Name: Afleidbare en omkeerbare Dominant-negatief (DN) eiwit remming (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Leer een afleidbaar en omkeerbaar dominant-negatief systeem voor voorwaardelijke eiwitinactivering met behulp van NIH3T3-cellen. Deze methode behoudt residuale endogene expressie en is toepasbaar op zowel multimerische als monomerische eiwitten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De pCS2 + CB-Myc6 vector was een geschenk van Marshall Horwitz (Universiteit van Washington, Seattle, WA, Verenigde Staten). De HEI-OC1 cellen werden beschikbaar gesteld door Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, USA). Technische ondersteuning werd verstrekt door de UNMC muis genoom Engineering kern (C.B. Gurumurthy, Don Harms, Rolen Quadros) en de Creighton University geïntegreerde Biomedical Imaging faciliteit (Richard Hallworth, John Billheimer). De UNMC Mouse genoom Engineering werd ondersteund door een institutioneel Development Award (idee) van de NIH/NIGMS, verlenen nummer P20 GM103471. De geïntegreerde Biomedical Imaging faciliteit werd gesteund door de Creighton University School of Medicine en subsidies, GM103427 en GM110768 van de NIH/NIGMS. De faciliteit is gebouwd met steun van subsidies uit het National Center for onderzoeksmiddelen (RR016469) en de NIGMS (GM103427). De lijnen van de muis gegenereerd in deze studie werden onderhouden bij Creighton University's dier Resource faciliteit, waarvan infrastructuur werd verbeterd door middel van een subsidie door de NIH/NCRR G20RR024001. Dit werk ontvangen verleden ondersteuning via een NIH/NCRR 5P20RR018788-/ NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE toekennen (Shelley D. Smith), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-S.) en een opkomende subsidie van het onderzoek van de Hearing Health Foundation (naar S. Tarang). De inhoud van dit onderzoek is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Generatie van de transgene CBRb muis en alle dierenverzorgers en experimenten die is gekoppeld aan de studie werden goedgekeurd door de Creighton University dier zorginstellingen en gebruik Comité (IACUC) en uitgevoerd door hun richtlijnen.
1. transgene CB-Myc6-Rb1 Construct
Opmerking: Het klonen van CBRb in een vector pTet_Splice werd gedaan in een proces van meerdere stappen (figuur 1A en 1B).
<ol><li>
Voeren de eerste fase klonen in de pCS2 + CB-Myc6 vector.
	<ol>
<li>Maken van de constructie van de transgenic CBRb, een 1583-bp-long Rb1 cDNA fragment (528 aminozuren overeenkomt met de aminozuur-regio 369-896) versterken van het eiwit van de RB1 met behulp van de volgende primer instellen: gebruik voor EcoRI +RB 1243F, GGGGAATTCA TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTC, en XbaI + EcoRV +RB 2826R, gebruik CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCC.</li>
		<li>Kloon het fragment gegenereerd (1546 bp) tussen de EcoR1 en XbaI sites van de beperking van de pCS2 + CB-Myc6 vector als eerder beschreven1,12. Opmerking: De 1012-bp-long CB-Myc6 constructie (337 aminozuren) gesmolten naar het fragment Rb1 resulteerde in een proteïne van ongeveer 865 aminozuren (ongeveer 108 kDa), die iets kleiner is dan de endogene RB1 proteïne (~ 110 kDa) (Figuur 1 Een), met een CB-Myc6 tag op de N-terminus en Rb1 in het C-terminus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
De tweede fase subcloning in de pTet-Splice vector uitvoeren
	<ol>
