Name: 3D-celcultuur voor het bestuderen van de invasie en evalueren van Therapeutics in blaaskanker (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Leer een 3D-celcultuurmethode voor het bestuderen van blaaskankerinvasie met behulp van tumorsferoïden. Deze techniek maakt real-time monitoring en evaluatie van therapeutische middelen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedank het laboratorium van Dr. Howard Crawford (University of Michigan) voor technische ondersteuning bieden materialen en apparatuur voor deze studie, en Alan Kelleher voor technische ondersteuning.
Dit werk werd gefinancierd door subsidies aan de University of Michigan Rogel Cancer Center Core Grant CA046592-26S3 NIH K08 CA201335-01A1 (PLP), BCAN YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS).

1. groeiende kanker spheroïden
<ol><li>
Groeien uit cellijnen
	<ol>
<li>Cultuur menselijke blaas kankercellen onder conventionele aanhanger cel kweekomstandigheden en onderhouden in een incubator van de 37 ° C bij 5% CO2geleverd. Handhaven van cellen op < 90% confluentie. Opmerking: Kweekmedia gebruikt is Dulbecco van minimale essentiële media (DMEM) met 4,5 g/L D-glucose, L-Glutamine, 110 mg/L natrium pyruvaat, bewerkt en geleverd met 10% foetale runderserum (FBS) in dit protocol.</li>
		<li>Een dag vóór de aanvang van het experiment, trypsinize (met behulp van 0,25% trypsine-EDTA) cellen, kwantificeren cel concentratie en distribueren van 1 x 106 cellen in 3 mL voedingsbodems in ieder putje van een 6-well ultra-lage bijlage plaat.</li>
		<li>Incubeer de cellen in lage bijlage omstandigheden bij 37 ° C ≥16 uur. Hierdoor moeten voldoende tijd voor cellen tot totaal in spheroïden voor de meeste blaas kanker cellijnen. Opmerking: De vorming van spheroïden kan worden waargenomen door omgekeerde helder veld Microscoop. Het optimale aantal en grootte van spheroïden kunnen afhangen van individuele experimenten, maar wij vinden dat spheroïden met een diameter van 50 µm tot 150 µm zijn over het algemeen geschikt voor time-lapse geschikt zijn met behulp van een 20 X-objectief.</li>
		<li>Om op te nemen van de extra celtypen, zoals fibroblasten of immuuncellen in de spheroïden, meng de gewenste cellen met kankercellen op de gewenste verhouding (1:1, 1:10, enz.) in een ultra-lage bijlage plaat en Incubeer bij 37 ° C voor ≥16 h dat de vorming van Gemengde cel type spheroïden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Groeien uit primaire tumoren Opmerking: Tumor spheroïden kunnen ook worden afgeleid uit primaire blaas tumor bronnen zoals tumoren ontwikkeld uit carcinogeen-geïnduceerde blaas tumor modellen8. Bijvoorbeeld tumoren van de blaas gegenereerd op basis van muizen gevoed met N-butyl-(4-hydroxybutyl), N - nitrosamine (BBN), kan worden geoogst en gehakt in kleine stukjes (ongeveer 0,5 mm3) met behulp van steriele chirurgische instrumenten. Verteerd primaire monsters van menselijke blaas kanker kunnen ook bestudeerd worden in dit systeem.<ol>
<li>Verzamelen en wassen van 0.5 mm3 tumor stukken in 5 mL ijskoud-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Centrifugeren bij 200 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Deze wassen stap eenmaal herhaald.</li>
		<li>Het verzamelen van stukken van de tumor door centrifugeren bij 200 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en voeg 5 mL van DMEM bevattende 10 gewichtspercenten FBS. Tumor sferoïde/media mengsel overbrengen in een 6-well ultra-lage bijlage plaat. Incubeer bij 37 ° C voor ≥16 h voordat het inbedden in collageen matrix (zie stap 2.3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. voorbereiding van de 3D-cultuur-zaal
<ol><li>
Type-1 collageen (afgeleid van de staart van de rat) in DMEM met 10% verdunnen FBS te maken van een 2 mg/mL van het mengsel volgens de instructies van de fabrikant.
	<ol>
<li>Kortom, het mengen van collageen met passend bedrag van 1 N NaOH-oplossing en DMEM door zachte pipetteren gebaseerd op instructies van de fabrikant voor het bereiken van fysiologische pH.</li>
		<li>Na het mengen van collageen en DMEM, snel jas de putten van de kamer-dia (voor de meeste toepassingen, kamer dia's met een aantal 1.5 cover-glas is optimale) met het mengsel van de collageen-DMEM voorafgaand aan de stolling (200 µL per putje). Laat de dia gecoate kamer als stationaire bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Opmerking: De samenstelling van collageen gebaseerde matrix kan worden gewijzigd door de toevoeging van andere ingrediënten van de extracellulaire matrix, zoals fibronectine of laminin, volgens de toepassing van experiment.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zachtjes Pipetteer 500 µL van media met spheroïden (of tumor stukken, als primaire tumor monster wordt gebruikt) van de 6-well ultra-lage bijlage plaat in een lege 1,5 mL microcentrifuge buis. Wacht 2 minuten om te laten de spheroïden regelen naar de onderkant van de buis.</li>
	<li>Verwijder het supernatant voorzichtig uit de buis. Bereiden van een andere buis van type-1 collageen (2 mg/mL) gemengd met DMEM met 10% FBS en snel 500 µL van dit mengsel aan de spheroïden toevoegen. Meng voorzichtig de spheroïden en collageen door langzame pipetteren.</li>
