Name: Inductie van Endothelial differentiatie in cardiale voorlopercellen onder lage Serum voorwaarden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Leer een protocol voor endotheliale differentiatie van cardiale voorlopercellen met optimale serumconcentratie en cel-dichtheid. Deze methode ondersteunt onderzoek naar hartregeneratie en celtherapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Vera Lorenz voor haar nuttige ondersteuning tijdens de experimenten en het personeel van de Stroom Cytometry faciliteit van het departement van biogeneeskunde (DBM), de Universiteit en de Universiteit ziekenhuis Bazel. Dit werk werd gesteund door het verblijf-on track program van de Universiteit van Bazel (tot Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster wordt ondersteund door een subsidie van de Zwitserse National Science Foundation (subsidie nummer 310030_156953).

Het gebruik van muizen voor cel isolatie doel was volgens de richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van proefdieren en met de Zwitserse wet op dier en werd goedgekeurd door de Zwitserse kantonnale autoriteiten.
Opmerking: De isolatie van Sca-1+/CD31- SP-CPC's vanuit het hart van de muis was in wezen gedaan als eerder beschreven34 met enkele wijzigingen. Zie Tabel van materialenvoor de materialen en de gebruikte reagentia. Voor alle experimenten, werden cardiale SP-CPC's geïsoleerd van muizen versterkt gepasseerd en gebruikt in een cel lijn-achtige manier. Passages 7-20 werden gebruikt voor deze studie.
1. de weefsels voorbereiding
Opmerking: Alle experimenten met behulp van muizen moeten worden uitgevoerd volgens de richtlijnen en verordeningen. Dit protocol maakt gebruik van vier muizen. Cultuur-platen die 100 mm diameter zijn worden beschreven als P100 en cultuur platen die 60 mm diameter worden beschreven als P60 voor de volgende onderdelen van het protocol.
<ol><li>Injecteer elke muis met 200 mg/kg pentobarbital intraperitoneally (i.p.) en wacht totdat het is volledig verdoofd door het controleren van haar reactie om te Teen knijpen.</li>
	<li>Veeg de borst met 70% ethanol. Snijd de huid en thoracale muur met een schaar de borstholte bloot te stellen.</li>
	<li>Til het hart met een tang en snijd het op het honk met behulp van schaar. Het hart in een P100 met 25 mL (5 mL voor P60) koude-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (drie tot vijf harten per P100) of één tot twee harten per P60 plaatsen</li>
	<li>Het hart pomp met een tang om uit te werpen van het bloed uit de holten (figuur 1A).</li>
	<li>Zet het hart in een P100 met 25 mL (5 mL voor P60) van koude PBS voor wassen. Verwijder de atria met behulp van kleine schaar. Het hart in twee longitudinale stukjes gesneden en was ze weer in ijskoude PBS (25 mL/P100, 5 mL/P60).</li>
	<li>De stukken overbrengen in een nieuwe P100 met 25 mL (5 mL voor P60) koude PBS. Snij de stukken in kleinere stukken met behulp van kleine schaar (figuur 1B). Voeg een druppel van 1 mg/mL collagenase B verdund in Henks evenwichtige zoutoplossing (HBSS) en gehakt van de kleine stukjes grondig met een steriele scheermesje (Figuur 1 c).</li>
</ol>2. de spijsvertering
<ol><li>Voeg 10 mL (2,5 mL voor P60) van de 1 mg/mL collagenase B oplossing om de schotel vanaf stap 1.6.</li>
	<li>Zet de collagenase B-oplossing met de gehakt hart stuks in een gekantelde (ongeveer 30°) P100 (of P60) in een 37 ° C incubator (Figuur 1 d).</li>
	<li>Incubeer de stukken gehakt hart voor een maximum van 30 min; Meng door herhaaldelijk passeren hen een pipet van Pasteur elke 10 min tijdens de incubatie (figuur 1E). Opmerking: Het is belangrijk niet meer bedragen dan 30 min van incubatie in totaal voor stap 1.3.</li>
</ol>3. filtratie
<ol><li>Voeg vervolgens 10 mL (5 mL voor P60) van koude HBSS aangevuld met 2% FBS aan de stukken gehakt en gehomogeniseerde hart. Opmerking: HBSS aangevuld met 2% FBS lest collagenase B activiteit.</li>
	<li>Filtreer het hart stukken door 100 µm filter verwijderen onverteerd weefsel en centrifuge op 470 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) (figuur 1F, gele filters).</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 5 mL (3 mL voor P60) rode bloedcel lysis-buffermengsel en Incubeer de pellet voor 5 min met af en toe schudden op ijs.</li>
	<li>Voeg vervolgens 10 mL (5 mL voor P60) van PBS (om te stoppen met de lysis van de reactie) en filtreer het monster door een filter van 40 µm uit te sluiten van grotere cellen, met inbegrip van residuele cardiomyocytes (figuur 1F, blauwe filters).</li>
	<li>Centrifugeer de buis bij 470 x g gedurende 5 min op RT (zonder de rem). Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 mL DMEM inclusief 10% FBS.</li>
	<li>De cellen in een aliquot deel met een hemocytometer tellen. Resuspendeer de cellen met DMEM inclusief 10% FBS, die gericht zijn op een concentratie van de laatste cel van 1 x 106 cellen/mL. Opmerking: Ongeveer 5 x 106 cardiomyocyte - en erytrocyt-verarmd cellen kunnen worden geschat per muis.</li>
	<li>De cellen verdelen over twee buizen (Figuur 2): in buis A, voeg 1,5 mL voor Hoechst 33342 kleuring met verapamil; in buis B, voeg 18.5 mL voor Hoechst 33342 kleuring en overgaan tot de vlek en stroom cytometry (stap 4.1 en 4.2) SP hartcellen wilt sorteren.</li>
</ol>4. het sorteren van cardiale SP cellen door Stroom Cytometry
Opmerking: Verapamil remt Hoechst efflux door het blokkeren van multidrug resistentie (MDR) ABC vervoerder activiteit. Hoechst 33342 is een DNA-bindende kleurstof die in levende cellen kan worden gebruikt voor het detecteren van de celcyclus tijdens het correleert met de DNA-inhoud. Hoechst-33342-diepte cellen worden weergegeven in het lage deel van Hoechst van beide kanalen emissie (450 nm, Hoechst blauw; 650 nm, Hoechst rood), dat wil zeggen, afgezien van de Hoechst-behoud "belangrijkste bevolking", waardoor ze hun naam "kant bevolking". SP cellen zijn verrijkt met cellen met voorlopercellen eigenschappen en tonen een hoge uitdrukking van multiresistente ABC vervoerders (zoals MDR1 en ABCG2). Hoechst 33342 wordt geschreven als Hoechst voor de volgende onderdelen van het protocol. Het is belangrijk om te beschermen lichtgevoelig materiaal voor ideale resultaten.
<ol><li>
Kleuring met Hoechst in de aanwezigheid en de afwezigheid van verapamil
	<ol>
<li>Verapamil (met een eindconcentratie van 83.3 µM) en Hoechst (met een eindconcentratie van 5 µg/106 cellen) toevoegen aan de oplossing van de cel. Voor buis A, het gebruik van Verapamil en Hoechst; buis B, alleen voor gebruik door Hoechst. Incubeer in een waterbad (bij 37 ° C) voor 90 min en terugkeren van de buizen iedere 20 min (figuur 1G).</li>
		<li>Centrifugeer de buizen bij 470 x g gedurende 5 min op RT. Discard het supernatant en resuspendeer elke pellet in HBSS (1 x 106 cellen/mL).</li>
		<li>Neem een 1,5 mL aliquoot voor enkele technieken en negatieve controle uit buis B (Figuur 2): (i) fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-geconjugeerd anti-Sca-1; (ii) allophycocyanin (APC)-geconjugeerd anti-CD31; (iii) nonstained cellen (negatieve controle). Opmerking: Isotype besturingselementen worden hier gebruikt voor het opzetten van het protocol van de isolatie.</li>
		<li>Centrifugeer buizen A en B en de single-kleuring en negatieve controle aliquots bij 470 x g gedurende 5 min op RT voor het wassen van Hoechst en verapamil.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellets van buis A en (iii) de negatieve controle in een 250 µL van HBSS en houden hen op ijs in het donker tot sorteren.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet van buisje B in 200 µL van HBSS en de pellet van (i, ii) de single-kleuring aliquots in 100 µL van HBSS. Voeg FITC-geconjugeerd anti-Sca-1 (0,6 µg/107 cellen) en APC-geconjugeerde anti-CD31 (0,25 µg/107 cellen). Incubeer de pellets voor 30 min op ijs en schud ze van tijd tot tijd in het donker.</li>
		<li>Voeg 2 mL HBSS de buizen. Centrifugeer de buizen bij 470 x g gedurende 5 min op RT.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer alle pellets met 1 mL HBSS en centrifuge als hierboven. Gooi het supernatant. Resuspendeer de pellet van de single-kleuring aliquots in 200 µL van HBSS. Resuspendeer de pellet van buisje B in HBSS (20 x 106 cellen/mL).</li>
		<li>Houd de monsters op ijs en beschermd tegen licht tot sorteren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sorteren met stroom cytometry
	<ol>
<li>Bereiden van steriele 1,5 mL buisjes met 500 µL van HBSS inclusief 2% sorteren FBS.</li>
		<li>Vlek van de cellen met 7-aminoactinomycin D (7-AAD) (0,15 µg/106 cellen) op het ijs gedurende 10 minuten om uit te sluiten van de dode cellen.</li>
