Detectie van 3-Nitrotyrosine in de atmosferische omgeving via een High-performance Liquid Chromatography-elektrochemische Detector systeem
30 januari 2019
Presenteren we een methode voor het detecteren van 3-nitrotyrosine chemische wijzigingen van atmosferische eiwitten met 6 mm diameter rondes gesneden uit lucht sampler voorfilters met behulp van een krachtige vloeibare chromatografie-elektrochemische detector (HPLC-ECD).
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in milieu-onderzoek over Nitrapyrin en 3-nitrotyrosine. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een unieke en zeer gevoelige methode is voor het detecteren van 3-nitrotyrosine op luchtmonsterfilters. Om totale zwevende deeltjes of deeltjes van minder dan zeven micron groot te verzamelen, weegt u eerst een binder 3 kwartsfilter en bevestigt u het op een luchtmonsternemer met een hoog volume. Bedek het filter met een deeltjesgroottekiezer om PM7 te verzamelen of laat het filter onbedekt om de totale zwevende deeltjes te verzamelen. Voer de luchtmonsternemer zeven dagen lang continu uit op 1000 liter per minuut. Laad de voorfilters in een classificatie-eenheid voor grootte en installeer de grootteclassificatie-eenheid en een back-upfilter op de luchtmonsternemer met een laag volume. Voer de luchtmonsterer zeven dagen lang continu op 116 nesten per minuut om PM2.5 op het back-upfilter te verzamelen. Wanneer de bemonstering is voltooid, wordt het totale stroomvolume geregistreerd. Weeg het filter af en bereken het gewicht van de verzamelde deeltjes. Verzegel het filter in een plastic zak en bewaar het op 30 graden Celsius.Vervolgens bereiden 500 microliters van 6X niet-specifieke protease cocktail en acetaat buffer en plaats het in een dalasis membraan met een moleculair gewicht cutoff van 5000 daltons. Dompel het gevulde membraan onder in 1 L van de acetaatbuffer en roer het 24 tot 36 uur op 4 graden Celsius en vervang de buffer elke 12 uur om ondogend 3-Nitrotyrosine en Nitrite te verwijderen.Meet vervolgens de eiwitconcentratie in de gedialyseerde proteaseoplossing met een bicinononinic zuur-eiwittest. Verwijder daarna een filter uit de vriezer en laat het opwarmen tot kamertemperatuur terwijl het nog steeds in de zak wordt verzegeld. Sla vervolgens tot vijf 6 millimeter brede cirkels uit het overdekte deel van het filter en plaats de cirkels in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Bereid 300 microliter acetaatbuffer voor met 50
Overzicht
Dit artikel presenteert een zeer gevoelige methode voor het detecteren van 3-nitrotyrosine-modificaties in atmosferische eiwitten met behulp van voorfilters van luchtsamplers. De techniek maakt gebruik van hogedrukvloeistofchromatografie met een elektrochemische detector (HPLC-ECD) om de verzamelde monsters te analyseren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Milieuonderzoek
- Analytische chemie
- Atmosferische wetenschappen
Achtergrond
- 3-nitrotyrosine is een marker voor oxidatieve stress en milieuvervuilende stoffen.
- Het detecteren van deze modificatie kan inzicht bieden in de luchtkwaliteit en de effecten op de gezondheid.
- Huidige methoden kunnen tekortschieten in gevoeligheid of specificiteit voor atmosferische monsters.
- Deze studie heeft tot doel de detectietechnieken te verbeteren voor een betere milieumonitoring.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een gevoelige methode voor het detecteren van 3-nitrotyrosine in luchtmonsters.
- Het verbeteren van het begrip van atmosferische eiwitmodificaties.
- Bijdragen aan milieuonderzoek naar verontreinigende stoffen zoals Nitrapyrin.
Gebruikte methoden
- Verzameling van luchtmonsters met behulp van high-volume luchtmonsterszamelaars.
- Gebruik van kwartzfilters voor het opvangen van fijnstof.
- Dialyse van monsters om interfererende stoffen te verwijderen.
- Meting van de proteïneconcentratie met behulp van een bicinchonininezuur-assay.