	<li>250 µL van spheroïden/collageen mengsel aan een putje van collageen-pre-coated kamer dia toevoegen. Laat de collageen-matrix met spheroïden te stollen volledig (ongeveer 30 minuten bij 37 ° C).</li>
	<li>Nadat de collageen-matrix is gestold, voeg 1 mL DMEM met 10% FBS aan elk putje (Figuur 1B). Incubeer de kamer dia in een incubator van de 37 ° C bij 5% CO2 geleverd tot klaar voor imaging.</li>
</ol>3. levende cel Time-lapse Imaging
<ol><li>Inschakelen van de confocal microscoop na instructies van de fabrikant en ervoor zorgen dat de kamer klimaat bereikt van 37 ° C en wordt geleverd met 5% CO2. Opmerking: Onze Microscoop en de kamer meestal nodig 1 h te bereiken evenwicht van het systeem.</li>
	<li>Zorgvuldig overbrengen in de kamer-dia de dia adapter aangesloten op de Microscoop.</li>
	<li>Zoek de spheroïden van belang met behulp van de doelstelling van een laag energieverbruik (bijvoorbeeld5 X) en imaging te starten met het hogere doel van de macht (in het huidige protocol, 20 X doelstelling wordt gebruikt voor de meeste van de levende cel beeldvorming voor de betere beeldkwaliteit). Opmerking: Voor primaire blaas tumor monsters, 5 X en 10 X doelstellingen kunnen nodig zijn ter dekking van grotere opnamegebied. Voor onze time-lapse imaging, het imaging interval ligt 30 min en een Z-stack wordt gebruikt om het imago van de hele sferoïde. Doorgaans is de afstand tussen Z-segmenten ingesteld op 4 µm voor de 20 X doelstelling, en de totale afstand van de Z-as is ongeveer 200 µm. beelden kunnen worden verkregen met behulp van DIC en met fluorescentie als cellen/weefsels fluorescent proteïne markeringen haven.</li>
	<li>Time-lapse imaging voor 24-72 h uitvoeren. Opmerking: De duur wordt bepaald door het celtype en de behoeften van het experiment.</li>
</ol>4. bereiding van de monster blok bevat kanker spheroïden voor bevroren weefsel segmenteren
<ol><li>Trek voorzichtig het blok van collageen gel en spheroïden uit de kamer dia's met behulp van kleine pincet. Plaats het collageen gel blok in een mal van kunststof histologie.</li>
	<li>Spoel de collageen gel met 1 x PBS kort, en vervolgens repareren met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Let op: PFA potentieel kankerverwekkend is en moet met zorg worden behandeld.</li>
	<li>Wassen van de collageen-gel met 1,5 mL 1 x PBS op een shaker voor 15 min. vervangen de PBS en herhaal de vorige stap voor wassen 3 x.</li>
	<li>Breng een dunne laag (ongeveer 3 mm) van optimale scherpe temperatuur (OCT) samengestelde ter dekking van de onderkant van een nieuwe mal van kunststof histologie. Plaats de vaste en gewassen collageen gel op de top van de LGO samengestelde, vervolgens zorgvuldig insluiten de hele gel van de mal vullen met LGO samengestelde terwijl het vermijden van de vorming van alle luchtbellen in de LGO.</li>
	<li>Laat de schimmel bij 4 ° C gedurende 1 uur.</li>
	<li>Plaats de schimmel met de steekproef en de LGO samengestelde op een 100 mm petrischaal drijvend op vloeibare stikstof. Toestaan dat de steekproef aan flash-freeze volledig.</li>
	<li>Het blok van de bevroren monster bij-80 ° C voor toekomstig gebruik opslaan.</li>
</ol>5. immunofluorescentie Imaging voor bevroren verdeelde kanker spheroïden
<ol><li>Het blok bevroren monster uit de diepvries-80 ° C naar de kamer van-20 ° C van een cryostaat overbrengen.</li>
	<li>
Conventionele bevroren afdelen door de sectie interval in te stellen naar 7 µm uitvoeren Laat verdeelde monsters hechten aan het glasplaatje zonder rimpels of gevangen lucht.
	<ol>
<li>De dia's bij-80 ° C opslaan voordat u verdere kleuring. Opmerking: Verschillende intervallen kunnen worden gebruikt voor experimentele behoeften.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lucht drogen de dia's gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Permeabilize van de monsters met PBS met 0,5% Triton X-100 gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Wash monsters 3 x met PBS voor 10 min per wasbeurt.</li>
	<li>Omcirkelen de monsters op de dia met de hydrofobe belemmeringen met behulp van een pen hydrofobe barrière.</li>
	<li>Behandeling van de monsters met blokkerende oplossing (1 x PBS met 5% bovien serumalbumine (BSA)), gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Breng elk monster op de dia 40 µL van het primaire antilichaam-bevattende oplossing (1 x PBS met 5% BSA met 1:100 verdunning van primair antilichaam).</li>
	<li>Incubeer de dia's in primair antilichaam bij 37 ° C gedurende 1 uur, of bij kamertemperatuur 's nachts (de incubatietijd verkoopvoorwaarden afhankelijk primair antilichaam).</li>
	<li>Wash monsters 3 x met PBS gedurende 15 minuten (per wasbeurt).</li>
	<li>Breng elk monster op de dia 40 µL van secundair antilichaam-bevattende oplossing (1 x PBS met 5% BSA met 1:300 secundair antilichaam verdunning).</li>
	<li>Wash monsters 3 x met PBS gedurende 15 minuten (per wasbeurt).</li>
	<li>Vlek de monsters met Hoechst 33342 oplossing (1 µg/mL, verdund in PBS) bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Daarna wassen monsters met PBS voor 5 min.</li>
	<li>Monteren van de monsters met montage medium en bestrijk ze met de gepaste afmetingen cover slips. Laat de dia's in donker bij kamertemperatuur gedurende 24 uur en voer confocale microscopie.</li>
</ol>

