Isolatie van fysiologisch actief thylakoiden en hun gebruik in energie-afhankelijke proteïne vervoer Assays

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen met betrekking tot de mechanismen en energetische stoffen van eiwittransport over chloroplast membranen, evenals de locatie van eiwitten binnen plastiden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek voor thylakoïde eiwittargeting is dat het volledige controle over de omgeving van de thylakoïde tijdens het transport mogelijk maakt, inclusief temperatuur, pH, ionische omstandigheden en precursorconcentraties. Begin met het weken van ongeveer 55 gram erwten in 400 milliliter gedestilleerd water gedurende drie uur.

Zaai de geweekte erwten in een plastic bak in de grond, bedekt met een dun laagje vermiculiet, en groeien gedurende negen tot 15 dagen zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereid op de dag van de chloroplast-isolatie een continu dichtheidsgradiënt voor door een mengsel van 15 milliliter Percoll en 15 milliliter 2xGB buffer in een 15 milliliter polycarbonaat hoge snelheid centrifuge buis te centrifugeren bij 30, 900 gs in een vaste rotorhoek gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius met de rem uit. Oogst dan ongeveer 25 gram van negen tot 15 dagen oude erwt scheuten.

Voeg ze toe aan 95 milliliter koude 1xGB buffer in een gekoelde blender, met geslepen messen. En homogeniseren. Filtreer dit mengsel door minimaal twee lagen kaasdoek, geplaatst in een trechter over een gekoeld bekerglas.

Centrifugeer het filtraat met behulp van een 15 milliliter polycarbonaatcentrifugebuis in een swingende emmerrotor op 3.000 gs gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg en gebruik een penseel om de pellet voorzichtig opnieuw op te hoogten in één milliliter van 1xGB. Gebruik daarna een glazen houding pipet om de schermophanging voorzichtig op de top van de Percoll-helling te leggen.

Centrifuge het in een swingende emmer rotor op 8,000 gs gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius met de rem uit. Met behulp van een houding pipet opnieuw zorgvuldig overbrengen van de onderste groene band met intacte chloroplasten in een verse 50 milliliter polycarbonaat buis en voeg 30 milliliter van 1xIB buffer. Centrifuge de buis in een swingende emmerrotor op 1, 800 gs gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Na het weggooien van de supernatant, voorzichtig resuspend de pellet in een milliliter van 1xIB met een penseel. Was in 30 milliliter 1xIB en centrifuge opnieuw onder dezelfde omstandigheden. Resuspend de pellet na de laatste centrifugatie in een milliliter van 1xIB.

Om de chlorofylconcentratie te bepalen, meng 10 microliter volledig geresuspendedchloroplasten met vijf milliliter van 80%-aceton. Filtreer door een 180 micrometer dik filterpapier met 11 micrometer poriegrootte en bepaal vervolgens de chlorofylconcentratie met spectrofotometer. Verdun het chloroplastmengsel tot één milligram per milliliter met koude 1xIB.

Om te beginnen met het isoleren van de thylakoïden wanneer stromal extract niet nodig is, zoals cpTat transport, centrifuge intacte chloroplasten in 1,5 milliliter buizen in een swingende emmer rotor op 1, 000 gs bij vier graden Celsius gedurende zes minuten. Daarna, gooi de supernatant en resuspend de pellet in hypotonische lyse buffer om een milligram per milliliter te bereiken met een micropipet. Incubeer op ijs in het donker met af en toe mengen gedurende 10 minuten.

Om thylokoïden terug te krijgen, centrifuge in een swingende emmerrotor op 3, 200 gs bij vier graden Celsius gedurende acht minuten. Was de thylokoïden twee maal door de pellet opnieuw uit te stellen met één tot twee milliliter lysisbuffer en vervolgens onder dezelfde omstandigheden te centrifugeren. Na de laatste centrifugatie, resuspend de pellet, in een milliliter van 1xIB buffer en bepalen van de chlorofyl concentratie in geïsoleerde thylokoïden met behulp van een spectrofotometer zoals eerder aangetoond.

Voor trajecten die stromale extractterugwinning vereisen, zoals CPSec1 en CPSRP, 600 microliter van geïsoleerde chloroplasten in een swingende emmerrotor en centrifuge op 1.000 gs gedurende zes minuten bij vier graden Celsius. Voor chloroplast lyse schorten we de pellet op met 600 microliters hypotonische lysebuffer. Incubeer op ijs in het donker gedurende 10 minuten met af en toe mengen.

Dan centrifugeren de buizen in een swingende emmer rotor op 3, 200 gs gedurende acht minuten op vier graden Celsius. Om de stroma te redden, breng het lichtgroen naar gele supernatant naar een nieuwe micro centrifuge buis en voeg een gelijk volume van 2x ruwe stromal buffer. Om thylokoïden te wassen, voeg twee volumes lysebuffer en centrifuge toe op 3, 200 gs gedurende acht minuten bij vier graden Celsius.

Resuspend de pellet in 1xIB om chlorofyl concentratie van een milligram per milliliter te bereiken en gereserveerd op ijs voor later gebruik in het vervoer testen. Verwijder restmembranen uit ruwe stroma door de verdunde ruwe stroma in een vaste hoekrotor van 42.000 gs gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius te centrifugeren. Verzamel vervolgens 95% van het volume van elke buis om ervoor te zorgen dat de kleine geelgroene pellet niet wordt verstoord, terwijl het volume van elke buis wordt opgevangen.

