Een automatische methode om te bepalen van de prestaties van Drosophila in antwoord op temperatuurveranderingen in ruimte en tijd
12 oktober 2018
Hier presenteren we een protocol om automatisch te bepalen door de motorische prestaties van Drosophila op het veranderen van temperatuur met behulp van een programmeerbare temperatuurgevoelig arena die snelle en nauwkeurige temperatuurveranderingen in tijd en ruimte produceert.
Deze methode kan ons helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de reactie van vliegen op temperatuurveranderingen, zoals verschillen tussen genotypen, de interactie met andere zintuiglijke signalen, of de functie van verschillende temperatuurreceptoren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het zorgt voor meerdere snelle en nauwkeurige temperatuurveranderingen die tijd en ruimte en op een geautomatiseerde manier regelen. Begin met het plaatsen van 20 mannelijke en 20 vrouwelijke vliegen in een opfoeffles met 45 milliliter vliegvoedselmedium, en het plaatsen van de fles in een 25 graden Celsius incubator onder 12 uur licht, 12 uur donkere cycli.
Na 10 dagen verdoven de pas afgeschermde vliegen op kooldioxidepads gedurende maximaal vier minuten. En gebruik een penseel om maagdelijke vliegen te verzamelen in 2,5 bij 9,5 centimeter vliegen opfok flacons met 6,5 milliliter vers vliegvoedsel medium, gescheiden door seks in groepen van 20 vliegen per flesje. Breng de flesjes vervolgens vijf tot zeven dagen terug naar de couveuse.
Als u een temperatuurgestuurde arena wilt instellen, schakelt u de arena in en opent u het temperatuurfasenscript in de besturingscomputer. Controleer of de temperatuurvolgorde correct is ingesteld en controleer of de duur van elke experimentele fase is ingesteld op 60 seconden. Bevestig onder de sectie start experimentele blok deze instellingen:het gewenste aantal fasen, iteratief aan/uit opstelling van de indicatieve roodlicht emitterende diodes, twee graden celsius temperatuurstijging per fase en 16 graden Celsius als starttemperatuur.
Voer vervolgens het script van de temperatuurfasen uit. De software zal initialiseren voor vijf seconden dan stoppen. Voor gedragsexperimenten op temperatuur plaatst u een streng witte geleidende tape op de bovenkant van de koperen tegels van de arena, zodat alle randen bedekt zijn.
Plaats een verwarmde aluminium ring rond de koperen tegels en gebruik een schoon weefsel om de glazen deksel af te vegen. Plaats de cover op de bovenkant van de aluminium ring, waardoor een gat waardoor een vlieg kan worden geblazen in en tik op een geacclimateerde vlieg flacon twee keer om de vliegen te dwingen naar de bodem van de flacon. Met behulp van een mond aspirator, val een vlieg en sluit de flacon voordat u het terug in de couveuse.
Blaas de vlieg in de arena door de kloof tussen de glazen deksel en de aluminium ring en onmiddellijk duw de glazen klaver om de kloof te dichten. Plaats een frame van lichten rond de arena om symmetrische verlichting te garanderen en beginnen met opnemen met de video-opname programma. Druk vervolgens op de spatiebalk van de besturingscomputer om te beginnen met het uitvoeren van de experimentele fasen.
Als u de video's wilt volgen, opent u de fly steps tracking software en opent u het configuratiebestand in de map fly tracker. Stel de locatie van de video's in de videomap en de namen van de video's in videobestanden in. Geef de randen van de vliegarena op in arena-instellingen op basis van de x/y pixelcoördinaten van meerdere punten aan de rand van de arena.
Specificer de locatie van de inactieve rode LED's in LED-instellingen, op basis van de x/y pixelcoördinaten van de locatie van het midden van de LED's. Als u de locatie van de randen van de vliegarena wilt controleren, stelt u debug in op true in de arena-instellingen, klikt u op opslaan en voert u het script in de terminal uit. Een schermopname van de video verschijnt met een blauw vierkant gevormd door de coördinaten die zijn ingevoerd in arena-instellingen.
Verander debug in arena-instellingen vervolgens in false. Klik op opslaan en voer het scherm opnieuw uit in de terminal om het trackingproces te starten. In een typisch gedragsexperiment op temperatuur vertonen enkele vliegen die zijn blootgesteld aan 16, 20 of 24 graden Celsius aan het begin van het experiment een hogere bewegingsvrijheid dan na vijf minuten.
De temperatuur-gecontroleerde arena kan ook worden gebruikt om vlieg gedragsreacties van verschillende genetische achtergronden te vergelijken met dynamische temperatuurveranderingen. Bijvoorbeeld, in dit experiment, de snelheid van alle geteste soorten steeg volgens hun eigen reactie curven als de temperatuur steeg, totdat het bereiken van een punt van maximale prestaties, waarna hun snelheden vergaan en de vliegen omgekomen. Wanneer individuele vliegen werden blootgesteld aan 40 graden Celsius in het midden en een kant tegel, met de andere kant tegel op een comfortabele 22 graden celsius de de Wild-type vliegen snel gestopt bewegen langs de arena en blijven in de comfortabele locatie.