Belangrijkste resultaten
- De methode detecteert 3-nitrotyrosine succesvol met een hoge gevoeligheid.
- De resultaten wijzen op significante hoeveelheden 3-nitrotyrosine in atmosferische monsters.
- De techniek is reproduceerbaar en betrouwbaar voor milieumonitoring.
- De bevindingen ondersteunen verder onderzoek naar de effecten van luchtvervuiling.
Conclusies
- Deze methode biedt een waardevol instrument voor milieuonderzoekers.
- Het kan helpen bij het beoordelen van de impact van luchtkwaliteit op de gezondheid.
- Toekomstige studies kunnen verder ingaan op de implicaties van de detectie van 3-nitrotyrosine.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Deze methode maakt gevoelige detectie mogelijk van 3-nitrotyrosine, een biomarker voor oxidatieve eiwitschade, in atmosferisch fijnstof. Het ondersteunt onderzoek naar milieugezondheid door luchtkwaliteit te koppelen aan moleculaire biomarkers voor ontsteking en allergeen potentieel. De assay biedt kwantitatieve gegevens die nuttig zijn voor mechanische risicoanalyse in pulmonale en immunotoxicologische studies.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om oxidatieve stresspaden te onderzoeken in modellen die zijn blootgesteld aan bio-aerosolen.
- Operationele waarde: Biedt een biomarker-uitlezing voor eiwitnitrering in complexe milieu-mengsels.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve, op HPLC-ECD gebaseerde meting van 3-NT met een gevoeligheid van pg/m3.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van gestandaardiseerde filterpons en proteasevertering voor reproduceerbare monstervoorbereiding.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppelt blootstelling aan omgevings-PM aan detecteerbare eiwitmodificatie in longrelevante modellen.
- Operationele waarde: Ondersteunt cross-studievergelijking van de oxidatieve belasting over verschillende fracties van partikelgroottes.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen vroege discovery-workflows waarbij omgevingsfactoren worden geëvalueerd op hun mechanistische relevantie voor respiratoire of immuunroutes.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten met betrekking tot ozon- en NO2-gedreven proteinnitratie in longweefselmodellen.
- Screening: Maakt assay-klare monsters mogelijk uit filters waarin PM2.5 is opgevangen voor biomarker-screening.
- Analytiek: Biedt chromatografische scheiding en elektrochemische detectie voor specifieke 3-NT-kwantificatie.
- Translationeel onderzoek: Verbindt gegevens over atmosferische blootstelling aan moleculaire initierende gebeurtenissen in oxidatieve stresspaden.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Het HPLC-ECD-platform kan worden aangepast voor andere post-translationele modificaties in milieu-monsters.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Mechanistische risicoreductie via door biomarkers ondersteunde causale verbanden tussen luchtvervuilende stoffen en eiwitschade.
- Operationele waarde: De hoge gevoeligheid (1,13 pg/m3) maakt detectie mogelijk in milieu monsters met een lage concentratie.
- Strategische waarde: Informeert de risicobeoordeling door een specifieke oxidatieve modificatie in complexe mengsels te kwantificeren.
- Impact op portfolio: Ondersteunt go/no-go-beslissingen in programma's die zich richten op aan vervuiling gerelateerde respiratoire pathologieën.
Overwegingen voor implementatie
- Expertise in proteïnelyse, dialyse en de bediening van HPLC-ECD.
- Toegang tot luchtmonstersystemen voor lage volumes, grootteclassificatoren en systemen voor proteasedigestie.
- Standaardisatie van de filterponsmaat, buffercondities en dialyseduur.
- Aanpassingen voor verschillende groottes van fijnstof en diverse proteïnelasten.
- Praktische beperking: vereist verwijdering van endogeen 3-NT en nitriet via verlengde dialyse.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Title
0:28
Collection and Hydrolysis of Proteins in Particulate Matter (PM)
3:59
Determination of 3-Nitrotyrosine (3-NT) Content via a High-Performance Liquid Chromatography and Electrochemical Detection (HPLC-ECD) System
6:06
Results: Detection of 3-NT in PM2.5, PM7, and Total Suspended Particle (TSP) Samples Using HPLC-ECD
7:19
Conclusion