<li>Om de CB-RB-Myc6 fusion fragment te vergroten en zo de Tet-promotor, versterken de cassette, bestaande uit de CB-myc6-Rb1 gebruikend inleidingen met de EcoRV (XbaI + EcoRV + RB 2826R) en SalI sites: voor SalI +CBF, gebruik CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTC.</li>
		<li>Subclone het fragment gegenereerd (2567 bp) in de pTet-Splice vector, tussen de beperkingsplaatsen SalI en EcoRV , zodanig dat de gehele TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenic, met inbegrip van de SV40 intron en de PolyA signaal, kunnen worden geïsoleerd door middel van een enkele spijsvertering met kennisgevingen (Figuur 1B). Opmerking: De kennisgevingen fragment werd gebruikt voor het genereren van de transgene financiers.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. in Vitro testen van de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenic
<ol><li>
Dox-verordening: NIH3T3 cellijn Opmerking: Tenzij anders vermeld, zijn alle volumes voor een 6-well-plaat aangepast.<ol>
<li>Het groeien van cellen van de NIH3T3 van de leverancier specificaties, met behulp van de aanbevolen cel voedingsbodems met 10% foetale runderserum bij 37 ° C met 10% CO2na.</li>
		<li>De cellen met pTet-Splice cotransfect en pCMV-Tet3G-vectoren (uit stap 1) voor 24 h. de stappen hieronder vermelde voor cotransfection.<ol>
<li>Meng 2 – 4 µL van de lipide gebaseerde transfectie reagens/put en 1 mL van onvolledig (zonder serum) Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik van 250 of 500 µL van voedingsbodems, respectievelijk voor een 12 - of 24-well plaat, en de volume van de reagens van de transfectie dienovereenkomstig aanpassen.</li>
			<li>2 – 3 µg plasmide DNA/putje toevoegen aan de transfectie reagens-DMEM en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.</li>
			<li>Voeg de mix met DNA en het transfectiereagens in DMEM aan elk putje. Na 3-4 uur incubatie, voeg 1 mL volledige media (zodat het eindvolume 2 mL per putje is). Houd aliquots van Dox voorraad (1 mg/mL) en voeg 2 µL in elk van de putten (+ Dox). Incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% CO2. Opmerking: Controlemonsters moeten bestaan uit cotransfected cellen niet behandeld met Dox (-Dox), evenals NIH3T3 cellen transfected alleen met de transactivator pCMV-Tet3G-vector en gedurende een periode van 24 uur behandeld met Dox. Voor pCMV-Tet3G, concentraties van 0,1-1 µg/mL Dox zou voldoende moeten zijn voor het opwekken van de transgenic expressie.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Test de omkeerbaarheid van de constructie die met behulp van de cellijn van HEK293.
	<ol>
<li>Om te testen de omkeerbaarheid van de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenic, cultuur HEK293 cellen in Eagle's Minimum essentiële Medium (EMEM) na specificaties van de leverancier en cotransfect met pTet-Splice én pCMV-Tet3G vectoren voor 24u, zoals beschreven boven (stap 2.1.2).</li>
		<li>Voor de inactivering van transgenic, verwijder het medium van Dox-bevattende na 24 h en wassen van de cellen 2 x-3 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) broeden ze in Dox-vrije media voor een aanvullende 24 h. Opmerking: Na Dox-verwijdering, moeten de transgenic inactivering en regelmatige eiwit expressie binnen die periode van 24 uur worden hervat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Uitvoeren om te beoordelen van de functionaliteit van de constructie van de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 biij ongeplande celproliferatie, de functionele analyses met behulp van een cellijn HEI-OC1, zoals hieronder beschreven.