In tegenstelling, de klassieke geheugen mutant Dunce vliegen blijven verkennen van de arena en minder tijd doorbrengen dan controles in de comfortabele locatie. Verder zijn testcombinaties van temperatuur en locatie ook nuttig bij het begrijpen van de functie van verschillende temperatuurreceptoren tijdens dynamische temperatuurveranderingen. Zoals geïllustreerd in dit experiment waarbij individuele d melanogaster mutanten werden blootgesteld aan stijgende temperaturen, terwijl een verschuivende comfortabele locatie op 22 graden Celsius werd ook verstrekt.
Tijdens het uitvoeren van deze procedure, vergeet niet om de stappen in orde uit te voeren en snel, zodat u vangen zo veel van vliegen gedrag mogelijk te maken. Naast deze procedure kunnen andere methoden zoals negatieve geotaxi's of warmteverstikkingstesten worden gebruikt om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals waar vliegen normaal bewegen of een normale hittebestendigheid hebben. De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot het begrijpen van neurologische aandoeningen of mutaties waarbij temperatuurperceptie of pijn een rol spelen.
Over het algemeen, individuen nieuw op deze methode zal worstelen, omdat elke stap is eenvoudig op zichzelf, maar ze zijn verplicht om perfect te worden gecoördineerd, zodat de techniek moet worden beoefend.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het beoordelen van de locomotieprestaties van Drosophila als reactie op temperatuurveranderingen met behulp van een programmeerbare, temperatuurgecontroleerde arena. De methode maakt snelle en nauwkeurige temperatuurvariaties mogelijk, wat de studie naar de reacties van vliegen op omgevingsveranderingen faciliteert.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Gedragsbiologie
- Temperatuurgevoeligheid
Achtergrond
- Drosophila dient als modelorganisme voor het bestuderen van genetische en omgevingsinteracties.
- Temperatuurveranderingen kunnen de locomotorische activiteit en het gedrag significant beïnvloeden.
- Het begrijpen van deze reacties kan inzicht bieden in sensorische verwerking en adaptatie.
- Geautomatiseerde methoden verhogen de precisie van de experimentele condities.
Doel van de studie
- Om de locomotieprestaties van Drosophila bij verschillende temperaturen te onderzoeken.
- Om verschillen in reacties tussen diverse genotypen te verkennen.
- Om interacties met andere sensorische signalen te analyseren.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een programmeerbare arena met temperatuurbeheersing.
- Plaatsing van mannelijke en vrouwelijke vliegen in gecontroleerde omgevingen.
- Monitoring van de locomotorische activiteit onder variërende temperatuuromstandigheden.
- Geautomatiseerde gegevensverzameling voor een nauwkeurige analyse.
Belangrijkste Resultaten
- Aangetoond vermogen om temperaturen snel te wijzigen en het gedrag van vliegen te beoordelen.
- Significante verschillen in locomotorische prestaties tussen genotypen geïdentificeerd.
- Interacties tussen temperatuurbesturingen en sensorische signalen aangetoond.
Conclusies
- Deze methode biedt een robuust kader voor het bestuderen van temperatuurgevoeligheid bij Drosophila.
- De resultaten dragen bij aan het begrip van genetische en omgevingsinvloeden op het gedrag.
- Toekomstige studies kunnen deze techniek inzetten voor bredere toepassingen binnen de neurowetenschappen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze methode maakt een high-throughput, geautomatiseerde beoordeling mogelijk van temperatuurafhankelijke locomotorische prestaties bij Drosophila, waardoor kwantitatieve fenotypische gegevens worden verkregen voor doelvalidatie in neurogenetische studies. Door dynamische gedragsresponsen op ruimtelijk en temporeel gecontroleerde thermische stimuli vast te leggen, ondersteunt deze methode de mechanistische risicoreductie van temperatuursensitieve routes die relevant zijn voor modellen van pijn en sensorische stoornissen. De geautomatiseerde tracking en reproduceerbare omgevingscontrole verhogen het voorspellende vertrouwen in vroege discovery-workflows met betrekking tot genfunctie en studies naar omgevingsinteracties.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om genetische bijdragen aan thermische responsphenotypes te onderzoeken, wat de functionele validatie van temperatuursensitiviteitsgenen en neuronale pathways ondersteunt.
- Operationele waarde: Faciliteert de directe vergelijking van mutante en wild-type stammen onder identieke, programmeerbare omgevingscondities om genotypespecifieke effecten te isoleren.
- Voorspellende waarde: Genereert dosis-responsachtige prestatiecurves over temperatuurgradiënten, wat helpt bij de identificatie van functionele drempelwaarden en phenotypic severity gradients voor de prioritering van targets.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert kwantificeerbare locomotorische resultaten (snelheid, locatievoorkeur) die dienen als robuuste, high-content fenotypische read-outs voor het screenen van genetische bibliotheken of farmacologische modulatoren van thermische gevoeligheid.
