temperatuur, bespreking van het chirurgische protocol, en training in Two-photon microscopie. De auteurs bedanken ook Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc.) voor hulp bij het aanpassen van de chirurgische stereomicroscoop, en Ron Lipinski (walvis productie) voor het bewerken van stereotactische onderdelen.

Alle experimenten volgen de protocollen van de Universiteit van Illinois, de instellingen van het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van Chicago. Dit is een terminale procedure.
1. bereiding van het reagens
<ol><li>Maak kunstmatige cerebrale spinale vloeistof (aCSF) voor het bevatten van 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2· 6h2o, 2 mm CACL2· 2H2o in DDH2o. steriel filter en Vries in individuele-gebruik aliquots. Warme aCSF in een waterbad tot 39 °C voor gebruik.</li>
	<li>Warm laag smeltpunt agarose (2%) in aCSF tot volledig opgelost in een waterbad ingesteld op 65 °C. Tijdens de laminectomie, koelen de gesmolten agarose aliquot tot 39 ° c in een waterbad, zodat het kan worden bereid in de nabijheid van de fysiologische temperatuur voor stap 5,2. Opmerking: de agarose-oplossing kan bij-20 °C worden opgeslagen in aliquots voor eenmalig gebruik.</li>
	<li>Bereid steriel 50 mg/mL carprofen in bacteriostatisch water. Bewaren bij 4 °C.</li>
	<li>Reinig de afdek glazen met 70% ethanol, drie wassen van ddH2O en bewaar droog in een stofvrije verpakking.</li>
</ol>2. backplate 3D printen
<ol><li>3D CAD-software gebruiken wordt gebruikt om een model te maken voor de in Figuur 1getoonde afmetingen. Het interieur is een ellips breedste op het bodemoppervlak met betrekking tot de printer en knippen met een geknipte snede naar een kleinere ellips die een lumen vormt op het tegenoverliggende oppervlak. Twee projecterende armen met gaten om schroeven te accepteren strekken zich lateraal uit, voor bevestiging aan de achterplaat voorvork. Maak vanuit deze 3D-structuur een triangkorrelig 3D-mesh-bestand (. STL bestand). Opmerking: Zie afbeelding 1B\u2012D en aanvullende bestanden 1 en 2.</li>
	<li>Upload het trianguleerde 3D-mesh-bestand naar een 3D-printer.</li>
	<li>Print back plates met een 0,4 mm Hot-end nozzle en een 0,2 mm laag hoogte. Selecteer de nozzle-temperatuur van 205 °C, de bedtemperatuur van 45 °C en de afdruksnelheid van 45 mm/s.</li>
	<li>De resulterende 3D bedrukte achterplaten visueel te beoordelen op de structurele integriteit (Figuur 1e); bruto structureel falen (afwezig lumen, ingeklapte wand) duidt op druk defecten (Figuur 1f).</li>
</ol>3. chirurgische voorbereiding
<ol><li>Verwarm het verwarmingspaneel voor.</li>
	<li>Laad Isofluraan in de doseerspuit terwijl u in een chemische rook afzuigkap werkt. Bevestig de doseerspuit aan de Isofluraan unit.</li>
	<li>Selecteer een 8 \ u201212-week-oude muis. Weeg het dier af. Induceren van anesthesie met behulp van 2% Isofluraan in een inductie kamer. Injecteer carprofen subcutaan bij 5 mg/kg.</li>
	<li>Plaats de nose-cone en lever Isofluraan op 2% met een debiet van 150 ml/min voor onderhoud van een chirurgisch vlak van anesthesie (Figuur 2a\u2012E). Wikkel de verwarmingskussen met een wegwerp absorberend kussentje voor eenvoudig opruimen.</li>
	<li>Plaats een dier op het verwarmingskussen op het chirurgische station en installeer de neuskegel. Smeer de thermometer met petroleum gelei en plaats deze 5 mm in het rectum. Plak de thermometer-probe op de staart voor stabiliteit. Breng oftalmische zalf aan op de ogen van de muis.</li>
	<li>Om de hydratatie te behouden, breng je 200 μL lactaat Ringer oplossing aan met subcutane injectie om de 30 minuten tot aan het einde van het experiment.</li>
	<li>Spray de dorsum met 70% ethanol, verwijder de vacht met de Clippers en reinig de site met Povidon-jodium.</li>
</ol>4. laminectomie
<ol><li>Plaats het dier tussen de gehoor stangen; Deze houden de hoofdpositie van de muis met betrekking tot de neus-kegel.</li>
	<li>Bevestig dat het dier diep verdoofd is zoals beoordeeld door gebrek aan interdigitale knijp reflex en een stabiel ademhalingspatroon.</li>
	<li>Maak een 1,5 cm rostral-caudal incisie op de middenlijn over de onderste thoracale/bovenste lumbale regio met behulp van #11 mes (Figuur 2). Scheid de huid door het te grijpen met stompe getande Tang en/of gehandschoende vingers. Gebruik de tang om het resterende transparante bindweefsel onder de huid te scheiden en te schillen. De oppervlakkige musculatuur moet nu worden blootgesteld; Verplaats dit met een schuim chirurgische speer.</li>
	<li>Gebruik schuim chirurgische speren (of een curette) om de resterende, diepere spier massa van de doel wervel (Thoracic 12) weg te ruimen. Om een zitplaats te creëren voor de achterplaat, ook de spier uit het achterste deel van thoracale 11, en het voorste aspect van thoracale 13. Controle elke bloeding door het aanbrengen van zachte druk met een chirurgische speer of gebruik een minimale puls met een cauterie pistool. Doorgaan met het verwijderen van de resterende spier uit de buurt van de pezen met behulp van Tang</li>