		<li>Sorteren van de cardiale SP met de volgende instellingen: excite Hoechst met behulp van 350 nm (UV) excitatie, fluorescentie emissie met een 450/50 nm band pass filter (Hoechst blauw) en een 670/30 nm band pass filter (Hoechst rood) verzamelen en gebruiken van een mondstuk grootte van 100 µm en druk van 15 psi.</li>
		<li>Vastleggen voor analyse, 5 x 105 evenementen voor de sorteer monsters en 1 x 105 evenementen voor de negatieve controle, verapamil controle en single-kleuring monsters. Opmerking: De cardiale SP is ongeveer 0,5% - 2% (Figuur 1 H) maar kan variëren tussen laboratoria en isolaten. De Sca-1+-/CD31- breuk is ongeveer 1-11% van de totale cardiale SP (figuur 1I) maar kan variëren tussen laboratoria en isolaten. SCA-1+/CD31- SP-CPC's zijn geschreven als SP-CPC's voor de volgende onderdelen van het protocol.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. primaire cultuur van geïsoleerde SP-CPC 's
Opmerking: Drie verschillende soorten media werden gebruikt in dit protocol. Ze worden aangeduid als Medium 1 (volgens Noseda et al.) 8en 3 Medium en medium 2, zijn beschreven in de Tabel van materialen met betrekking tot hun samenstelling.
<ol><li>Opwarmen van Medium 1 tot en met 37 ° C vóór gebruik en afkoelen van de centrifuge tot 4 ° C. Centrifugeer het sorteren buizen bij 4 ° C en 470 x g voor 6 min en resuspendeer de cellen in Medium 1.</li>
	<li>Zet de cellen op een gas-permeabele P60 schotel met 4 mL Medium 1. Het medium elke 3 d totdat de cellen hebben bereikt van 70% - 80% samenvloeiing wijzigen Opmerking: Stap 5.2 kan ongeveer 2-3 weken duren.</li>
</ol>6. uitbreiding en differentiatie van SP-CPC 's
<ol><li>
Celcultuur
	<ol>
<li>3 x 105 SP-CPC's in 8 mL Medium 1 in een maatkolf van T75 cultuur.</li>
		<li>SP-CPCs incuberen bij 37 ° C met 5% CO2 tot 70% - 80% samenvloeiing, wijzigen van het medium elke 2-3-d. Opmerking: Het aantal cellen moet worden aangepast volgens het type van het CPCs gebruikt, de verdubbeling tijd en grootte van de cel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SP-CPC groei en levensvatbaarheid onder verschillende serum concentraties
	<ol>
<li>Cultuur-SP-CPC's voor 2-3 d in T75 kolven met 8 mL Medium 1. Zorgvuldig gecombineerd van het medium en spoel zachtjes met 5 mL warm (37 ° C) HBSS.</li>
		<li>De cellen met 5 mL trypsine-EDTA gedurende 5 min. in de cel incubator behandelen, voeg 5 mL van Medium 1 naar het stoppen van de trypsine-activiteit en de celsuspensie overbrengen in een tube van 15 mL.</li>
		<li>Centrifugeer de cellen bij 470 x g gedurende 5 min op RT.</li>
		<li>Resuspendeer de cellen in Medium of Medium 2 (gemiddeld van de inductie van de bloedlijn) 1en plaat 2.5 x 105 SP-CPC's op P60 gerechten met 3 mL medium dat van concentraties van de verschillende serum.</li>
		<li>Het medium van de schotel van stap 6.2.4 voor het verzamelen van dode cellen in een tube van 15 mL na 2 d van kweken in Medium 1 of Medium 2 verzamelen.</li>
		<li>Trypsinize Adherente cellen zoals in stap 6.2.2 en het verzamelen van de celsuspensie in de tube van 15 mL van stap 6.2.5. Centrifugeer de cellen bij 840 x g gedurende 5 min op RT.</li>
		<li>De bovendrijvende substantie gecombineerd en voeg 1 mL Medium 1 of 2 Medium voor het tellen van de cel. Vlek SP-CPC's met trypan blauw (0,4%) en graaf trypan blauw-positieve (doden) en trypan blauw-negatief (levensvatbare) cellen. Opmerking: De levensvatbaarheid van de cellen (stap 6.2.7) wordt gegeven als de trypan-blauw negatieve celaantal in verhouding tot de cel totaal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inductie van endothelial differentiatie
	<ol>
<li>Precoat een plaat (6-well) cultuur met 10 µg/mL laminin (LN) of fibronectine (FN).<ol>
<li>Maak een oplossing van de substraat met 10 µg/mL LN of FN met F12 medium (of PBS). Voeg 2 mL substraat oplossing aan elk putje. Handhaven van de plaat gedurende 30 minuten bij 37 ° C.</li>
			<li>De oplossing van de plaat gecombineerd en voeg 2 mL PBS aan elk putje tot het gebruik ervan.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Het medium van de cellen vanaf stap 6.1.2 gecombineerd, spoel ze zachtjes met 5 mL warm (37 ° C) HBSS behandel hen met 5 mL trypsine-EDTA gedurende 5 min. in de cel incubator, voeg 5 mL van Medium 1 naar het stoppen van de trypsine-activiteit en de celsuspensie overbrengen in een tube van 15 mL.</li>
		<li>Centrifugeer de cellen bij 470 x g gedurende 5 min op RT. Aspirate het supernatant en Medium 2 toe te voegen voor het tellen van de cel.</li>
		<li>Zaad 8 x 104 cellen per goed op de beklede plaat met 3 mL Medium 2 en houd het bij 37 ° C gedurende 20-24 h. verandering het medium tot 3 mL van Medium 3. Opmerking: We raden opslagmedium met een lage serumconcentratie — en zonder supplementen — voor de eerste 20-24 uur. Het wordt afgeraden gebruik < 60% cel samenvloeiing (dat wil zeggen, het nummer van de cel van deelactiviteit 6.3.4 moet worden aangepast afhankelijk van de snelheid van de cel grootte en groei).</li>
		<li>Cultuur van de cellen voor 21 d en het medium elke 3 d te wijzigen.</li>
		<li>Controleren van het endotheel karakter van gedifferentieerde cellen door hen kleuring met een endothelial marker zoals von Willebrand Factor (vWF) en presterende fluorescentie microscopie.<ol>
<li>De cellen met 1 mL PBS wassen en repareren van cellen in 3,7% formaldehyde voor 2 min op RT.</li>
			<li>Permeabilize van de cellen met 0,1% Triton X in ddH2O (of PBS) voor 30 min en blokkeren met 10% serum van de geit gedurende 1 uur op RT.</li>
			<li>Incubeer de cellen met anti-von Willebrand factor antilichaam (1:100) voor 48 uur bij 4 ° C</li>
			<li>Wassen van de cellen 3 x met 1 mL PBS, gedurende 10 minuten elke keer. Incubeer hen met Alexa Fluor 546 geit anti-konijn secundair antilichaam (1:500) gedurende 1 h bij RT in het donker.</li>
			<li>Wassen weer 3 x, voor 10 minuten elk, met 1 mL PBS. Vlek de celkernen met 4'6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI; 1:500) gedurende 5 min. op de RT in het donker.</li>
			<li>Wassen van de cellen 3 x, voor 5 minuten elk, met 1 mL PBS. Monteren van de cellen en hen bewaren bij 4 ° C Opmerking: De kweken gebruiksvoorwaarden (substraat, medium, aanvullende reagentia en FBS concentratie) stap 6.1 en 6.3 worden beschreven in Figuur 3.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Buis vorming assay
	<ol>
<li>Bereiden van een kelder membraan matrix (bijvoorbeeld, Matrigel, voortaan matrix genoemd) plaat.<ol>
<li>Ontdooi de matrix bij 4 ° C's nachts.</li>
			<li>Jas een 96-wells-plaat met 100 µL van de matrix op ijs. Opmerking: Het is belangrijk te voorkomen dat alle bubbels in de matrix. De platen moeten worden bekleed op het ijs om te voorkomen dat de jellification van de matrix.</li>
			<li>Het handhaven van de plaat bij 37 ° C gedurende 30 minuten.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Het medium van de cellen (na de voltooiing van stap 6.3.5) gecombineerd, zachtjes spoel de cellen met 5 mL warm (37 ° C) HBSS en behandel hen met trypsine-EDTA gedurende 5 min. in de cel incubator. Voeg Medium 3 om te stoppen de trypsine-activiteit en de celsuspensie overbrengen in een tube van 15 mL.</li>
		<li>Centrifugeer de cellen bij 470 x g gedurende 5 min op RT. Aspirate het supernatant, voeg 1 mL Medium 3 en pipet zachtjes.</li>
		<li>Filter de cellen met een 35 µm cel zeef, als de cellen worden samengevoegd.</li>
		<li>Cellen tellen en 2 x 10,3 naar 4 x 103 cellen in 100 µL van Medium 3 in elk matrix-gecoate goed zaad. Houd de plaat bij 37 ° C in de cel incubator voor 16 h.</li>
		<li>Maak een foto met een helder-veld Microscoop bij 2 X vergroting. Opmerking: In het geval van een incomplete trypsinebehandeling, verlengen de belichtingstijd te trypsine-EDTA tot een maximum van 7-8 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Beltrami, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+cardiac+stem+cells+are+multipotent+and+support+myocardial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration.</a> Cell. 114 (6), 763-776 (2003).</li>
<li>Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+post-natal+heart+contains+a+myocardial+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The post-natal heart contains a myocardial stem cell population.</a> FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).</li>
<li>Sandstedt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left+atrium+of+the+human+adult+heart+contains+a+population+of+side+population+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells.</a> Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255(2012).</li>
<li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+%28SCIPIO%29%3A+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li>