	<ol>
<li>Cultuur HEI-OC1 cellen in 10% DMEM onder tolerante omstandigheden (33 ° C met 10% CO2). Voor cel proliferatie studies, met behulp van een cel teller en plaat 10.000 HEI-OC1 cellen op een 96-wells-plaat in een volume van 200 µL cellen te tellen. Incubeer de cellen 's nachts.</li>
		<li>Voer op de volgende dag, een voorbijgaande cotransfection van pTet-Splice en pCMV-Tet3G vectoren met behulp van een lipide gebaseerde transfectiereagens (Zie stappen 2.1.2). In een aparte goed, pmR-ZsGreen1 transfectie at2-µg met behulp van het lipide gebaseerde transfectiereagens (stappen 2.1.2) voor het berekenen van het tarief van de transfectie worden uitgevoerd. Niet-transfected cellen als besturingselementen gebruiken.</li>
		<li>Detecteren van de aanwezigheid van groene fluorescentie onder een fluorescentie Microscoop (excitatie = 485 nm, emissie = 530 nm) voor de transfected cellen 24u na transfectie. Neem de aanwezigheid of afwezigheid van groene fluorescentie en bereken het percentage van de transfectie als het totale aantal GFP-positieve cellen (transfected cellen) over de cellen die zijn gemarkeerd met de DAPI (totaal aantal cellen). Opmerking: Wij een tarief van de transfectie van ~ 70% geschat.</li>
		<li>Om te induceren transgenic expressie, 1 µg/mL Dox aan een subset van transfected cellen toevoegen tijdens het gebruik van de andere subset als besturingselement (-Dox). Onbehandelde HEI-OC1 cellen worden gebruikt als extra besturingselementen.</li>
		<li>Om te beoordelen celproliferatie, door een cel proliferatie kit volgens protocol van de fabrikant te gebruiken.<ol>
<li>Kortom, 48 h na transfectie, verwijder het kweekmedium cel en voeg 100 µL van 1 x kleurstof-bindoplossing aan elk putje van de microplate. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.</li>
			<li>Daarna meet de intensiteit van de fluorescentie van elk monster met behulp van een fluorescentie microplate reader (excitatie = 485 nm, emissie = 530 nm).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verder beoordelen celproliferatie met immunocytochemie, de cellen van de HEI-OC1 op een glas van de cover in een 12-well plaat plaat en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.<ol>
<li>De volgende dag, cotransfect met de pTet-Splice en pCMV-Tet3G en het uitvoeren van de behandeling van Dox (+ Dox). Untransfected cellen als besturingselementen gebruiken. Proces HEI-OC1 cellen voor het labelen van Ki-67.</li>
			<li>Het herstellen van de cellen met de 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS, pH 7.4, gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Wassen van de cellen 3 x met ijskoude PBS en Incubeer de cellen in de niet-ionogene wasmiddel van de 0,25% in PBS gedurende 10 minuten.</li>
			<li>Wassen van de cellen opnieuw, 3 x in PBS voor 5 min, en blok 10% serum met een bevochtigde kamer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
			<li>Incubeer de cellen in 500 µL van Ki-67 primair antilichaam (1:200 verdunning) gedurende 3 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.</li>
			<li>Wassen van de cellen 3 x voor 5 min met PBS. Incubeer de cellen met het secundaire antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker na dat.</li>
			<li>Verwijder de secundair antilichaam-oplossing en wassen van de cellen 3 x met PBS voor 5 minuten, elk in het donker.</li>
			<li>Incubeer de cellen van de HEI-OC1 in 1:200 phalloidin voor 30 min voor phalloidin labeling. Als u het label van de kernen van cellen, Incubeer de cellen met 5 µg/mL DAPI gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Opmerking: Zorg ervoor dat de geconjugeerde van de kleurstof phalloidin anders dan de geconjugeerde van secundair antilichaam is.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. productie van CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb) transgene muizen en In Vivo tests van de DN-CBRb-aanpak
<ol><li>Na bevestiging wordt door de effectieve Dox regulering van de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenic zuiveren het fragment van de kennisgevingen en microinject hen in muis zygoten, die later naar pseudo-zwangere vrouwen overgebracht worden. Opmerking: Deze procedures werden uitgevoerd bij de Universiteit van Nebraska Medical Center (UNMC) muis genoom Engineering Core faciliteit.</li>