<ol><li>American Cancer Society. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Society%22">The Society</a>. , Atlanta, GA. (2018).</li>
<li>Knowles, M. A., Hurst, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+bladder+cancer%3A+new+insights+into+pathogenesis+and+clinical+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (1), 25-41 (2015).</li>
<li>DeGeorge, K. C., Holt, H. R., Hodges, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+Cancer%3A+Diagnosis+and+Treatment.+American+Family+Physician%5BTitle%5D)+AND+%22American+Family+Physician%22%5BJournal%5D)">Bladder Cancer: Diagnosis and Treatment. American Family Physician.</a> American Family Physician. 96 (8), 507-514 (2017).</li>
<li>Repesh, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vitro.+assay+for+quantitating+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Invasion+Metastasis%22%5BJournal%5D)">A new in vitro. assay for quantitating tumor cell invasion.</a> Invasion Metastasis. 9 (3), 192-208 (1989).</li>
<li>Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+system+as+a+model+for+studying+cancer+cell+invasion+capacity+and+anticancer+drug+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture system as a model for studying cancer cell invasion capacity and anticancer drug sensitivity.</a> Anticancer Research. 24 (4), 2169-2177 (2004).</li>
<li>Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q., Messadi, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3-dimensional+culture+system+as+an+in+vitro.+model+for+studying+oral+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Expermintal+Pathology%22%5BJournal%5D)">A novel 3-dimensional culture system as an in vitro. model for studying oral cancer cell invasion.</a> International Journal of Expermintal Pathology. 86 (6), 365-374 (2005).</li>
<li>Rebelo, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-3-culture%3A+A+tool+to+unveil+macrophage+plasticity+in+the+tumour+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D-3-culture: A tool to unveil macrophage plasticity in the tumour microenvironment.</a> Biomaterials. , 185-197 (2018).</li>
<li>Vasconcelos-Nobrega, C., Colaco, A., Lopes, C., Oliveira, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+BBN+as+an+urothelial+carcinogen%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Review: BBN as an urothelial carcinogen.</a> In Vivo. 26 (4), 727-739 (2012).</li>
<li>Palmbos, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATDC%2FTRIM29+Drives+Invasive+Bladder+Cancer+Formation+through+miRNA-Mediated+and+Epigenetic+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">ATDC/TRIM29 Drives Invasive Bladder Cancer Formation through miRNA-Mediated and Epigenetic Mechanisms.</a> Cancer Research. 75 (23), 5155-5166 (2015).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATDC+induces+an+invasive+switch+in+KRAS-induced+pancreatic+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">ATDC induces an invasive switch in KRAS-induced pancreatic tumorigenesis.</a> Genes & Development. 29 (2), 171-183 (2015).</li>
<li>Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movers+and+shakers%3A+cell+cytoskeleton+in+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis.</a> British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).</li>
<li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+microtubule+organization+and+dynamics%3A+two+ends+in+the+limelight%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).</li>
<li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li>
<li>Kidd, M. E., Shumaker, D. K., Ridge, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+vimentin+intermediate+filaments+in+the+progression+of+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of vimentin intermediate filaments in the progression of lung cancer.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2014).</li>
<li>Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate+Filaments+Play+a+Pivotal+Role+in+Regulating+Cell+Architecture+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17145-17153 (2015).</li>
<li>Papafotiou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRT14+marks+a+subpopulation+of+bladder+basal+cells+with+pivotal+role+in+regeneration+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">KRT14 marks a subpopulation of bladder basal cells with pivotal role in regeneration and tumorigenesis.</a> Nature Communications. 7, 11914(2016).</li>
<li>Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+adaptability+of+cancer+cells+strongly+affects+anti-migratory+drug+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy.</a> Journal of the Royal Society Interface. 11 (99), (2014).</li>
<li>Goddette, D. W., Frieden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization.+The+mechanism+of+action+of+cytochalasin+D%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization. The mechanism of action of cytochalasin D.</a> Journal of Biological Chemistry. 261 (34), 15974-15980 (1986).</li>
<li>Berrier, A. L., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-matrix+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell-matrix adhesion.</a> Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).</li>
<li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+gel+three-dimensional+matrices+combined+with+adhesive+proteins+stimulate+neuronal+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Collagen gel three-dimensional matrices combined with adhesive proteins stimulate neuronal differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Journal of the Royal Society Interface. 8 (60), 998-1010 (2011).</li>
<li>LeBleu, V. S., Macdonald, B., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+basement+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Structure and function of basement membranes.</a> Experimental Biology and Medicine. 232 (9), 1121-1129 (2007).</li>
<li>Rakha, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+in+breast+lesions%3A+the+role+of+the+epithelial-stroma+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Invasion in breast lesions: the role of the epithelial-stroma barrier.</a> Histopathology. , (2017).</li>
<li>Erler, J. T., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+context+regulation+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional context regulation of metastasis.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 26 (1), 35-49 (2009).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Hier beschrijven we een 3D-tumor sferoïde model waarmee real-time opvolgen van blaas kanker invasie die essentieel is voor progressie van kanker en metastase. Dit systeem is vatbaar voor de integratie van verschillende stromale en cellulaire componenten waarmee onderzoekers aan betere recapituleren het weefsel communicatie waar blaas kanker invasie plaatsvindt. Blaas kanker spheroïden kan worden gegenereerd uit diverse bronnen zoals cellijnen (inclusief genetisch gemodificeerde cellijnen nuttig voor de behandeling van si...