	<li>Zodra de spieren zijn verwijderd, maak voorzichtig de pezen los door te snijden met de Tang. Er moet voldoende ruimte zijn om het snoer te visualiseren en te manipuleren wanneer deze stap is voltooid. Controleer of de Dura materie van de Inter-Vertebrale ruimte, het semi-transparante laminaire bot, het centrale oppervlakkige bloedvat onder het bot, en anterieure stralings slagader nu duidelijk zichtbaar zijn.</li>
	<li>Bevochtig de regio met warme aCSF. Gebruik de microdrill om het laminaire bot herhaaldelijk te verdunnen met rechte lijnen parallel aan de lange as van het ruggenmerg (Figuur 2, Figuur 3). Indien gewenst, gebruik maken van een glijdende fase om het chirurgische platform te roteren voor verbeterd ergonomisch comfort (bijvoorbeeld een rechtshandige operator kan het chirurgische platform linksom draaien voor de boor stap). Opmerking: de gebruikte glijdende fase is opgebouwd uit een bovenste aluminium plaat die ± 15 mm schuift ten opzichte van de vaste basisplaat.</li>
	<li>Pak voorzichtig het oppervlakkige stekelige proces met een tang en til de wervel; het bot moet gemakkelijk weg te tillen. Als er weerstand, herhaal bot verdunnen met de boor en indien nodig gebruik Iris schaar, voorzichtig te richten de schaar tips naar boven om beschadiging van het weefsel te voorkomen. Opmerking: om de Dura intact te houden, is het essentieel om niet op het bot te trekken.</li>
	<li>Gebruik #4 tang om eventuele botshards weg te wissen. Gebruik een chirurgische speer om zachte gestage druk toe te passen om eventuele bloedingen te beheersen. Spoel het weefsel met warme aCSF. Laat het weefsel niet uitdrogen.</li>
</ol>5. afdekking-glas implantatie
<ol><li>Breng een 3 mm borosilicaatkap-glas voorzichtig aan op het blootgestelde snoer.</li>
	<li>Zorg ervoor dat agarose wordt gekoeld tot 39 °C. Gebruik een kleine spatel, Breng warme 2% agarose/aCSF aan de rand van het afdekglas en laat capillaire actie om het onder het oppervlak te trekken. Let op: bij temperaturen onder de 39 °C kan de agarose beginnen te gel. Als dit gebeurt, opwarmen met behulp van een waterbad of magnetron. Sommige operators verkiezen om eerst een druppel agarose toe te passen en leg het deksel-glas bovenop.</li>
	<li>Breng weefsellijm op de blootgestelde Bony articulaire processen van de intact aangrenzende wervel op thoracale niveau 11 wervelkolom en thoracale niveau 13 wervelkolom. Breng extra weefsellijm in een ring rond de laminectomie site, over de aangrenzende pees en dwars proces. Opmerking: weefsellijm is nodig voor de juiste hechting van het tandheelkundige cement in de daaropvolgende stappen. De articulaire processen vormen een natuurlijk zitje waarop de achterplaat stabiel kan rusten (Figuur 3). Hechting aan de articulaire processen vormen de sterkste punten van gehechtheid.</li>
	<li>Meng dentale cement met katalysator in een porseleinen Meng bakje. Gebruik een kleine spatel om dentale cement over te brengen op de weefselzelfklevende laag. Gebruik dentale cement om de achterplaat aan het chirurgische veld te hechten, gecentreerd over het raam. Laat 10 minuten voor het tandheelkundige cement te genezen. NB: de stevige hechting van de achterplaat aan de voorste en posterieure articulaire processen zorgt voor de fundamentele structurele stabiliteit van het implantaat.</li>
	<li>Gebruik extra tand cement om de binnenbasis van de achterplaat te vullen, en de onderzijde van de achterplaat: weefsel interface. Opmerking: de extra toepassing van tand cement verbetert de hechting en vermindert het risico op lekkage van Microscoop objectieve Dompel vloeistof (zoutoplossing) uit de bodem van de achterplaat.</li>
	<li>Vooruit de gevorkte achterplaat houder naar de juiste positie over het raam. Bevestig de achterplaat in de achterplaat houder met schroeven. Opmerking: dit protocol gebruikt een Custom-bewerkte achterplaat houder (figuur 2g\u2012H).</li>
	<li>Breng een zoutoplossing aan op de achterplaat om te testen op lekkage. Als er vloeistof lekt, droog het gebied en breng meer tandheelkundige cement.</li>
</ol>6. voorbereiding van Imaging
<ol><li>Breng het dier op het chirurgische platform over naar de optische tafel. Opmerking: ons chirurgische platform, achterplaat houder en Isofluraan nose-cone-houder kunnen worden vervoerd tussen chirurgische en twee-Fobe beeldvormings stations als één eenheid, terwijl ze continue Isofluraan anesthesie toepassen (figuur 2D,H). Vergelijkbare units kunnen worden geassembleerd van vorken, balken en ondersteunende pijler posten die verkrijgbaar zijn bij commerciële bronnen (bijv. ThorLabs). Voor intravital microscopie moet er ten minste 11 centimeter speling zijn tussen de Microscoop doelstelling en de optische tabel om de hoogte van het chirurgische platform te kunnen opvangen.</li>
	<li>Breng het chirurgische platform aan op de optische tafel met behulp van een roestvrijstalen montage paal en een verveelde klem vork.</li>
	<li>Breng verse zoutoplossing aan op de put van de achterplaat. Verlaag een water-Dompel lens in de put.</li>
	<li>Gebruik verzonden of epifluorescentie licht om het interessegebied en de focus te bepalen. Overschakelen naar Laser scanmodus en uitvoeren in vivo beeldvorming volgens de juiste twee-Photon Laser excitatie golflengte, dichroics en band pass filters voor de fluoroforen aanwezig in het weefsel6.</li>
</ol>