<li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+%28CADUCEUS%29%3A+a+prospective%2C+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li>
<li>Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+fates+of+cardiovascular+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Origins and fates of cardiovascular progenitor cells.</a> Cell. 132 (4), 537-543 (2008).</li>
<li>Smits, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cardiomyocyte+progenitor+cells+differentiate+into+functional+mature+cardiomyocytes%3A+an+in+vitro+model+for+studying+human+cardiac+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology.</a> Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).</li>
<li>Noseda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGFRalpha+demarcates+the+cardiogenic+clonogenic+Sca1%2B+stem%2Fprogenitor+cell+in+adult+murine+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium.</a> Nature Communications. 6, 6930(2015).</li>
<li>Linke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+dog+heart+are+self-renewing%2C+clonogenic%2C+and+multipotent+and+regenerate+infarcted+myocardium%2C+improving+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Acadademy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function.</a> Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).</li>
<li>El-Mounayri, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+differentiation+of+functional+human+coronary-like+vascular+smooth+muscle+cells+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).</li>
<li>Ellison, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+c-kit%28pos%29+cardiac+stem+cells+are+necessary+and+sufficient+for+functional+cardiac+regeneration+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair.</a> Cell. 154 (4), 827-842 (2013).</li>
<li>Oh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+progenitor+cells+from+adult+myocardium%3A+homing%2C+differentiation%2C+and+fusion+after+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Acadademy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction.</a> Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).</li>
<li>Martin, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+expression+of+the+ATP-binding+cassette+transporter%2C+Abcg2%2C+identifies+cardiac+SP+cells+in+the+developing+and+adult+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart.</a> Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).</li>
<li>Pfister, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD31-+but+Not+CD31%2B+cardiac+side+population+cells+exhibit+functional+cardiomyogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation.</a> Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).</li>
<li>Pelekanos, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+transcriptome+and+immunophenotype+analysis+of+renal+and+cardiac+MSC-like+populations+supports+strong+congruence+with+bone+marrow+MSC+despite+maintenance+of+distinct+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities.</a> Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).</li>
<li>Laugwitz, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+isl1%2B+cardioblasts+enter+fully+differentiated+cardiomyocyte+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages.</a> Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).</li>
<li>Bu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ISL1+heart+progenitors+generate+diverse+multipotent+cardiovascular+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages.</a> Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).</li>
<li>Smith, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+resident+endogenous+c-Kit%2B+cardiac+stem+cells+from+the+adult+mouse+and+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).</li>
<li>Matsuura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+cardiac+Sca-1-positive+cells+differentiate+into+beating+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).</li>
<li>Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+migration+of+Sca1%2B%2FCD31-+cardiac+side+population+cells+in+a+murine+myocardial+ischemic+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model.</a> International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).</li>
<li>Vicinanza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+cardiac+stem+cells+are+multipotent+and+robustly+myogenic%3A+c-kit+expression+is+necessary+but+not+sufficient+for+their+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification.</a> Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).</li>
<li>Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+c-kit+receptor%2C+stem+cell+factor%2C+and+mast+cells.+What+each+is+teaching+us+about+the+others%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others.</a> American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).</li>
<li>Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+c-kit+expression+in+human+endothelial+cells+by+inflammatory+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli.</a> Blood. 90 (1), 148-155 (1997).</li>
<li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+c-kit+in+hemopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).</li>
<li>Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Sca-1+in+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function.</a> Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).</li>
<li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li>
<li>Pfister, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+ATP-binding+cassette+transporter+Abcg2+in+the+phenotype+and+function+of+cardiac+side+population+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells.</a> Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).</li>
<li>Messina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+adult+cardiac+stem+cells+from+human+and+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart.</a> Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).</li>
<li>Davis, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+cardiosphere+method+to+culture+cardiac+progenitor+cells+from+myocardial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue.</a> PLoS One. 4 (9), e7195(2009).</li>
<li>Carr, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiosphere-derived+cells+improve+function+in+the+infarcted+rat+heart+for+at+least+16+weeks--an+MRI+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks--an MRI study.</a> PLoS One. 6 (10), e25669(2011).</li>
<li>Martens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhesus+monkey+cardiosphere-derived+cells+for+myocardial+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration.</a> Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).</li>
<li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+roles+of+CD90+and+c-kit+to+the+regenerative+efficacy+of+cardiosphere-derived+cells+in+humans+and+in+a+mouse+model+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260(2014).</li>
<li>Mochizuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polo-Like+Kinase+2+is+Dynamically+Regulated+to+Coordinate+Proliferation+and+Early+Lineage+Specification+Downstream+of+Yes-Associated+Protein+1+in+Cardiac+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells.</a> Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).</li>
<li>Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+resident+cardiac+progenitor+cells+by+Hoechst+33342+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining.</a> Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).</li>
<li>Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors%2C+matrices%2C+and+forces+combine+and+control+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells.</a> Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).</li>
<li>Plaisance, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+Lineage+Specification+in+Adult+Human+Cardiac+Precursor+Cells+Via+Modulation+of+Enhancer-Associated+Long+Noncoding+RNA+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22JACC%3A+Basic+to+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression.</a> JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Voordelen van dit Protocol:
Dit protocol biedt een endothelial differentiatie techniek van het CPCs. We vonden dat een lage serumconcentratie en lage celdichtheid de efficiëntie van endothelial differentiatie, waarbij LN bleek te zijn een meer geschikte substraat dan FN onder deze omstandigheden zou kunnen verbeteren. We gebruikten twee verschillende soorten CPCs: rat CPCs, die werden gebruikt in een cel lijn-achtige wijze, en muis SP-CPC's, die werden geïsoleerd en uitgebreid. Met name het proto...