Invasie is een cruciale stap in de progressie van kanker, die is vereist voor metastase, en wordt geassocieerd met lagere overleven en slechte prognose bij patiënten. In menselijke blaaskanker, de meest voorkomende maligniteit van de urinewegen, waardoor ongeveer 165.000 sterfgevallen per jaar wereldwijd, zijn stadium van de kanker, de behandeling en de prognose direct gerelateerd aan de aanwezigheid of afwezigheid van invasie1. Ongeveer 75% van de gevallen van blaaskanker zijn niet-spier invasieve en worden beheerd met lokale resectie. In tegenstelling, spier-invasieve blaas kanker (ongeveer 25% van alle gevallen) zijn agressieve tumoren met een hoog metastatische en worden behandeld met agressieve multimodaliteit therapie2,3. Inzicht in de moleculaire wegen die leiden invasie tot is daarom essentieel beter karakteriseren het risico van invasieve progressie en het ontwikkelen van therapeutische interventies die invasieve progressie kunnen voorkomen.
Invasieve progressie van de tumor zich voordoet in een complexe driedimensionale (3-D) omgeving en vereist tumor cel interactie met andere tumorcellen, stroma, kelder membraan en andere soorten cellen, met inbegrip van immune cellen, fibroblasten, spiercellen en vasculaire endotheliale cellen. Doorlaatbare steun (b.v.Transwell) assay systemen zijn vaak aangewend om te kwantificeren kanker cel invasie4, maar deze systemen zijn beperkt omdat ze niet toestaan microscopisch kleine controle van het proces van de invasie in real-time en de ophalen van monsters voor verdere kleuring en moleculaire analyse is uitdagend. Ontwikkeling van een 3D-blaas tumor sferoïde systeem te bestuderen van de invasie is wenselijk omdat hierdoor de opname van gedefinieerde microenvironmental componenten met het gemak van in vitro -systemen.
In dit protocol, beschrijven we een systeem om te ondervragen van de invasieve processen van menselijke blaas kankercellen met behulp van een 3D-sferoïde invasie bepaling opnemen op basis van collageen gel matrices en confocale microscopie om onderzoekers te controleren van de beweeglijkheid van de cel en invasie inreal-time (Figuur 1). Dit systeem is veelzijdig en kan worden aangepast voor verschillende stromale tumor/instellingen ondervragen. Het kan de meeste blaas kanker cellijnen of primaire blaas tumoren en extra stromale cellen nemen zoals kanker geassocieerd fibroblasten en immuuncellen5,6,7. Dit protocol beschrijft een matrix bestaat uit collageen type-1, maar kan worden aangepast voor het nemen van andere moleculen zoals fibronectin, laminin of andere collageen-eiwitten. Invasieve processen kunnen worden gevolgd gedurende 72 uur of langer afhankelijk van de capaciteit van het systeem gebruikt en Microscoop. Fixatie en immunofluorescentie kleuring van de tumor die is ingesloten in de 3D-matrix vóór, tijdens en na de invasie kunt de ondervraging van upregulated van de eiwitten in invasieve cellen, waardoor cruciale informatie dat meestal afwezig of moeilijk te verzamelen met behulp van andere 3D-cultuur-modellen. Dit systeem kan ook worden gebruikt op scherm stoffen die het blokkeren van invasie, en af te bakenen signaalroutes beïnvloed door dergelijke verbindingen.