Om het geconcentreerde stromale extract voor te bereiden, pool de verzamelde supernatants. Gebruik vervolgens een vier milliliter 30 kilodalton moleculair gewicht cut-off concentrator om het extract vijf keer te concentreren. Om te testen het cpTat-transport in een buis van 1,5 milliliter op ijs meng de geïsoleerde thylokoïden tot een uiteindelijke chlorofylconcentratie van 0,33 milligram per milliliter, vijf millimolar ATP bereid in 1xIB en acht millimolar DTT bereid in 1xIB.

Om het transport te starten, introduceert u substraateiwit in de transportmix. Voer de reactie door het verlichten van de schorsing met 80 tot 100 microeinsteins per vierkante meter per seconde van fotosynthetisch actieve straling gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Om de transportreactie te stoppen, verdun de vering acht maal met ijskoude 1xIB.

Centrifuge bij 3, 200 gs in een microcentrifuge gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius om thylokoïden te herstellen. Na het weggooien van de supernatant, resuspend de pellet in 120 microliters van ijskoud 1xIB. Om te testen de CPSec1 of PSRP trajecten mengen de volgende in een 1,5 milliliter buis op ijs.

Thylakoïden tot een uiteindelijke chlorofylconcentratie van 0,33 milligram per milliliter, 0,83 milligram per milliliter chlorofylequivalenten van stromal extract en vijf millimolar ATP bereid in 1xIBx. Breng de reactie tot het gewenste volume met ijskoude 1xIB en broed gedurende 10 minuten op het ijs. Om het transport te starten introduceert u 10% volume aan substraateiwit in deze transportmix.

Verlicht met 80 tot 100 microeinsteins per vierkante meter per seconde van fotosynthetisch actieve straling gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Om de reactie te stoppen, verdun de vering acht keer met ijskoude 1xIB. Centrifuge op 3, 200gs in een microcentrifuge gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Na het weggooien van de supernatant, resuspend de pellet in 120 microliters van ijskoud 1xIB. Om restsubstraat te verwijderen dat niet is vervoerd, verteer je uitwendige eiwitten door zes microliter van twee milligram per milliliter thermolysine en 10 millimolar calciumchloride in 1xIB toe te voegen. Broed deze protease reactie op ijs gedurende 40 minuten.

Blus de protease door het volume te verdubbelen met 25 millimolar EDTA in 1xIB. Centrifuge bij 3, 200 gs in een microcentrifuge gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius om thylokoïden te herstellen. Na het verwijderen van de supernatant, resuspend herstelde thylokoïden in 120 microliter van vijf milimolar EDTA in 1xIB, en over te dragen aan een nieuwe 1,5 milliliter buis.

Na het centrifugeren opnieuw bij 3, 200 gs in een microcentrifuge gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius, gooi je de supernatant weg en verleg je de pellet in een passend volume laemmli monsterbuffer, aangevuld met 10 millimolar EDTA. Plaats de monsters 10 minuten in een kokend waterbad. Ga verder met het analyseren van de monsters op SDS-pagina.

Transport van iOE17 eiwit via de cpTat route resulteerde in een grootte verschuiving van twee tot drie kilodaltons tussen het geïntroduceerde substraat en de volwassen verwerkte vorm. Dit is te wijten aan decolleté van het n terminal signaal peptide wat wijst op een succesvolle cpTat transport. Thermolysine behandeling laat alleen de met succes vervoerde en dus proteus resistente volwassen band.

Transport van OE33 voorloper via de CPSec1 route, resulteerde in een grootte verschuiving in de volwassen substraat, en proteus bescherming van het getransporteerde substraat. Het inbrengen van LHCP-precursor in het thylokoïde membraan via het cpSRP-traject, geëvalueerd door thermolysin spijsvertering, leidde tot een grootteverschuiving van 1,5 tot twee kilodaltonen. Dit duidde op succesvolle membraaninbrengen, omdat het membraan de ooms van volwassen LHCP afbraakproduct beschermt tegen volledige proteolyse.

Na het bekijken van deze video moet je een goed begrip van hoe thylokoids te isoleren en test tranportiviteit door de energie afhankelijke cpTat, cpSec 1 en cpSRP trajecten. Eenmaal onder de knie deze techniek kan worden gedaan in drie tot vier uur wanneer goed uitgevoerd. Hoewel niet geïllustreerd in deze video houden we over het algemeen de overhead lichten uit in het lab bij het isoleren en werken met fotosynthetisch actieve chloroplasten en thylakoïden.

Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om geïsoleerde chloroplast en thylakoïden te houden op vier graden Celsius. Vergeet niet om chloroplasten voorzichtig te resuspend in het begin. Vermijd het verstoren van de Procoll gradiënt na de eerste centrifucation stap.

Bovendien kan procent invoermonster parallel met de transportreacties worden bereid en op dezelfde gel worden uitgevoerd om het substraattransport te schatten. Vergeet niet, dat het werken met radioactieve substraten vereist gewetensvolle behandeling en een goede PPE. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van eiwittargeting om de energetica, kinetiek en unieke mechanismen voor eiwittransport over thylakoïde membranen te verkennen.