Recente studies ondersteunen het bestaan van resident cardiale voorlopercellen (CPC) in de2,van volwassen zoogdieren hart1,3, en CPC's zou een nuttige bron voor celtherapie na cardiale letsel4, 5. Bovendien uitgebreide CPCs kunnen voorzien in een vruchtbare model drug screening en het onderzoek naar de ziekte mechanismen als geïsoleerde patiënten met zeldzame aandoeningen, of aan respectieve ziekte modellen6,7.
CPC's geïsoleerd van de volwassen hart bezitten stam/progenitor cel kenmerken1,2,3,8 , zoals ze multipotente zijn, clonogenic, en hebben de capaciteit voor zelf-vernieuwing. Echter, er zijn veel verschillende (sub) bevolking van CPC's verschillende oppervlakte marker profielen, met inbegrip van, bijvoorbeeld, c-kit, Sca-1 en anderen, tentoonstellen of opgehaald door verschillende isolatie technieken (tabel 1). Diverse protocollen van de cultuur en de differentiatie zijn gevestigde1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. Deze protocollen verschillen meestal met betrekking tot de groeifactor en serum inhoud, die zijn aangepast aan het doel van het kweken en die kan leiden tot verschillen in de resultaten en effecten, met inbegrip van differentiatie efficiëntie.
Marker gebaseerde isolatie technieken:
CPC's kunnen worden geïsoleerd op basis van een specifieke oppervlakte marker expressie1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Eerdere studies suggereren dat de c-kit en Sca-1 de beste markers zijn kunnen te isoleren van de resident CPCs1,11,14,19,20. Omdat geen van deze markers echt specifiek voor CPC is, worden combinaties van verschillende markeringen gewoonlijk toegepast. Bijvoorbeeld, terwijl het CPCs express lage niveaus van c-kit21, is c-kit ook uitgedrukt door andere celtypes, met inbegrip van mestcellen22, endotheliale cellen23en hematopoietische stamcellen/voorlopercellen cellen24. Een bijkomend probleem is het feit dat niet alle markeertekens worden uitgedrukt in alle soorten. Dit is het geval voor Sca-1, die in de muis maar niet in menselijke25 uitdrukt. Met behulp van protocollen die onafhankelijk van isolatie markeringen zijn kan dus voordelig met het oog op klinische proeven en studies met menselijke specimens.
Marker-onafhankelijke isolatie technieken:
Er zijn verschillende belangrijke technieken voor CPC-isolatie, die vooral onafhankelijk zijn van oppervlakte marker expressie, maar die kunnen worden verfijnd door de opeenvolgende selectie van specifieke marker-positieve subfractions zo nodig (Zie ook tabel 1). (1) de kant bevolking (SP) techniek was oorspronkelijk gekenmerkt in een primitieve bevolking van hematopoietische stamcellen, gebaseerd op de mogelijkheid om de DNA kleurstof Hoechst 3334226 efflux van ATP-binding cassette (ABC) vervoerders27. SP hartcellen zijn geïsoleerd door verschillende groepen en gerapporteerd om uit te drukken een scala aan markeringen met enkele kleine verschillen tussen rapporten2,8,13,14. (2) kolonie-vormende eenheid fibroblast cellen (CFU-Fs) zijn oorspronkelijk vastgesteld gebaseerd op een mesenchymale stromale cel (MSC)-als fenotype. Geïsoleerde MSCs worden gekweekt op gerechten voor het opwekken van de vorming van de kolonie. Dergelijke kolonie-vormende MSC-achtige CFU-Fs kunnen worden geïsoleerd uit het volwassen hart en zijn in staat om het verschil in cardiale lineages15. (3) Cardiosphere-afgeleide cellen (CDC) zijn afzonderlijke cellen afgeleid van clusters van cellen gegroeid van weefsel biopsieën of28,29,30,31explants. Het werd onlangs aangetoond dat meestal de CD105+/CD90-/c-kit- cel breuk vertoont cardiomyogenic en regeneratieve potentiële32.
Hier, voorzien wij een protocol met behulp van SP-CPC's geïsoleerd van muizen, voor de efficiënte inductie van endothelial overdrachtslijn op basis van een eerdere studie in het CPCs rat en muis SP-CPCs33. Het protocol bevat specifieke aanpassingen aan de cultuur en techniek van de uitbreiding met betrekking tot de celdichtheid, de serum-inhoud van het medium, en het substraat. Het kan worden toegepast op muis SP-CPC's niet alleen maar aan verschillende soorten-CPC's voor het doel voor het opwekken van de overstap van een lot van een sturen naar een CPC endotheel-begaan, zij het met het oog op de transplantatie van deze cellen of het gebruik ervan voor mechanistische in vitro studies.