<ol><li>Weinger, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+cellular+dynamics+in+the+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li>
<li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).</li>
<li>Farrar, M. J., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+implanting+a+spinal+chamber+for+longitudinal+in+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li>
<li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implanting+glass+spinal+cord+windows+in+adult+mice+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50826(2013).</li>
<li>Figley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spinal+cord+window+chamber+model+for+in+vivo+longitudinal+multimodal+optical+and+acoustic+imaging+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model.</a> PLOS ONE. 8 (3), e58081(2013).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Liebner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+morphology+of+the+blood-brain+barrier+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).</li>
<li>Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tight+junction+protein+complex+undergoes+rapid+and+continuous+molecular+remodeling+at+steady+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state.</a> Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).</li>
<li>Knowland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+recruitment+of+transcellular+and+paracellular+pathways+underlies+blood-brain+barrier+breakdown+in+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke.</a> Neuron. 82, 1-15 (2014).</li>
<li>Lutz, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolin1+Is+Required+for+Th1+Cell+Infiltration%2C+but+Not+Tight+Junction+Remodeling%2C+at+the+Blood-Brain+Barrier+in+Autoimmune+Neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation.</a> Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).</li>
<li>Harrison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebral+landmarks+for+the+identification+of+spinal+cord+segments+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse.</a> Neuroimage. 68, 22-29 (2013).</li>
<li>Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-4939-0381-8_2">Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue</a>. Bakota, L., Brandt, R. , Springer. New York. 37-50 (2014).</li>
<li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450(2016).</li>
<li>Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser-scanning+microscopy+for+single+and+repetitive+imaging+of+dorsal+and+lateral+spinal+white+matter+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Research%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo.</a> Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).</li>
<li>Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+Low-flow+Digital+Anesthesia+System+for+Mice+and+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).</li>
<li>Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Traditional+and+Integrated+Digital+Anesthetic+Vaporizers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).</li>
<li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+COX-2+inhibitor+celecoxib+prevents+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+through+COX-2-independent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway.</a> Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).</li>
<li>Muthian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COX-2+inhibitors+modulate+IL-12+signaling+through+JAK-STAT+pathway+leading+to+Th1+response+in+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis.</a> Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier beschreven methode zorgt voor een stabiele beeldvorming van het ruggenmerg bij muizen door middel van een glazen ruit. Deze methode is toegepast om BBB-remodellering in transgene eGFP te beoordelen: Claudin5 +/-muizen die een fluorescerende BBB-nauwe Junction-eiwit uitdrukken, maar het zou even goed kunnen worden toegepast voor studies van fluorescerende eiwitten of cellen in het ruggenmerg.
Er zijn meerdere methoden ontwikkeld voor het stabiliseren van laminectomie en ruggenmerg. Alle...