	<li>Na de levering, de pups met behulp van een primer specifieke regio ingesteld op de CB-Rb1 fusion genotype: CBRb F, 5' CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG 3 ' gebruiken, en voor CBRB R, gebruiken voor 3 5 ' GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC '. Opmerking: De grootte van het PCR product waargenomen op agarose gel is 401 bp (60-bp CB regio + 341-bp Rb1 regio (tabel 1). Tien onafhankelijke oprichter regels werden vastgesteld, gebaseerd op de aanwezigheid van de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenic. In vijf van deze lijnen erfde nakomelingen de transgenic, die de overdracht van de kiemcellen van de transgenic bevestigd. Een van de transgene lijnen werd uiteindelijk gebruikt voor het vaststellen en handhaven van de lijn en genereren van proefdieren TetO-DN-CB-myc6-Rb1 voor verdere studies.</li>
	<li>Volwassen TetO-DN-CB-myc6-Rb1 muizen naar de ROSA-CAG-rtTA tetracycline inductor regel (voorraad #006965) (als alternatief, breed aan een tTA inductor lijn) voor het genereren van experimentele DN-CBRb muizen fokken. Genotype van de nakomelingen van dit kruis met behulp van de volgende set van de primer: gebruik voor rtTA-WT R, GGAGCGGGAGAAATGGATATG; gebruik voor rtTA Mutant R, GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC; en voor rtTA Common, gebruik AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT. De PCR product maten zijn 340 bp (mutant), 340 bp en 650 bp (heterozygote) en 650 bp (wild-type).</li>
	<li>Een dosis-responscurve van het eiwit van de RB1 na de Dox behandeling om de tijd en de duur van de Dox behandeling nodig te verduidelijken met een transgenic-expressie te genereren. Opmerking: In dit experiment, werden westelijke vlek en qRT-PCR gebruikt om weefsel-specifieke transgenic activering en RB1 expressie te evalueren.</li>
	<li>Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) te bevestigen de genomic invoeging van de transgenic uitvoeren Opmerking: Dit werd uitgevoerd op het centrum voor toegepast genomica van het ziekenhuis voor zieke kinderen (Toronto, Canada). ELISA of het westelijke bevlekken (met eiwit-specifieke antilichaam) kan worden gebruikt ter beoordeling van transgenic activering, weefsel-specificiteit en veranderingen in de niveaus van de endogene POI. Voor de constructie van de DN-CB-myc6-Rb1 gebruikten we een anti-RB1 antilichaam.</li>
</ol>

<ol><li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+MyoD+homodimer+formation+demonstrated+by+a+general+method+of+dominant+negative+mutation+employing+fusion+with+a+lysosomal+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease.</a> Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).</li>
<li>Tarang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+retinoblastoma+%28rb%291-inducible+dominant-negative+%28DN%29+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model.</a> Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).</li>
<li>Kominami, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+selective+role+of+cathepsins+B+and+D+in+the+lysosomal+degradation+of+endogenous+and+exogenous+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins.</a> FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).</li>
<li>Cortellino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+ciliogenesis%2C+embryonic+lethality+and+severe+impairment+of+the+sonic+hedgehog+pathway+caused+by+inactivation+of+the+mouse+complex+A+intraflagellar+transport+gene+Ift122%2FWdr10%2C+partially+overlapping+with+the+DNA+repair+gene+Med1%2FMbd4%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4.</a> Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).</li>
<li>Ferreira, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+embryonic+lethality+of+H+ferritin+gene+deletion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).</li>
<li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+deficient+for+rb+are+nonviable+and+show+defects+in+neurogenesis+and+haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis.</a> Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).</li>
<li>Turlo, K. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20813881">When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss.</a> Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).</li>
<li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15190215">The first knockout mouse model of retinoblastoma.</a> Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletions+of+retinoblastoma+1+%28Rb1%29+and+its+repressing+target+S+phase+kinase-associated+protein+2+%28Skp2%29+are+synthetic+lethal+in+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).</li>
<li>Yamasaki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+E2F-1+reduces+tumorigenesis+and+extends+the+lifespan+of+Rb1%28%2B%2F-%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice.</a> Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).</li>