<table><tbody><tr><td>Kweekmedium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>ThermoFisher</td><td>#12440</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham</td><td>Merck</td><td>#D8437</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td><td>ThermoFisher</td><td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>#SH30071</td><td>3.5% (0.1% voor lijnage-inductie)</td></tr><tr><td>L-Glutamine&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>#25030</td><td>Eindconcentratie 2 mM</td></tr><tr><td>Glutathione</td><td>Merck</td><td>#G6013</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>#AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)</td><td>Peprotech</td><td>#AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>ThermoFisher</td><td>#17504044</td><td></td></tr><tr><td>Cardiotrophin 1&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>#250-25</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Diagontech AG, Zwitserland</td><td>#100-125</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td><td>ThermoFisher</td><td>#14170</td><td></td></tr><tr><td>0.05 % Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>#25300</td><td></td></tr><tr><td>T75 Flask</td><td>Sarstedt</td><td>#83.3911</td><td></td></tr><tr><td>Endotheeldifferentiatie&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>#CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12K (Kaighn's) Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>#21127</td><td></td></tr><tr><td>Laminin&nbsp;</td><td>Merck</td><td>#L2020</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin&nbsp;</td><td>Merck</td><td>#F4759</td><td>Verdunnen in ddH2O</td></tr><tr><td>6 Well Plate</td><td>Falcon</td><td>#353046</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde Solution</td><td>Merck</td><td>#F1635</td><td>Verdunnen 1:10 in PBS (3.7% eindconcentratie)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>#93420</td><td>0.1% in ddH2O</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum (10%)</td><td>ThermoFisher</td><td>#50062Z</td><td></td></tr><tr><td>Anti-von Willebrand Factor antibody</td><td>Abcam</td><td>#ab6994</td><td>1:100 in 10% geitenserum</td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546</td><td>ThermoFisher</td><td>#A11010</td><td>1:500 in 10% geitenserum</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenylindole, dihydrochloride (DAPI)</td><td>ThermoFisher</td><td>#62247</td><td>1:500 in ddH2O&nbsp;</td></tr><tr><td>SlowFade Antifade Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>#S2828</td><td></td></tr><tr><td>BX63 widefield microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buisvorming</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 Well Plate</td><td>Falcon</td><td>#353072</td><td></td></tr><tr><td>5 ml ronde bodembuis met zeefdop</td><td>Falcon</td><td>#352235</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced</td><td>Corning</td><td>#354230</td><td></td></tr><tr><td>IX50 widefield microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sca-1+/CD31- cardiac side population isolatie34&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Natrium 50 mg/ml voor veterinair gebruik</td><td>eigen ziekenhuisapotheek</td><td>#9077862</td><td>Werkoplossing: 200 mg/kg</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td><td>ThermoFisher</td><td>#20012</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), fenolrood (-)</td><td>ThermoFisher</td><td>#14175</td><td>Bereid HBSS 500 mL + 2% FBS&nbsp; voor het dempen van Collagenase B-activiteit&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L van D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvaat</td><td>ThermoFisher</td><td>#331885</td><td>Bereid DMEM + 10% FBS&nbsp; + 25 mM HEPES+ P/S voor Hoechst-kleuring</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&nbsp; (P/S)</td><td>ThermoFisher</td><td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>ThermoFisher</td><td>#15630080</td><td>Eindconcentratie 25 mM</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>#SH30071</td><td></td></tr><tr><td>RBC LysisBuffer (10X)</td><td>BioLegend</td><td>#420301/100mL</td><td>Verdunnen tot 1X in ddH2O en filteren door een 0.2 &micro;m filter</td></tr><tr><td>Collagenase B</td><td>Merck</td><td>#11088807001</td><td>Eindconcentratie 1 mg/mL in HBSS, gefilterd door een 0.2 &micro;m filter</td></tr><tr><td>bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst)</td><td>Merck</td><td>#B2261</td><td>Bereid 1 mg/mL in ddH2O</td></tr><tr><td>Verapamil-hydrochloride&nbsp;</td><td>Merck</td><td>#V4629</td><td>Eindconcentratie 83.3 &micro;M&nbsp;</td></tr><tr><td>APC Rat Anti-Mouse CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>#551262</td><td>0.25 &micro;g/107cellen</td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>#557405</td><td>0.6 &micro;g/107cellen</td></tr><tr><td>7-Aminoactinomycine D (7-ADD)</td><td>ThermoFisher</td><td>#A1310</td><td>0.15 &micro;g/106cellen</td></tr><tr><td>APC rat IgG2a k Isotype Control</td><td>BD Biosciences</td><td>#553932</td><td>0.25 &micro;g/107cellen</td></tr><tr><td>FITC Rat IgG2a k Isotype Control</td><td>BD Biosciences</td><td>#554688</td><td>0.6 &micro;g/107