Transgene diermodellen die fluorescerende eiwitten uitdrukken, in combinatie met intravital microscopie, bieden een krachtig platform voor het aanpakken van biologie en pathofysiologie. Om deze technieken toe te passen op het ruggenmerg zijn gespecialiseerde protocollen vereist om het ruggenmerg voor te bereiden op beeldvorming. Een dergelijke strategie is het uitvoeren van een laminectomie en de implantatie van het ruggenmerg venster. De belangrijkste kenmerken van een ideaal laminectomie protocol voor microscopie omvatten behoud van native weefselstructuur en functie, stabiliteit van het beeldvormings veld, snelle verwerkingstijd en reproduceerbaarheid van resultaten. Een bijzondere uitdaging is om het beeldvormings veld te stabiliseren tegen de beweging geïnduceerd door ademhaling en hartslag. Er zijn meerdere ex vivo -en in vivo -strategieën gerapporteerd om deze doelen te bereiken1,2,3,4,5. De meeste in vivo -methoden omvatten het klemmen van de zijkanten van de wervelkolom2,4 en wordt vaak gevolgd door het implanteren van een rigide metalen apparaat3,4 voor stabiliteit tijdens chirurgie en downstreambeeldverwerkings toepassingen. Klemmen van de wervelkolom kan potentieel compromitteren bloedstroom en induceren bloed-hersen barrière (BBB) eiwit remodelleren.
Het doel van deze methode is om het intacte ruggenmerg beschikbaar te maken voor optische beeldvorming in de levende muis, terwijl de invasiviteit van het protocol wordt geminimaliseerd en de resultaten worden verbeterd. We beschrijven een enkele laminectomie en Cover-Glass implantatie procedure gecombineerd met een minimaal invasieve ovale kunststof 3D-gedrukte achterplaat die nog steeds robuuste mechanische stabiliteit bereikt. De achterplaat wordt direct aan de voorste en achterste wervel stekels met tand cement gehecht. De achterplaat is uitgerust met laterale verlengarmen met schroefgaten die stevig aan de Microscoop worden bevestigd via een metalen arm. Dit verankert effectief de intact voorste en posterieure wervel tot de Microscoop fase, het verstrekken van mechanische weerstand tegen het bewegings artefact dat anders zou worden geïntroduceerd door de ademhaling en hartslag. De methode is geoptimaliseerd voor laminectomie van een enkele wervel op thoracische niveau 12, weglaten van de klemmen gebruikt in alternatieve strategieën voor stabiliteit tijdens in vivo beeldvorming. De procedure is snel, met ongeveer 30 minuten per muis.
Dit protocol kan worden gebruikt voor het bestuderen van de ziekte-mechanismen van de BBB. De BBB is een dynamisch microvasculaire systeem bestaande uit endotheel cellen, vasculaire gladde spieren, pericytes, en astrociet voet processen die zorgen voor een zeer selectieve omgeving voor het centrale zenuwstelsel (CNS). Representatieve gegevens beschrijven de toepassing van dit protocol in transgene muizen die zijn ontwikkeld om verbeterde groene fluorescerende eiwitten (eGFP) uit te drukken: Claudin-5, een BBB-strakke Junction-proteïne. De geleverde achterplaat print bestanden kunnen ook worden aangepast voor alternatieve toepassingen.