<table><tbody><tr><td>Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM cellcultuurmedium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Antibioticum-antimyoticum (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25%), fenolrood</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Bovien serumalbumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferd zout (PBS), pH 7,4&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Costar Ultral-low attachment 6-well cluster&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Conventioneel invers microscoop&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>491206-0001-000</td><td>Algemeen gebruik voor celcultuur en het controleren van sfeervormen</td></tr><tr><td>Collageen type 1 van rattenstaart, hoge concentratie&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM800</td><td>Een confocale microscoop met klimaatkamer, meervoudige locaties beeldvorming, en Z-stack scanfunctie&nbsp;</td></tr><tr><td>Cryostat microtoom</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Zen 2 Beeldverwerkingssoftware&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde oplossing</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Hydrofobe Barrière PAP Pen</td><td>Vector Laboratories&nbsp;</td><td>H4000</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T compound&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23730571</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 oplossing&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ATDC (Trim29) antilichaam</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA020053</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Cytokeratine 14 antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab7800</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Vimentin antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab24525</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Montagemedium</td></tr></tbody></table>

3d-celcultuur voor het bestuderen van de invasie en evalueren van therapeutics in blaaskanker

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

Blaaskanker is een belangrijk gezondheidsprobleem. Er wordt geschat dat meer dan 16.000 mensen dit jaar in de Verenigde Staten van blaaskanker sterven zullen. Terwijl 75% van de kankers van de blaas zijn niet-invasieve en onwaarschijnlijk metastaseren, vooruitgang ongeveer 25% naar een invasieve groeipatroon. Bijna de helft van de patiënten met invasieve kankers Nieuwengels dodelijke metastatische herval. Inzicht in het mechanisme van invasieve progressie in blaaskanker is dus cruciaal voor patiëntenoutcomes voorspellen en voorkomen van dodelijke metastasen. In dit artikel presenteren we een driedimensionale kanker invasie model waarmee opneming van tumorcellen en stromale componenten na te bootsen in vivo omstandigheden die zich voordoen in de blaas tumor communicatie. Dit model biedt de mogelijkheid om te observeren de invasieve proces in real time via time-lapse imaging, ondervragen van de moleculaire pathways betrokken confocal immunefluorescentie beeldvorming en scherm verbindingen met het potentieel de invasie van het blok. Dit protocol is gericht op blaaskanker, is het waarschijnlijk dat soortgelijke methoden kunnen worden gebruikt om de invasie en beweeglijkheid in de tumor andersoortige ook onderzoeken.