inductie van endothelial differentiatie in cardiale voorlopercellen onder lage serum voorwaarden

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Cardiale voorlopercellen (CPC) wellicht therapeutisch potentieel voor cardiale herstel na blessure. In de volwassen zoogdieren hart, intrinsieke CPCs zijn uiterst schaars, maar uitgebreide CPCs zou nuttig voor celtherapie. Een voorwaarde voor het gebruik ervan is hun vermogen om te onderscheiden op een gecontroleerde manier in de diverse cardiale geslachten gedefinieerd en efficiënte protocollen gebruiken. Bovendien, bij in vitro expansie, CPC's die bij patiënten geïsoleerd zijn of preklinische ziekte modellen vruchtbare onderzoeksmiddelen voor het onderzoek naar de ziekte mechanismen kunnen bieden.
Huidige studies gebruiken verschillende markeringen ter identificatie van CPC. Echter zijn niet alle van hen uitgedrukt in mens, die beperkt de translationeel impact van sommige Preklinische studies. Differentiatie-protocollen die zijn van toepassing ongeacht de isolatie-techniek en marker-expressie zal voor de gestandaardiseerde uitbreiding en priming van CPC's voor cel therapie doel toestaan. Hier beschrijven we dat de priming van CPC's onder een lage foetale runderserum (FBS) concentratie laag cel dichtheid vergemakkelijkt de endothelial differentiatie van het CPCs. met behulp van twee verschillende subpopulaties van muis en rat CPCs, we laten zien dat laminin is een meer geschikt substraat dan fibronectine daartoe krachtens het volgende protocol: na het kweken voor 2-3 dagen in medium met inbegrip van de supplementen die multipotent handhaven en met 3,5% FBS, CPCs worden overgeënt op laminin op < 60% samenvloeiing en gekweekte in supplement-gratis medium met lage concentraties van FBS (0,1%) voor 20-24 uur voor differentiatie in endotheel differentiatie medium. Omdat het CPCs zijn een heterogene populatie, wellicht serum concentraties en incubatie tijden worden aangepast afhankelijk van de eigenschappen van de respectieve CPC subpopulatie. Gezien dit, de techniek kan worden toegepast op andere soorten CPCs ook en biedt een handige methode om te onderzoeken van het potentieel en de mechanismen van differentiatie en hoe ze worden beïnvloed door ziekte bij het gebruik van CPC's geïsoleerd van de respectieve ziekte modellen.

Muis SP-CPC-isolatie:
In deze studie gebruikten we muis CPCs geïsoleerd volgens de SP fenotype, overwegende dat de resultaten van rat CPCs zijn gewijzigd en toegevoegd van een vorig rapport met toestemming (Figuur 8)33.
Celproliferatie onder hoge en lage cel dichtheden en met verschillende Serum concentraties:
<p clas...

Dit protocol beschrijft een endothelial differentiatie techniek voor cardiale voorlopercellen. Het richt zich vooral op de invloed van serumconcentratie en cel-zaaien dichtheid op de endotheliale differentiatie mogelijkheden.