<table><tbody><tr><td>3D printer</td><td>Raise3D</td><td>Pro2</td><td>Voor het afdrukken van achterplaten</td></tr><tr><td>PLA 3D printing filament</td><td>Inland</td><td>PLA+-175-B</td><td>Zwart plastic 3D-printmateriaal</td></tr><tr><td>3D CAD software</td><td>Dassault Systemes</td><td>Solidworks software</td><td>wordt gebruikt om 3D-vormen te ontwerpen</td></tr><tr><td>3D printer software</td><td>Raise3D</td><td>Ideamaker software</td><td>software gebruikt om met de 3D-printer te communiceren</td></tr><tr><td>3D gedrukte ovale achterplaat</td><td>custom</td><td></td><td>Beeldveld stabiliseren</td></tr><tr><td>Chirurgisch dissectiemicroscoop</td><td>Leica</td><td>M205 C</td><td>Uitgerust met Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-serie objectief en glijdend platform</td></tr><tr><td>Microscoopcamera</td><td>Leica</td><td>MC170</td><td>HD-kleurencamera voor het visualiseren van het chirurgische veld</td></tr><tr><td>Glijdend platform</td><td>Leica</td><td>10446301</td><td>Het glijdende platform bestaat uit twee metalen platen. De basisplaat is vast. De bovenste plaat glijdt op een gesmeerde interface om rotatie en lineaire beweging mogelijk te maken.</td></tr><tr><td>Chirurgisch station en stabilisatievork</td><td>Whale Manufactoring</td><td>custom</td><td>Laminectomie</td></tr><tr><td>SomnoSuite laag-flow isofluraandleveringseenheid</td><td>Kent Scientific</td><td>SS-01</td><td>Chirurgische anesthesie-toediening met geïntegreerde digitale verdamper</td></tr><tr><td>Roestvrij stalen 1,5 inch montagepost</td><td>ThorLabs</td><td>P50/M</td><td>Voor het monteren van chirurgisch station op optische tafel voor twee-foton beeldvorming</td></tr><tr><td>Gegenboordde klemmingsvork voor 1,5" montagepost</td><td>ThorLabs</td><td>PF175</td><td>Voor het stabiliseren van chirurgisch stationmontage op optische tafel voor twee-foton beeldvorming</td></tr><tr><td>Ideale botmicroboor</td><td>Harvard apparatus</td><td>72-6065</td><td>Verdun bot voor laminectomie</td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-10</td><td>Zoutoplossing opwarmen</td></tr><tr><td>Cautery-pistool</td><td>FST</td><td>18010-00</td><td>Kleine bloedingen cauteriseren</td></tr><tr><td>Verwarmingskussen</td><td>Benchmark</td><td>BF11222</td><td>1,9” x 4,5” siliconen verwarming met 20” Teflon-leidingen, 10W, 5V</td></tr><tr><td>K-type thermokoppel rectale sonde</td><td>Physitemp</td><td>RET3</td><td>Temperatuur van muizenlichaam meten</td></tr><tr><td>Vasestijn</td><td>Sigma</td><td>8009-03-8</td><td>Rectale sonde smeren</td></tr><tr><td>Feedback-geregelde thermische controller</td><td>custom</td><td>NA</td><td>Commercieel verkrijgbare alternatieven zijn onder andere de Physitemp TCAT-serie</td></tr><tr><td>PVA chirurgische oogspieren</td><td>Beaver-visitec international</td><td>40400-8</td><td>Absorberen bloed</td></tr><tr><td>Elektrische trimmer</td><td>Wahl</td><td>41590-0438</td><td>Muizenhaar knippen</td></tr><tr><td>Mes, #11</td><td>FST</td><td>14002-14</td><td>Chirurgisch instrument</td></tr><tr><td>Pincet, #5</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td>Chirurgisch instrument</td></tr><tr><td>Pincet, #4</td><td>FST</td><td>14002-14</td><td>Chirurgisch instrument</td></tr><tr><td>Titanium getande pincet</td><td>WPI</td><td>555047FT</td><td>Chirurgisch instrument</td></tr><tr><td>Titanium Iris-schaar</td><td>WPI</td><td>555562S</td><td>Chirurgisch instrument</td></tr><tr><td>Vetbond weefselkleefstof</td><td>3M</td><td>084-1469SB</td><td>Weefseloppervlak voorbereiden voor tandheelkundig acryl</td></tr><tr><td>Keramische mengbak</td><td>Jack Richeson</td><td>420716</td><td>Tandheelkundig acrylmiddel met versneller mengen</td></tr><tr><td>Orthojet tandheelkundig acryl</td><td>Lang Dental</td><td>1520BLK, 1503BLK</td><td>Achterplaat permanent aan weefsel hechten</td></tr><tr><td>Kleine ronde dekglaas, #1 dikte, 3 mm</td><td>Harvard apparatus</td><td>64-0720</td><td>optisch venster</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td>Voor aCSF</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7447-40-7</td><td>Voor aCSF</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-99-7</td><td>Voor aCSF</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>Voor aCSF</td></tr><tr><td>MgCl2&middot;6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>7791-18-6</td><td>Voor aCSF</td></tr><tr><td>CaCl2&middot;2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>10035-04-8</td><td>Voor aCSF</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Rimadyl</td><td>QM01AE91</td><td>Analgesie</td></tr><tr><td>Bacteriostatisch water</td><td>Henry Schein</td><td>2587428</td><td>Verdunning voor carprofen</td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6776-2</td><td>Anesthesie</td></tr><tr><td>Lactated ringer oplossing</td><td>Baxter</td><td>0338-0117-04</td><td>Hydratie voor muis</td></tr><tr><td>Agarose High EEO</td><td>Sigma</td><td>A9793</td><td>gelpunt 34-37 graden C</td></tr><tr><td>Oftalmische smeermiddelzalf</td><td>Akwa Tears</td><td>68788-0697</td><td>Corneale uitdroging voorkomen</td></tr><tr><td>MOM Two-Photon Microscope</td><td>Sutter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

