Inductie van Endothelial differentiatie in cardiale voorlopercellen onder lage Serum voorwaarden

Differentiatie van hartvererver cellen, of CPC's, bij versterking vereist een fase omschakeling van een prolifererende naar een geëngageerde fase, en dit protocol maakt gebruik van efficiënte endotheel afstamming in CPC's. Een groot voordeel van de techniek is dat deze van toepassing is op CPC's die geïsoleerd zijn op basis van verschillende technieken en van verschillende soorten. Dit protocol kan worden gebruikt om de therapeutische mogelijkheden van CPC's voor celtherapie te verbeteren.

Het kan ook worden gebruikt om de mogelijkheden en mechanismen van differentiatie te onderzoeken en hoe deze worden beïnvloed door hartziekten. CPC's zijn een inhomogene populatie cellen die kunnen verschillen in vorm, grootte en potentie. Daarom moet het protocol worden aangepast aan de specifieke subpopulatie van gebruikte CPC's.

Na het verdoven van de muis, veeg de borst met 70% ethanol. Snijd met een schaar de huid en de thoracale wand om de borstholte bloot te leggen. Gebruik tangen om het hart op te tillen, en gebruik vervolgens een schaar om het te snijden aan de basis.

Breng het hart naar een P60 cultuur schotel met vijf milliliter koude PBS, en gebruik tangen om het hart te pompen en het bloed uit de holtes te werpen. Plaats het hart in een P60 schotel met vijf milliliter koude PBS en was het. Gebruik een kleine schaar om de atria te verwijderen, snijd het hart in twee stukken in de lengterichting en was ze in vijf milliliter ijskoude PBS.

Met behulp van kleine schaar, snijd de hartstukken in kleinere secties. Voeg een druppel van een Hank's evenwichtige zoutoplossing met collagenase B op een concentratie van een milligram per milliliter, en gebruik een steriel scheermesje om de kleine stukjes hart grondig gehakt. Voeg vervolgens 2,5 milliliter van de collagenase B-oplossing toe aan de schotel.

Plaats de schotel in een hoek van 30 graden in een couveuse op 37 graden Celsius. Laat de gehakte hartstukken maximaal 30 minuten uitbroeden terwijl u ze tijdens de incubatie herhaaldelijk door een Pasteur pipet passeert. Voeg eerst vijf milliliter koude HBSS toe, aangevuld met 2%FBS aan de gehakte en gehomogeniseerde hartstukken.

Met behulp van een filter van 100 micrometer filtert u de hartstukken om onverteerd weefsel te verwijderen. Centrifuge op 470 keer G en bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en hang de pellet opnieuw op in vijf milliliter rode bloedcelbuffer.

Broed op ijs gedurende vijf minuten met af en toe schudden. Voeg hierna 10 milliliter PBS toe en filter het monster door een filter van 40 micrometer om grotere cellen, waaronder restnocyten, uit te sluiten. Centrifuge op 470 keer G en bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten zonder de pauze.

Dan, opnieuw schorsen van de cellen in DMEM aangevuld met 10%FBS, gericht op een definitieve celconcentratie van een miljoen cellen per milliliter. Verdeel de cellen in twee buizen voor het beitsen en sorteren, voeg 1,5 milliliter van de celoplossing toe aan één buis en 3,5 milliliter aan de tweede buis. Voeg Hoechst oplossing en incubeer op 37 graden Celsius gedurende 90 minuten met af en toe flippen om gelijke verdeling van de kleurstof te garanderen en stolling van de cellen te voorkomen.

De zijbevolking verschijnt bij Hoechst lage lagere linkerhoek naast de belangrijkste bevolking. In de FACS plot kan worden geïdentificeerd op basis van de negatieve controle waarin verapamil vraagt de zijpopulatie te verdwijnen. Warm medium 1 tot 37 graden Celsius op en koel de centrifuge af tot vier graden Celsius.

Centrifugeer de sorteerbuizen op 470 keer G en zes minuten bij vier graden Celsius. Stel de cellen vervolgens opnieuw op in middelbaar gebied. Breng de cellen over op een gas-permeabele P60 schotel met vier milliliter van medium een.

Verander het medium om de drie dagen totdat de cellen een samenvloeiing tussen 70 en 80% Culture SP-CPC's hebben bereikt gedurende twee tot drie dagen in T75-kolven met behulp van acht milliliter medium in elke kolf. Spoel vervolgens voorzichtig het medium aan en spoel de kolf voorzichtig af met vijf milliliter warme HBSS. Behandel de cellen met vijf milliliter trypsine EDTA gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide.

Voeg vervolgens vijf milliliter medium één toe om de trypsineactiviteit te stoppen en breng de celsuspensie over naar een buis van 15 milliliter. Centrifuge op 470 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens worden de cellen opnieuw onderbroken in medium één of medium twee.