Inductie van Endothelial differentiatie in cardiale voorlopercellen onder lage Serum voorwaarden

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

Differentiatie van hartvererver cellen, of CPC's, bij versterking vereist een fase omschakeling van een prolifererende naar een geëngageerde fase, en dit protocol maakt gebruik van efficiënte endotheel afstamming in CPC's. Een groot voordeel van de techniek is dat deze van toepassing is op CPC's die geïsoleerd zijn op basis van verschillende technieken en van verschillende soorten. Dit protocol kan worden gebruikt om de therapeutische mogelijkheden van CPC's voor celtherapie te verbeteren.Het kan ook worden gebruikt om de mogelijkheden en mechanismen van differentiatie te onderzoeken en hoe deze worden beïnvloed door hartziekten. CPC's zijn een inhomogene populatie cellen die kunnen verschillen in vorm, grootte en potentie. Daarom moet het protocol worden aangepast aan de specifieke subpopulatie van gebruikte CPC's.Na het verdoven van de muis, veeg de borst met 70% ethanol. Snijd met een schaar de huid en de thoracale wand om de borstholte bloot te leggen. Gebruik tangen om het hart op te tillen, en gebruik vervolgens een schaar om het te snijden aan de basis.Breng het hart naar een P60 cultuur schotel met vijf milliliter koude PBS, en gebruik tangen om het hart te pompen en het bloed uit de holtes te werpen. Plaats het hart in een P60 schotel met vijf milliliter koude PBS en was het. Gebruik een kleine schaar om de atria te verwijderen, snijd het hart in twee stukken in de lengterichting en was ze in vijf milliliter ijskoude PBS.Met behulp van kleine schaar, snijd de hartstukken in kleinere secties. Voeg een druppel van een Hank's evenwichtige zoutoplossing met collagenase B op een concentratie van een milligram per milliliter, en gebruik een steriel scheermesje om de kleine stukjes hart grondig gehakt. Voeg vervolgens 2,5 milliliter van de collagenase B-oplossing toe aan de schotel.Plaats de schotel in een hoek van 30 graden in een couveuse op 37 graden Celsius. Laat de gehakte hartstukken maximaal 30 minuten uitbroeden terwijl u ze tijdens de incubatie herhaaldelijk door een Pasteur pipet passeert. Voeg eerst vijf milliliter koude HBSS toe, aangevuld met 2%FBS aan de gehakte en gehomogeniseerde hartstukken.Met behulp van een filter van 100 micrometer filtert u de hartstukken om onverteerd weefsel te verwijderen. Centrifuge op 470 keer G en bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en hang de pellet opnieuw op in vijf milliliter rode bloedcelbuffer.Broed op ijs gedurende vijf minuten met af en toe schudden. Voeg hierna 10 milliliter PBS toe en filter het monster door een filter van 40 micrometer om grotere cellen, waaronder restnocyten, uit te sluiten. Centrifuge op 470 keer G en bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten zonder de pauze.Dan, opnieuw schorsen van de cellen in DMEM aangevuld met 10%FBS, gericht op een definitieve celconcentratie van een miljoen cellen per milliliter. Verdeel de cellen in twee buizen voor het beitsen en sorteren, voeg 1,5 milliliter van de celoplossing toe aan één buis en 3,5 milliliter aan de tweede buis. Voeg Hoechst oplossing en incubeer op 37 graden Celsius gedurende 90 minuten met af en toe flippen om gelijke verdeling van de kleurstof te garanderen en stolling van de cellen te voorkomen.De zijbevolking verschijnt bij Hoechst lage lagere linkerhoek naast de belangrijkste bevolking. In de FACS plot kan worden geïdentificeerd op basis van de negatieve controle waarin verapamil vraagt de zijpopulatie te verdwijnen. Warm medium 1 tot 37 graden Celsius op en koel de centrifuge af tot vier graden Celsius.Centrifugeer de sorteerbuizen op 470 keer G en zes minuten bij vier graden Celsius. Stel de cellen vervolgens opnieuw op in middelbaar gebied. Breng de cellen over op een gas-permeabele P60 schotel met vier milliliter van medium een.Verander het medium om de drie dagen totdat de cellen een samenvloeiing tussen 70 en 80% Culture SP-CPC's hebben bereikt gedurende twee tot drie dagen in T75-kolven met behulp van acht milliliter medium in elke kolf. Spoel vervolgens voorzichtig het medium aan en spoel de kolf voorzichtig af met vijf milliliter warme HBSS. Behandel de cellen met vijf milliliter trypsine EDTA gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide.Voeg vervolgens vijf milliliter medium één toe om de trypsineactiviteit te stoppen en breng de celsuspensie over naar een buis van 15 milliliter. Centrifuge op 470 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens worden de cellen opnieuw onderbroken in medium één of medium twee.Plaat de cellen op P60 schotels, plating 250,000 SP-CPC's per schotel met drie milliliter medium met verschillende serumconcentraties. Na twee dagen van kweken, verzamel het medium van elk gerecht in een 15 milliliter buis om de dode cellen te verzamelen. Probeer de aanhangende cellen zoals eerder beschreven en verzamel de celsuspensie in de 15 milliliter buis die het verzamelde medium bevat.Centrifuge op 840 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, dan aspirate de supernatant en voeg een milliliter van een of medium een of medium twee voor cel tellen. Vlek de SP-CPC's met trypan blauw en tel de levensvatbare en dode cellen. Spoel eerst het medium aan uit de bereide cellen en spoel ze voorzichtig af met vijf milliliter warme HBSS.Behandel de cellen met vijf milliliter trypsine EDTA gedurende vijf minuten in de cel incubator. Voeg vervolgens vijf milliliter medium één toe om de trypsineactiviteit te stoppen. Breng de celsuspensie over op een buis van 15 milliliter en centrifuge op 470 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Aspirate de supernatant en voeg medium twee voor cel tellen. Vervolgens zaad 80,000 cellen in elke put van een pre-gecoate zes-put cultuur plaat met drie milliliter van medium twee. Houd de plaat op 37 graden Celsius gedurende 20 tot 24 uur, en verander het medium in elke put tot drie milliliter van medium drie.Kweek de plaat voor 21 dagen, het veranderen van het medium om de drie dagen. Vlek hierna de cellen met een endotheelmarkering en voer fluorescentiemicroscopie uit om de endotheelaard van de gedifferentieerde cellen te verifiëren. Spoel eerst het medium uit de voorbereide cellen aan en spoel ze voorzichtig af met vijf milliliter warme HBSS.Behandel de cellen met twee milliliter trypsine EDTA gedurende vijf minuten in de cel incubator, voeg vervolgens drie milliliter van medium drie om de trypsine activiteit te stoppen. Breng de celsuspensie over op een buis van 15 milliliter en centrifuge op 470 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Aspirate de supernatant en voeg een milliliter van medium drie, pipetting zachtjes te mengen.Tel de cellen en het zaad tussen 2.000 en 4.000 cellen in 100 microliter van medium drie tot elke matrix gecoat goed van een 96-put plaat. Broed de plaat 16 uur lang op 37 graden Celsius. Gebruik hierna twee keer een helderveldmicroscoop om een foto van de cellen te maken.In deze studie worden geschikte voorwaarden onderzocht voor het vergemakkelijken van endotheellijnengagement van hartvererverensysatorcellen. Wanneer de celvloeiing op of onder 60% is, wordt geen significant verschil gezien in de met 3,5% FBS behandelde monsters. Wanneer cellen op deze samenvloeiing worden behandeld met 0,1%FBS, vertonen ze een afname van celproliferatie op laminine in vergelijking met fibronectine, maar tonen geen toename van celdood.Cellen met een hoge samenloop vertonen daarentegen geen significant verschil in celproliferatie of celdood tussen de twee aandoeningen. Veranderingen in de celvorm lijken een indicator te zijn van geschikte kweekomstandigheden waarin endotheeldifferentiatie succesvol zal zijn. Binnen zeven tot 14 dagen in het endotheliale differentiatiemedium, worden de succesvolle culturen gezien om grotere cellen met verschillende morfologie te bevatten.Interessant is dat deze cellen verdwenen tegen het einde van de differentiatiefase en de neiging hadden om in lagere aantallen en op latere punten in culturen met een hoge dichtheid te verschijnen. Buisvorming is consequent succesvol in cellen verguld met een lage dichtheid en gedifferentieerd op laminine, terwijl het wordt gezien om meestal te mislukken in cellen verguld met een hoge dichtheid. Terwijl buisvorming meestal niet succesvol is in cellen gekweekt op fibronectine, ongeacht de celdichtheid, vormen die gedifferentieerd bij een lage dichtheid soms rudimentaire buizen.De serumconcentratie en celdichtheid om endotheliale afstamming te veroorzaken zijn cruciaal en moeten worden aangepast om vertraging van proliferatie te garanderen met behoud van de levensvatbaarheid. Bij inductie van afstamming kunnen CPC's van mensen of preklinische ziektemodellen worden gebruikt voor celtransplantatiestudies om hun in vivo differentiatiepotentieel te beoordelen. Dit protocol zou kunnen helpen bij het bestuderen of vestigen van nieuwe cardiale regeneratie tools, en het werd eerder gebruikt om moleculaire mechanisme van vroege afstamming inzet te bestuderen.