<li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+a+dominant+negative+retinoblastoma+protein+%28RB%29+inhibiting+satellite+myoblast+differentiation+implies+an+indirect+interaction+between+MyoD+and+RB%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).</li>
<li>Pitkanen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+human+retinoblastoma+gene+product+in+mouse+fibroblasts%3A+Effects+on+cell+proliferation+and+susceptibility+to+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation.</a> Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).</li>
<li>Chano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+abundance+of+RB1CC1+contributes+to+the+non-proliferating+enlarged+cell+phenotype+through+both+RB1+maintenance+and+TSC1+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).</li>
<li>Kole, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+therapeutics%3A+Beyond+RNA+interference+and+antisense+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).</li>
<li>Yamamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ons+and+offs+of+inducible+transgenic+technology%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The ons and offs of inducible transgenic technology: A review.</a> Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).</li>
<li>Houdebine, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+animal+models+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transgenic animal models in biomedical research.</a> Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).</li>
<li>Brehm, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoblastoma+protein+recruits+histone+deacetylase+to+repress+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription.</a> Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E2F-HDAC+complexes+negatively+regulate+the+tumor+suppressor+gene+ARHI+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer.</a> Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).</li>
<li>Magnaghi-Jaulin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoblastoma+protein+represses+transcription+by+recruiting+a+histone+deacetylase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase.</a> Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Wij willen om te omzeilen van de beperkingen die zijn gekoppeld aan de traditionele transgene strategieën, genereren een muismodel waarin een endogene POI kan voorwaardelijk worden geïnactiveerd door overexpressing een DN gemuteerde vorm van het Spatio wijze. Afschaffing van de functie van endogene POI's, zijn verschillende opties voorgestelde15,16,17. We hebben een eerdere genetische strategie1 bewerkt d...

Meeste benaderingen die gericht zijn op de gen- en eiwit ablations is afhankelijk van permanente processen, die over het algemeen tot de volledige uitbanning of afkappen van het gen, RNA opeenvolgingen of proteïne van belang (POI leiden). Het algemene doel van deze methode is om ingenieur een recombinant eiwit te schaffen van de functie van endogene, wild-type eiwit. Wij hebben revisited en vernieuwde een alternatieve strategie1,2, dat voorziet in de tijdelijke ablatie van een POI via DN remming. Deze methode werkt voor zowel multimeric als monomeer peptiden, maar is het meest geschikt voor de eiwitten die in een vergadering van de multimeric functioneren.
De methode bestaat uit het smelten van de lysosomale protease CB aan een subeenheid van een multimeric POI (CB smelting complexe). De resulterende CB fusie complexe kan communiceren met en proteolytically de endogene eiwit verteren of afleiden van het gehele complex van het CB-POI op het lysosoom als aangetaste3. Een combinatie van de complexe CB-fusie met de afleidbare aard van het tetracycline-gecontroleerde transcriptionele (TetO) activeringssysteem voorziet bovendien in een afleidbare en beheerste expressie van de transgenic in een omkeerbare mode2. Hoewel het nuttig in veel gevallen, kan de volledige schrapping van genen of eiwitten in vivo resulteren in letaliteit4,5,6. Ook weefsel-specifieke, voorwaardelijke schrapping van sommige genen of eiwitten met behulp van de Cre/Lox systeem mogelijk niet eenvoudig, zoals het uiteindelijk tot permanent verlies van kritieke genomic elements7 leiden zal. Daarom, afhankelijk van het gen of POI, zal geen van deze benaderingen zijn efficiënt in het verstrekken van een nuttig model voor latere studies, met name genen of eiwitten functionele studies in late postnatale en volwassen muizen.