Plaat de cellen op P60 schotels, plating 250,000 SP-CPC's per schotel met drie milliliter medium met verschillende serumconcentraties. Na twee dagen van kweken, verzamel het medium van elk gerecht in een 15 milliliter buis om de dode cellen te verzamelen. Probeer de aanhangende cellen zoals eerder beschreven en verzamel de celsuspensie in de 15 milliliter buis die het verzamelde medium bevat.

Centrifuge op 840 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, dan aspirate de supernatant en voeg een milliliter van een of medium een of medium twee voor cel tellen. Vlek de SP-CPC's met trypan blauw en tel de levensvatbare en dode cellen. Spoel eerst het medium aan uit de bereide cellen en spoel ze voorzichtig af met vijf milliliter warme HBSS.

Behandel de cellen met vijf milliliter trypsine EDTA gedurende vijf minuten in de cel incubator. Voeg vervolgens vijf milliliter medium één toe om de trypsineactiviteit te stoppen. Breng de celsuspensie over op een buis van 15 milliliter en centrifuge op 470 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Aspirate de supernatant en voeg medium twee voor cel tellen. Vervolgens zaad 80,000 cellen in elke put van een pre-gecoate zes-put cultuur plaat met drie milliliter van medium twee. Houd de plaat op 37 graden Celsius gedurende 20 tot 24 uur, en verander het medium in elke put tot drie milliliter van medium drie.

Kweek de plaat voor 21 dagen, het veranderen van het medium om de drie dagen. Vlek hierna de cellen met een endotheelmarkering en voer fluorescentiemicroscopie uit om de endotheelaard van de gedifferentieerde cellen te verifiëren. Spoel eerst het medium uit de voorbereide cellen aan en spoel ze voorzichtig af met vijf milliliter warme HBSS.

Behandel de cellen met twee milliliter trypsine EDTA gedurende vijf minuten in de cel incubator, voeg vervolgens drie milliliter van medium drie om de trypsine activiteit te stoppen. Breng de celsuspensie over op een buis van 15 milliliter en centrifuge op 470 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Aspirate de supernatant en voeg een milliliter van medium drie, pipetting zachtjes te mengen.

Tel de cellen en het zaad tussen 2.000 en 4.000 cellen in 100 microliter van medium drie tot elke matrix gecoat goed van een 96-put plaat. Broed de plaat 16 uur lang op 37 graden Celsius. Gebruik hierna twee keer een helderveldmicroscoop om een foto van de cellen te maken.

In deze studie worden geschikte voorwaarden onderzocht voor het vergemakkelijken van endotheellijnengagement van hartvererverensysatorcellen. Wanneer de celvloeiing op of onder 60% is, wordt geen significant verschil gezien in de met 3,5% FBS behandelde monsters. Wanneer cellen op deze samenvloeiing worden behandeld met 0,1%FBS, vertonen ze een afname van celproliferatie op laminine in vergelijking met fibronectine, maar tonen geen toename van celdood.

Cellen met een hoge samenloop vertonen daarentegen geen significant verschil in celproliferatie of celdood tussen de twee aandoeningen. Veranderingen in de celvorm lijken een indicator te zijn van geschikte kweekomstandigheden waarin endotheeldifferentiatie succesvol zal zijn. Binnen zeven tot 14 dagen in het endotheliale differentiatiemedium, worden de succesvolle culturen gezien om grotere cellen met verschillende morfologie te bevatten.

Interessant is dat deze cellen verdwenen tegen het einde van de differentiatiefase en de neiging hadden om in lagere aantallen en op latere punten in culturen met een hoge dichtheid te verschijnen. Buisvorming is consequent succesvol in cellen verguld met een lage dichtheid en gedifferentieerd op laminine, terwijl het wordt gezien om meestal te mislukken in cellen verguld met een hoge dichtheid. Terwijl buisvorming meestal niet succesvol is in cellen gekweekt op fibronectine, ongeacht de celdichtheid, vormen die gedifferentieerd bij een lage dichtheid soms rudimentaire buizen.

De serumconcentratie en celdichtheid om endotheliale afstamming te veroorzaken zijn cruciaal en moeten worden aangepast om vertraging van proliferatie te garanderen met behoud van de levensvatbaarheid. Bij inductie van afstamming kunnen CPC's van mensen of preklinische ziektemodellen worden gebruikt voor celtransplantatiestudies om hun in vivo differentiatiepotentieel te beoordelen. Dit protocol zou kunnen helpen bij het bestuderen of vestigen van nieuwe cardiale regeneratie tools, en het werd eerder gebruikt om moleculaire mechanisme van vroege afstamming inzet te bestuderen.