implantatie van de laminectomie en het ruggenmerg in de muis

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Dit protocol beschrijft een methode voor de implantatie van het ruggenmerg en de glazen ruit voor in vivo beeldvorming van het ruggenmerg van de muis. Een geïntegreerde digitale vaporizer wordt gebruikt om een stabiel vlak van anesthesie te bereiken bij een laag debiet van isoflurane. Er wordt een enkele wervel wervelkolom verwijderd en een in de handel verkrijgbare afdekglas wordt op een dun agarose bed gelegd. Een 3D-gedrukte kunststof achterplaat wordt vervolgens aangebracht op de aangrenzende wervel stekels met behulp van weefsellijm en tand cement. Een stabilisatie platform wordt gebruikt om bewegings artefact te verminderen van ademhaling en hartslag. Deze snelle en Clamp-Free methode is zeer geschikt voor acute multi-photon fluorescentiemicroscopie. Representatieve gegevens zijn opgenomen voor een toepassing van deze techniek op twee-Fobe microscopie van de ruggenmerg-vasculatuur in transgene muizen die eGFP uitdrukken: Claudin-5 — een strak koppelings eiwit.

Geïmplanteerde glasramen en intravital Two-photon microscopie biedt een nuttig instrument voor het beoordelen van dynamische veranderingen in CNS eiwitten. De functionele integriteit van de BBB wordt beïnvloed door de expressie, subcellulaire lokalisatie, en de omzet van nauwe Junction eiwitten7. Uit eerdere studies is gebleken dat nauwe junctie eiwitten snel en dynamisch remodelleren bij steady state8. De momenteel beschreven laminectomie e...

Dit protocol beschrijft implantatie van een glas venster op het ruggenmerg van een muis om visualisatie te vergemakkelijken door intravital microscopie.