Succes bij de oprichting van invasieve blaas kanker tumor sferoïde vereist de vorming van gepaste afmetingen tumor spheroïden van cellijnen of primaire tumoren. Figuur 2 A toont gepaste afmetingen spheroïden ontwikkeld op basis van vier menselijke blaas kanker cellijnen (UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, 253J en UM-UC18). Figuur 2 B toont een sferoïde tumor van een muis BBN gegenereerde blaas tumor ingeb...

De processen die blaas kanker invasie vertegenwoordigen mogelijkheden voor biomerker en therapeutische ontwikkeling. Hier presenteren we een blaas kanker invasie model waarin 3D-cultuur tumor spheroïden, time-lapse beeldvorming en confocale microscopie. Deze techniek is handig voor het definiëren van de kenmerken van de invasieve proces en voor het screenen van therapeutische agenten.

3D-celcultuur voor het bestuderen van de invasie en evalueren van Therapeutics in blaaskanker

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

Invasieve progressie is een cruciale determinant van het klinische resultaat bij patiënten met blaaskanker. Hier beschrijven we een eenvoudige in vitro-methode, die gebruik maakt van tumor-sferoïden die zijn gegenereerd met behulp van cellijnen of primaire tumoren om invasie te bestuderen. Het grote voordeel van deze techniek is dat we het proces van kankerinvasie in real-time kunnen volgen en ook immunofluorescente kleuring kunnen gebruiken om de monsters aan het einde van het experiment te onderzoeken.Deze techniek kan worden aangepast om andere celtypen op te nemen, zoals fibroblast of immuuncellen. Het kan ook worden gebruikt om verbindingen te testen die nuttig kunnen zijn om invasie te blokkeren. Kritische factoren voor succes zijn onder meer optimalisatie van tumor-sferoïdevorming en inbedding in collageen, gebruik van geschikte microscopie met correcte werkafstand en geschikte immunokleuringsprocedures.Om te beginnen met het genereren van sferoïd uit cellijnen, kweek menselijke blaaskankercellen onder conventionele adhesie-celkweekomstandigheden. Een dag voorafgaand aan het experiment, trypsiniseer de cellen en verdeel 1.000.000 cellen in drie milliliter celkweekmedium in elke put van een zesputsplaat. Bewaar vervolgens de cellen in lagadhesie-omstandigheden gedurende ten minste 16 uur bij 37 graden Celsius.Om sferoïd uit primaire tumoren te genereren, verzamel en was 0,5 millimeter kubusvormige tumorstukken in vijf milliliter ijskoud PBS. Centrifugeer de tumorstukken bij 200 maal G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Verzamel na dit de tumorstukken via centrifugatie bij 200 maal G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.Verwijder vervolgens het supernatant en voeg vijf milliliter DMEM aan toe dat is aangevuld met 10%FBS. Breng het tumor-sferoïde mediummengsel over naar een zes-puts ultralage adhesieplaat. Bewaar vervolgens de plaat bij 37 graden Celsius gedurende ten minste 16 uur.Verdun eerst type één collageen in DMEM dat is aangevuld met 10%FBS tot een mengsel van twee milligram per milliliter. Bekleed vervolgens snel de putten van een kamerschuifplak met het mengsel. Houd de kamerschuifplak stationair bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.Pipetteer vervolgens voorzichtig 500 microliter sferoïdmedium van de ultralage adhesieplak in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Laat de sferoïd vervolgens twee minuten op de bodem van de buis bezinken. Verwijder voorzichtig het supernatant uit de buis.Voeg vervolgens snel 500 milliliter vers collageen DMEM-mengsel toe aan de sferoïd. Pipetteer omhoog en omlaag om de sferoïd en collageen voorzichtig te mengen. Voeg vervolgens 250 microliter van het sferoïd-collageenmengsel toe aan de putten van de met collageen beklede kamerschuifplak.Laat de collageenmatrix die de sferoïd bevat volledig stollen. Nadat de collageenmatrix is gestold, voegt u één milliliter DMEM