induction-endothelial-differentiation-cardiac-progenitor-cells-under

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We hebben een protocol voor de inductie van cardioblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke voorouders hart-en functionele cardiomyocyten voor hart-en reparatie mogelijk maakt.

Efficiënte Afleiding van de Mens Cardiac precursoren en cardiomyocyten uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

De huidige studie beschrijft een gerichte aanpak van differentiatie in het induceren van de alvleesklier differentiatie van humane embryonale stamcellen. Van grote betekenis is de bevinding dat endotheelcel co-cultuur bemiddelt rijping van menselijke embryonale stamcellen afkomstig van de pancreas voorlopercellen in insuline tot expressie brengen.

Endotheelcel Co-cultuur Bemiddelt Rijping van menselijke embryonale stamcellen te Pancreatic insuline producerende cellen in een Geregisseerd Differentiatie aanpak

Dit protocol beschrijft de efficiënte inductie van hemogene endotheel en multipotente hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen via de geforceerde expressie van transcriptiefactoren.

Direct Inductie van Hemogenic Endotheel en Bloed door overexpressie van transcriptiefactoren in menselijke pluripotente stamcellen

Dit manuscript beschrijft de creatie van gedefinieerde geëngineerde hartweefsels met behulp van uitdrukking van oppervlaktemarkers en celsortering. De gedefinieerde weefsels kunnen vervolgens worden gebruikt in een multi-weefsel bioreactor om mechanismen van hartceltherapie te onderzoeken om zo een functioneel, maar gecontroleerd, modelsysteem van het menselijk hart te bieden.

De bouw van Defined Human Engineered hartweefsel om te studeren Mechanismen van Cardiac Cell Therapy

Endotheliale voorlopercellen (EPC's) zijn cruciaal betrokken zijn bij de vorming van nieuwe bloedvaten van ischemische weefsels. Deze werkwijze beschrijft de isolatie van humane EPC uit perifeer bloed, maar ook de identificatie van het trekkende bieden tegen sera van patiënten die hartchirurgie ondergaan.

Isolatie van endotheliale cellen van gezonde vrijwilligers en hun trekkende Potential Beïnvloed door Serum monsters na Hartchirurgie

Het doel van dit protocol is te isoleren van endotheliale voorlopercellen van bloed van de navelstreng. Enkele van de toepassingen zijn het gebruik van deze cellen als een biomarker voor het identificeren van patiënten met cardiovasculaire risico, behandeling van ischemische ziekten, en creëren weefsel-engineered vasculaire en hart ventiel construeert.

Isolatie van endotheliale voorlopercellen van menselijke navelstrengbloed

Hier beschrijven we een schaalbare methode, met behulp van een eenvoudige combinatie van Activin A en lentivirus-gemedieerde Id1-overexpressie, voor het genereren van eerste hart veld-achtige cardiale progenitoren en ventriculaire-achtige cardiomyocytes van menselijke pluripotente stamcellen.

Generatie van eerste hart veld-achtige cardiale progenitoren en ventriculaire-achtige Cardiomyocytes van menselijke pluripotente stamcellen

Het doel van deze methode is het genereren van hartgebied-specifieke cardiale stamcellen in vitro om de stamvader cel specificatie en functionele eigenschappen te bestuderen, en het genereren van kamer specifieke cardiale cellen voor hart-en vaatziekten modellering.

In vitro generatie van muis Hartveld-specifieke hart voorlopercellen

Het huidige protocol genereert mesh-vormige ontworpen cardiale weefsels met cardiovasculaire cellen afkomstig van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen om het onderzoek van celimplantatietherapie voor hartziekten mogelijk te maken.

Voorbereiding van mesh-vormige ontworpen cardiale weefsels afgeleid van menselijke iPS cellen voor In Vivo Myocardial Repair

Hier wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd voor de gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen van menselijke pluripotente stamcellen in ongeveer 1 week.

Gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen uit menselijke pluripotente stamcellen

Leer een protocol voor endotheliale differentiatie van cardiale voorlopercellen met optimale serumconcentratie en cel-dichtheid. Deze methode ondersteunt onderzoek naar hartregeneratie en celtherapie.

Inductie van Endothelial differentiatie in cardiale voorlopercellen onder lage Serum voorwaarden

Meer video's verkennen