- Operationele waarde: Geautomatiseerde videotracking en standaardisatie van de arena verminderen de inter-experimentele variabiliteit, wat schaalbare en reproduceerbare assays mogelijk maakt die geschikt zijn voor medium- tot high-throughput screeningcampagnes.
- Assay-gereedheid: Genereert genormaliseerde gedragsmetrieken die gebenchmarkt kunnen worden over genotypen en experimentele batches, wat assay-validatie en reproduceerbaarheid tussen laboratoria ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele relevantie: Modelleert mechanismen van thermische adaptatie bij ectothermen, wat inzicht biedt in geconserveerde neurale thermosensatiepaden met potentiële relevantie voor targets voor pijn en thermoregulatie bij zoogdieren.
- Preklinische continuïteit: Maakt longitudinale beoordeling van thermische prestatiecurven mogelijk, wat risico-gecorrigeerde beslissingen ter ondersteuning van de voortgang in target-validatiepijplijnen faciliteert door genotype-fenotype-omgevingsrelaties vast te stellen.
- Mechanische risicoreductie: Maakt dissectie van de functie van temperatuurreceptoren mogelijk via ruimtelijke en temporele thermische profilering, waardoor ambiguïteit bij het koppelen van genetische laesies aan tekorten in de sensorische verwerking wordt verminderd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het vroege stadium van het ontdekkingsproces, waarbij genetische perturbatie wordt gekoppeld aan kwantificeerbare gedragsmatige output in een gecontroleerde omgevingscontext, waardoor hypothese-gestuurde targetvalidatie en inspanningen voor lead-identificatie in neurobehavioraal onderzoek worden ondersteund.
- Discovery Biology: Ondersteunt systematisch onderzoek naar de functie van temperatuursensitiviteitsgenen door genetische achtergronden te correleren met dynamische locomotorische reacties op gecontroleerde thermische stimuli.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve gedragsmatige read-outs (bijv. snelheid, ruimtelijke voorkeur) die betrouwbare screening van verbindingen of genotypen in temperatuurgevoelige pathways mogelijk maken.
- Analytics: Genereert tijd- en temperatuur-opgeloste gedragsdatasets die geschikt zijn voor statistische vergelijking van prestatiecurves, EC50-achtige thermische drempelwaarden en area-under-curve metrieken over experimentele groepen heen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt thermische respons-fenotypes van Drosophila met geconserveerde sensorische transductiemechanismen, wat bijdraagt aan cross-species targetvalidatie in onderzoek naar thermosensatie en pijn.
- Enterprise Reuse: De geautomatiseerde arena en tracking-pipeline vormen een herbruikbaar platform voor het bestuderen van gen-omgevingsinteracties over meerdere sensorische modaliteiten buiten thermosensatie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt mechanistisch inzicht in neurale circuits voor temperatuurdetectie door een precieze spatiotemporele thermische uitdaging en geautomatiseerde kwantificering van het gedrag mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde omgevingscontrole, geautomatiseerde gegevensverwerving en verminderde handmatige manipulatie, waardoor operator-afhankelijke variabiliteit wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verhoogt het vertrouwen in go/no-go-beslissingen door objectieve, kwantitatieve fenotypische gegevens te leveren, waardoor de afhankelijkheid van subjectieve gedragsscores bij neurogenetische screens wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risicogestuurde prioritering van targets mogelijk door genetische laesies te koppelen aan meetbare tekortkomingen in de thermische prestaties, wat bijdraagt aan de vroege identificatie van therapeutische targets met een hoge betrouwbaarheid.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van Drosophila, het ontwerp van gedragstesten en de configuratie van videogebaseerde trackingsoftware.
- Afhankelijk van temperatuurgecontroleerde arena-hardware, gesynchroniseerde verlichting en videorecordingsystemen voor een nauwkeurige vastlegging van omgevings- en gedragsgegevens.
- Maakt cross-team standaardisatie van arenakalibratie, trackingparameters en definities van thermische protocollen noodzakelijk om reproduceerbaarheid tussen locaties of gebruikers te waarborgen.
- Aanpassing aan andere insectmodellen of sensorische stimuli kan herkalibratie van arenadimensies, trackingdrempelwaarden en thermische opwarmingssnelheden vereisen, gebaseerd op soortspecifieke grootte en responskinetiek.
- Praktische beperkingen omvatten restricties in de doorvoercapaciteit van de arena (één vlieg per run) en de noodzaak voor nauwkeurige procedurele coördinatie om de temporele uitlijning tussen thermische verschuivingen en gedragsregistratie te behouden.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Title
0:29
Fly and Temperature-Controlled Arena Preparation
2:02
Temperature Behavioral Experiments
3:13
Video Tracking and Data Analysis
4:31
Results: Representative Drosophila Performance Analyses in Response to Temperature Changes in Space and Time
6:08
Conclusion