Te omzeilen van de problemen in verband met een dergelijke aanpak en verstrekken bewijs-van-beginsel op de effectiviteit van de voorgestelde methode, die wij hebben gekozen voor het testen van de methode die hier wordt gepresenteerd door het genereren van een voorwaardelijke DN-versie van de proteïne Retinoblastoom 1 (RB1). Verschillende opties zijn voorgestelde8,9,10 tot afschaffing van de functie van endogene RB1; echter allemaal geconfronteerd enkele van dezelfde beperkingen hierboven besproken: permanente germline schrapping van RB1 is embryonically dodelijk en, conform haar tumor suppressor rol, permanente RB1 voorwaardelijke schrapping leidt tot een verscheidenheid van tumoren11. Hoewel een DN versie van RB1 niet van nature lijkt, een beter alternatief voor de momenteel beschikbare strategieën moet voorzien in een stoffelijk gecontroleerde inactivatie van de endogene RB1 en bieden een alternatief mechanisme te herstellen uiteindelijk haar functie. De basis voor een dergelijke constructie werd meer dan twee decennia geleden beschreven1. Echter, als gevolg van technologische beperkingen het ontbrak een mechanisme voor controle transgenic activering, reactie en weefsel specificiteit. Deze studie is de eerste te combineren de elegantie van de doxycycline (Dox)-afhankelijke transcriptionele systeem met een gemanipuleerde transgene constructie van lysosomale protease CB en Rb1 eiwitten. De resulterende CBRb muismodel zorgt voor een tijdelijk gereglementeerde Dox-gemedieerde RB1 voorschrift2. Het voordeel van het gebruik van een dergelijke Proteoom gebaseerde aanpak om te studeren van genfuncties is dat het voor elke gen van belang, met minimale informatie over haar activiteiten kan worden aangenomen.
De voorgestelde DN transgenic strategie biedt vele voordelen ten opzichte van de traditionele benaderingen. Eerst, DN eiwit remming leidt tot slechts een gedeeltelijke ablatie eiwit activiteit, dus het behoud van een residuele endogene expressie. Zo'n resultaat is zeer wenselijk in situaties waar een volledige eliminatie van eiwit activiteit tot embryonale letaliteit leidt, een onderzoek om te bestuderen van de genfunctie in een levende muis sterk te beperken. Ten tweede, de aanwezigheid van het TetO systeem kunt transgenic activering alleen in aanwezigheid van een antibioticum, dat voor een efficiënte en omkeerbare controle van de transgenic activiteit zorgt. Dus, door op te houden de antibiotica administratie, de transgene systeem kan worden gedeactiveerd, en een normale RB1 expressie is terug op zijn plaats. Ten derde, de specificiteit van de transgenic expressie kan variëren naargelang de promotor van keuze. Terwijl wij hebben besloten de alomtegenwoordige ROSA-CAG-promotor voor bewijs-van-principe, is plaatsen de transgenic onder een weefsel-specifieke promotor waarschijnlijk tot beperking van ongewenste transgenic expressie en vergemakkelijken van studies over de therapeutische toepassing van deze transgenic methodologie.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM</td><td>GIBCO-BRL</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle, MEME&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M8042</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>F2442&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine&nbsp;</td><td>DharmaFECT</td><td>T-2010-03</td><td></td></tr><tr><td>Sal I</td><td>Roche</td><td>11745622</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3195S</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>Roche</td><td>13090730</td><td></td></tr><tr><td>CaspaTag&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>APT523</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>CyQuant NF cell proliferatiekit&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C35007</td><td></td></tr><tr><td>Retinoblasoom 1 antilichaam</td><td>Abcam</td><td>Ab6075</td><td></td></tr><tr><td>c-Myc antilichaam</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M5546</td><td></td></tr><tr><td>b-actin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A5316</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67&nbsp;</td><td>Thermofisher scientific</td><td>MA5-14520</td><td></td></tr><tr><td>Fallodie</td><td>Thermofisher scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie microplaatlezer</td><td>FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescentie microscoop&nbsp;</td><td>NikonEclipse80i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>De TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) muislijn is verkrijgbaar bij het Jackson Laboratory als JAX#032011.&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