toe dat is aangevuld met FBS aan elke put van de kamerschuifplak. Bewaar vervolgens de kamerschuifplak bij 37 graden Celsius met 5%CO2.Bereid de confocale microscoop volgens de instructies van de fabrikant voor en zorg ervoor dat de klimaatkamer 37 graden Celsius bereikt en wordt voorzien van 5%CO2. Breng vervolgens de kamerschuifplak over naar de microscoopslideadapter. Gebruik een laagvermogen objectief om de sferoïd van belang te lokaliseren en begin vervolgens met beeldvorming met een hoogvermogen objectief en voer tijdsverloopbeeldvorming uit gedurende 24 tot 72 uur.Gebruik eerst kleine pincetten om het blok collageengel en sferoïd uit de kamerschuifplak te tillen. Plaats vervolgens het collageengelblok in een kunststof histologievorm. Spoel het collageengelblok kort met 1x PBS.En fixeer het met 4%PFA en PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was vervolgens het collageengelblok met 1,5 milliliter 1x PBS op een shaker gedurende 15 minuten. Breng een dunne laag OTC-verbinding aan op de bodem van een nieuwe kunststof histologievorm.Plaats vervolgens het gefixeerde en gewassen collageengelblok op de OTC-verbinding voordat u de rest van de mal zorgvuldig vult met OTC-verbinding. Bewaar de mal gedurende één uur bij vier graden Celsius. Bewaar vervolgens de monsters op minus 80 graden Celsius na het snel bevriezen van de mal op een 100 millimeter petrischaal drijvend op vloeibaar stikstof.Breng het bevroren monsterblok over naar de kamer van min 20 graden Celsius van een cryostaat. Voer vervolgens conventionele bevroren secties uit met een interval van zeven micrometer. Laat de slides vervolgens een uur bij kamertemperatuur drogen.Permeabiliseer vervolgens de monsters gedurende 15 minuten met PBS dat 0,5%Triton X-100 bevat. Was vervolgens de monsters drie keer met PBS gedurende 10 minuten elk. Omcirkel de monsters met een hydrofobe barrièrepen.Behandel de monsters gedurende één uur bij kamertemperatuur met blokkeeroplossing. Breng vervolgens 40 microliter primaire antilichaam-oplossing aan op elk monster. Bewaar de slides gedurende één uur bij 37 graden Celsius.Was vervolgens het monster drie keer met PBS gedurende 15 minuten per wasbeurt. Breng vervolgens 40 microliter secundair antilichaam-oplossing aan op elk monster. Was vervolgens de monsters drie keer met PBS gedurende 15 minuten per wasbeurt.Verf het monster met Hoechst 33342-oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was vervolgens de monsters met PBS gedurende vijf minuten. Monteer de monsters met montagemedium en bedek ze met dekglasjes.Laat de slides ten slotte 24 uur in het donker bij kamertemperatuur staan voordat u confocale microscopie uitvoert. In dit protocol werden invasieve blaaskankertumorsferoïden gevormd uit cellijnen en primaire tumoren. Een representatief tijdsverloopvideo demonstreert invasie van blaaskankertumorsferoïden in de collageenmatrix.Een representatief tijdsverloopvideo demonstreert invasief gedrag van GFP-gelabelde blaaskankertumorsferoïden alleen of in co-cultuur met RFP-gelabelde fibroblasten. Om de haalbaarheid van het gebruik van immunofluorescente

3-d-cell-culture-system-for-studying-invasion-evaluating-therapeutics

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Interstitiële vloeistof stroom wordt verhoogd in solide tumoren en kan moduleren tumorcel invasie. Hier beschrijven een techniek interstitiële fluïdumstroming toepassing cellen ingebed in een matrix en meet de gevolgen celinvasie. Deze techniek kan gemakkelijk worden aangepast aan andere te bestuderen.

Drie-dimensionale Cultuur van de Cel Model voor het meten van de effecten van het interstitiële vocht Flow op tumorcel invasie

Deze video biedt een gedetailleerde methodologie om borstkankercellen te laten groeien in een 3D-keldermembraaneiwitmatrix, die het potentieel van 3D-cultuur illustreert bij de beoordeling van celinvasie in de omgeving.