Implantatie van de laminectomie en het ruggenmerg in de muis

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Deze methode maakt het mogelijk om eiwitdynamica in vivo binnen het intacte centrale zenuwstelsel te onderzoeken om vragen in neurowetenschappen en immunologie aan te pakken. De belangrijkste voordelen van deze procedure zijn een uitstekende bewegingsstabiliteit voor beeldverwerving, korte chirurgische tijd, verminderde blootstelling van de operator aan gasvormige anesthesie en goedkope aanpasbare backplates. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang omdat het moeilijk is om het bot te verwijderen zonder het nauw onderliggende zenuwweefsel tijdens de laminectomiestappen van de procedure te beschadigen.Gebruik voordat u met de procedure begint met 3D-computerondersteunde ontwerpsoftware om een model te maken naar de aangegeven afmetingen. Dus we hebben een object, dat het driedimensionale object is, waar we mee kunnen beginnen. Wat ik dan kan doen is kunnen we instellingen op dat voor de printversie.Dus als ik dit open, ga naar Advanced, open een venster dat me in staat stelt om te kijken naar al deze instellingen. Stel de mondtemperatuur in op 205 graden Celsius, de bedtemperatuur op 45 graden Celsius en de afdruksnelheid op 45 millimeter per seconde op een 3D-printer. Gebruik een 0,4 millimeter hete ent-nozzle en een laaghoogte van 0,2 millimeter om de achterplaten af te drukken.Beoordeel vervolgens de gedrukte rugplaten visueel op hun structurele integriteit. Grove structurele storingen wijzen op drukfouten. Wanneer de achterplaten klaar zijn, plaats het hoofd van een acht tot 12 weken oude verdoofde muis op een warmtekussen tussen de oorbalken van een chirurgische restrainer en breng zalf op de ogen van het dier.Na bevestiging van een gebrek aan respons op teensnuifje, gebruik een nummer 11 mes om een 1,5 centimeter rostral te maken naar caudal midline incisie over de onderste thoracale bovenste lendenstreek en de huid te scheiden van het buikvlies. Gebruik tangen om alle resterende transparante bindweefsel onder de huid terug te pellen om het oppervlakkige spierstelsel bloot te leggen. Verplaats de spieren met een schuim chirurgische speer samen met de resterende diepere spier van de doelwervel.Om een stoel voor de achterplaat te creëren, maak je de spier vrij van het achterste aspect van thoracale 11 en het voorste aspect van thoracale 13. Met behulp van tangen om de resterende spier te verwijderen uit de pezen als dat nodig is. Wanneer alle van de spier is verwijderd, zorgvuldig snijd de pezen met tangen totdat er voldoende ruimte voor het visualiseren en manipuleren van het ruggenmerg is bereikt.Bevestig dat de duramater van de tussenwervelruimte, het semitransparante laminaire bot, het centrale oppervlakkige bloedvat onder het bot en de voorste uitstralende slagader duidelijk zichtbaar zijn. Maak de regio nat met warm kunstmatig hersenmergvocht en gebruik een microboor om het laminaire bot te verdunnen met behulp van rechte slagen parallel aan de lange as van het ruggenmerg. Voorzichtig grijpen de oppervlakkige spinous proces met tangen, til de wervel.Het bot moet gemakkelijk weg te tillen. Gebruik nummer vier tangen om alle botscherven weg te ruimen, het beheersen van een bloeden met een chirurgische speer en zachte constante druk als dat nodig is. Spoel vervolgens het weefsel met warme kunstmatige cerebrale spinale vloeistof.Voor de implantatie van de afdekkingsglas breng u voorzichtig een drie millimeter borosilicaatdeksel aan op het blootgestelde snoer. Gebruik een kleine spatel om 39 graden Celsius opgewarmd 2% agarose aan de rand van het glas toe te passen en capillaire actie toe te staan om de agarose onder het oppervlak van het dekkingsglas te trekken. Breng weefselkleven aan op de blootgestelde benige articulaire processen van de intacte aangrenzende wervel op thoracale niveau 11 en 13 wervelwervels.Breng extra weefselkleven in een ring rond de laminectomie site over de aangrenzende pees en het transversale proces. Gebruik vervolgens een nieuwe spatel om tandcement gemengd met brandversneller op de weefselkleeflaag aan te brengen en plaats een achterplaat op het chirurgische veld gecentreerd over het glazen dekselvenster. Het toepassen van meerdere dunne lagen van tandcement resulteert in een sterkere achterplaat hechting, maar zorg ervoor dat de achterplaat snel te plaatsen voordat de tandheelkundige cement begint te drogen.Na het toestaan van de tandheelkundige cement te genezen voor 10 minuten, vul de binnenste basis en onderkant van de achterplaats met extra lijm. Het aanbrengen van het tandcement in dunne lagen kan helpen verminderen het risico van cement verspreiden naar de cover glas en agarose, die het hele protocol kan compromitteren. Wanneer het tandcement is gedroogd, breng dan een gevorkte achterplaathouder aan op de juiste positie over het raam en schroef de achterplaat in de achterste plaathouder.Breng vervolgens zout op de achterplaat aan om te testen op lekkage. Het dier en het chirurgische platform kunnen vervolgens worden overgebracht naar de optische tafel van een twee fotonmicroscoop voor beeldvorming door het glazen dekselraam. In dit representatieve experiment werd EGFP positieve claudin-5 gevisualiseerd in de fluorescerende strakke kruispunten in een vasculaire plexus.De duidelijke afbakening van de strakke verbindingsstructuren in de Z-projectie geeft aan dat minimale XY-beeldverplaatsing wordt geproduceerd na een succesvolle laminectomie, raamplaatsing en back plate implantatie. Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat deze microchirurgie moeilijk is en kan de tijd nemen om onder de knie. Maar eenmaal onder de knie, deze operatie kan worden uitgevoerd in ongeveer 30 minuten.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals twee fotonmicroscopie en in vivo beeldvorming, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over neurovasculaire remodellering en andere ziekteprocessen waarbij het ruggenmerg betrokken is.

laminectomy-and-spinal-cord-window-implantation-in-the-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een minimaal invasieve protocol om de muis te wervelkolom te stabiliseren en uit te voeren...

In vivo beeldvorming van de muis ruggenmerg met behulp van twee-foton Microscopie

De transplantatie van muis neurale stamcellen (NSCs) in het ruggenmerg van muizen met gevestigde demyelinisatie is gedetailleerd. De voorbereiding van NSCs, is de laminectomie van de thoracale wervel 9 (T9), en de transplantatie van NSCs geschetst, samen met de pre-en post-operatieve zorg van de muizen.

Chirurgische Transplantatie van Mouse neurale stamcellen in het ruggenmerg van muizen geïnfecteerd met neurotrope Mouse Hepatitis Virus

This video presents a surgical procedure to implant cranial window in a mouse model for stable optical access to different regions of the brain.

Implantation of Cranial Imaging Window in Mouse Model: A Surgical Procedure to Implant Glass-based Coverslip for Stable Optical Access to Regions of Murine Brain

This video demonstrates the brain's neural activity recording through an optical window in transgenic mice. The mice express a fluorescent protein that enables the detection of neural activities. A small portion of the skull is carefully removed to install an optical window, and the skull is then covered with black cement to block light before imaging.

Installation of Optical Windows in the Brain of Transgenic Mice to Image Neural Activities

Source: Pietruczyk, E. A., et al. Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the implantation of a spinal cord window in an anesthetized mouse for in vivo imaging. The protocol stabilizes the exposed spinal cord using a borosilicate cover glass and a 3D-printed backplate. This method enables high-resolution two-photon microscopy to study blood-brain barrier dynamics and neurovascular interactions.

Spinal Cord Window Implantation in a Mouse for In Vivo Imaging

Virale vectoren kunnen gerichte genetische manipulatie. We tonen een werkwijze voor voorwaardelijke genexpressie of ablatie in de muis ruggenmerg, met stereotactische injectie van een virale vector in de dorsale hoorn, een prominente plaats van synaptische contacten tussen primaire somatosensorische afferenten en neuronen van het centrale zenuwstelsel.

Stereotactische injectie van een virale vector voor voorwaardelijke Gene Manipulation in de muis Spinal Cord

We beschrijven een methode voor het implanteren en onderhouden van glazen ramen over de blootgestelde ruggenmerg van volwassen muizen voor het bestuderen van experimentele auto-immuun encefalomyelitis. Deze ramen bieden chronische optische toegang tot het ruggenmerg voor het monitoren van celdynamica op subcellulair niveau in levende dieren met behulp van twee-foton microscopie.

Implantatie van glazen ruggenmergvensters bij volwassen muizen met experimentele auto-immuun encefalomyelitis

Dwarslaesie is een traumatische aandoening die ernstige morbiditeit en hoge sterfte veroorzaakt. In dit werk beschrijven we in detail een kneuzing model van dwarslaesie bij muizen, gevolgd door een transplantatie van neurale stamcellen.

Neurale stamceltransplantatie bij Experimentele Contusive Model van Spinal Cord Injury

In deze video, beschrijven we een werkwijze voor het implanteren van een chronische optische beeldvorming kamer via dorsale ruggenmerg van een levende muis. De kamer, chirurgische ingreep, en chronische beeldvorming worden beoordeeld en aangetoond.

Een procedure voor het implanteren van een Spinal Kamer voor Longitudinaal In Vivo Beeldvorming van de Muis Spinal Cord

Dit protocol beschrijft hoe u een nauwkeurige laminectomie voor inductie van stabiele transsectie-type dwarslaesie in het muismodel, met minimale bijkomende schade voor het onderzoek van de dwarslaesie te creëren.

Inductie van volledige transsectie-type ruggenmergletsel bij muizen

Het huidige protocol beschrijft de ontwikkeling van een reproduceerbaar muizenmodel van ruggenmergglioom door tumorcellen in de tussenwervelruimte te injecteren, wat een effectievere en minder invasieve benadering biedt voor onderzoek en therapeutische ontwikkeling.

Chirurgische transplantatie van tumorcellen in het ruggenmerg van muizen

Leer een chirurgische methode voor het implanteren van een glasvenster op het ruggenmerg van een muis om proteïnedynamiek in vivo te bestuderen. Dit protocol maakt intravitaal microscopisch onderzoek van het intacte centrale zenuwstelsel mogelijk.

Implantatie van de laminectomie en het ruggenmerg in de muis

Meer video's verkennen