3D-cultuur keldermembraantest: cultiveren van kankercellen op 3D-keldermembraaneiwitmatrix om celinvasie te bestuderen

Dit artikel geeft gedetailleerde methodologieën voor het gebruik van driedimensionale (3D) assays om borstkanker cel invasie kwantificeren. Concreet bespreken we het nodig om dergelijke assays procedures, kwantificering en gegevensanalyse, alsook werkwijzen voor het verlies van membraan integriteit die ontstaat wanneer cellen binnendringen onderzoeken.

Kwantificering van de Breast Cancer Cell Invasiviteit met een drie-dimensionale (3D) Model

Invasie van omliggende normale weefsels is een typerend kenmerk van kwaadaardige tumoren. We bieden hier een eenvoudige, semi-geautomatiseerde microplaattest van invasie in een natuurlijke 3D biomatrix die met een aantal modellen van gevorderde menselijke kankers is geëxemplifeerd.

Driedimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Deze methode evalueert de invasie van kankercellen uit sferoïden in een omringende 3D-matrix.  Sferoïden worden gegenereerd via de hanging drop-kweekmethode en vervolgens ingebed in een matrix bestaande uit basement membraanmaterialen en type I collageen.  Invasie uit de sferoïden wordt vervolgens gemonitord.

Een Cancer Cell Sferoïde Assay om Invasion beoordelen in een 3D-instelling

Kankercellen worden ingebed in een collageengel en vervolgens tussen een acellulair fibrinegel gedaan om een 3D-kweeksysteem te genereren waarin de invasiviteit en vorming van satelliettumoren kunnen worden gemonitord.

Driedimensionale Culture Assay te ontdekken Cancer Cell Invasiviteit en Satellite tumorvorming

Dit protocol biedt gedetailleerde experimentele stappen om een driedimensionale in vitro cultuur van blaastumororganoïden afgeleid van kankerverwekkende murineblaaskanker vast te stellen. Cultuurmethoden zoals passaging, genetische manipulatie en orthotopische transplantatie van tumororganoïden worden beschreven.

Cultuur, manipulatie en orthotopische transplantatie van mouse bladder tumor organoïden

De gepresenteerde aanpak evalueert tegelijkertijd kankercelinvasie in 3D-sferoïde testen en T-celcytotoxiciteit. Sferoïden worden gegenereerd in een steiger-vrije agarose multi-microwell gegoten. Co-cultuur en inbedding in type I collageen matrix worden uitgevoerd in hetzelfde apparaat dat het mogelijk maakt om kankercel invasie en T-cel gemedited cytotoxiciteit te controleren.

Monitoring Cancer Cell Invasion en T-Cell Cytotoxicity in 3D Cultuur

Patiënt-afgeleide organoïden (BOB's) zijn een krachtig hulpmiddel in translationeel kankeronderzoek, dat zowel de genetische als fenotypische heterogeniteit van de ziekte en de reactie op gepersonaliseerde antikankertherapieën weerspiegelt. Hier wordt een geconsolideerd protocol voor het genereren van pdo's voor primaire blaaskanker bij de mens ter voorbereiding op de evaluatie van fenotypische analyses en medicijnresponsen gedetailleerd beschreven.

Cultuur van blaaskanker organoïden als precisie geneeskunde tools

We beschrijven een aanpak om invasieve celsubpopulaties in realtime te detecteren en vast te leggen. Het experimentele ontwerp maakt gebruik van Real-Time Cellular Analysis door veranderingen in de elektrische impedantie van cellen te monitoren. Invasieve kanker, immuun-, endotheel- of stromale cellen in complexe weefsels kunnen worden vastgelegd en de impact van coculturen kan worden beoordeeld.

Real-time detectie en vastlegging van invasieve celsubpopulaties uit coculturen

Invasie is een belangrijk biologisch fenomeen bij de ontwikkeling en progressie van kanker. Dit proces wordt beïnvloed door niet-neoplastische cellen en componenten van de micro-omgeving van de tumor. Het doel van deze studie is het beschrijven van een alternatieve methode voor het analyseren van tumorcelinvasie in vitro met behulp van driedimensionale (3D) culturen.

Alternatieve strategie om in vitro celinvasie van 3D-culturen te analyseren

Leer een 3D-celcultuurmethode voor het bestuderen van blaaskankerinvasie met behulp van tumorsferoïden. Deze techniek maakt real-time monitoring en evaluatie van therapeutische middelen mogelijk.

3D-celcultuur voor het bestuderen van de invasie en evalueren van Therapeutics in blaaskanker

Meer video's verkennen