afleidbare en omkeerbare dominant-negatief (dn) eiwit remming

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Dominant-negatief (DN) eiwit inhibitie is een krachtige methode om te manipuleren eiwitfunctie en biedt diverse voordelen ten opzichte van andere genoom gebaseerde benaderingen. Bijvoorbeeld, hoewel chimeer en Cre-LoxP gerichte strategieën hebben op grote schaal gebruikt, de intrinsieke beperkingen van deze strategieën (dat wil zeggen, lekke promotor activiteit, mozaïek Cre expressie, enz.) zijn aanmerkelijk beperkt hun toepassing. Bovendien is een volledige schrapping van vele endogene genen embryonically dodelijk, waardoor het onmogelijk is om te studeren genfunctie in postnatale leven. Om deze uitdagingen, we hebben aanzienlijke wijzigingen aangebracht in een vroege gentechnologie-protocol en een korte (transgene) versie van het gen Rb1 gecombineerd met een lysosomale protease procathepsin B (CB), voor het genereren van een DN-muismodel van Rb1 (CBRb). Als gevolg van de aanwezigheid van een lysosomale protease, worden het gehele CB-RB1 fusieproteïne en haar interactie complex gerouteerd voor proteasoom-gemedieerde afbraak. Bovendien kan de aanwezigheid van een tetracycline inductor (rtTA)-element in de transgene constructie een afleidbare en omkeerbare regulering van de RB1 proteïne. De aanwezigheid van een alomtegenwoordige ROSA-CAG-promotor in de muismodel CBRb maakt het een nuttig instrument om te verrichten van voorbijgaande aard en omkeerbaar Rb1 gene ablatie en onderzoekers een resource voor het begrijpen van haar activiteiten in vrijwel elk celtype waar RB1 wordt uitgedrukt.

In het algemeen, ontwerpen van een mutatie DN vereist een aanzienlijke hoeveelheid informatie over de structuur en functie van het POI. In tegenstelling, is de DN-strategie die hier gepresenteerd vooral handig wanneer de structurele en functionele informatie voor het POI beperkt is. Als het POI een multimeric eiwit is, een fusie van een subeenheid aan een lysosomale protease dominant kan remmen de geassembleerde multimer en mogelijk andere liganden door een combinatie van proteolyse van d...

Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling van een dominant-negatieve afleidbare systeem, waarin elk eiwit kan voorwaardelijk worden geïnactiveerd door omkeerbaar overexpressing een dominant-negatieve mutant versie van het.

Afleidbare en omkeerbare Dominant-negatief (DN) eiwit remming

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op een breed scala van gebieden die voorwaardelijke en voorbijgaande inactivatie van een gen van belang vereisen door een dominante negatieve versie ervan omgekeerd over-uit te drukken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het slechts een gedeeltelijke ablatie in eiwitactiviteit toestaat, dus, het behoud van een resterende endogene expressie. Hoewel we hier de conditie inactivatie van RB-eiwit beschrijven, die functioneert in een multimerieke assemblage, kan deze methode ook worden toegepast op monomeereiwitten.Umesh Pyakurel, ons laboratorium techinician en een coauteur in het manuscript zal de procedures demonstreren. Om te beginnen groeien NIH3T3 cellen, volgens de specificaties van de leverancier, op 37 graden Celsius met 5% CO2, met behulp van de aanbevolen celkweek medium met 10% foetale runderserum. Om de cellen met pTet-Splice en pCMV-Tet3G vectoren samen te brengen, meng je eerst twee tot vier microliters van het op lipide gebaseerde transfectiereagens per put, en één milliliter onvolledige DMEM per put in een buis van 15 milliliter en broed gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Voeg twee tot drie microgram plasma-DNA per put toe aan de DMEM-mix van dit transfectiereagens. Meng en broed gedurende 20 minuten op kamertemperatuur. Voeg een milliliter van de mix met DNA en de transfectie reagens in DMEM aan elke put van zes-put plaat met NIH3T3 cellen.Na drie tot vier uur incubatie bij 37 graden Celsius met 5%CO2, voeg een milliliter van volledig medium. Voeg vervolgens 2 microliters doxycycline voorraad toe aan elke put en markeer de plaat als plus-doxycycline. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius met 5%CO2.Om de functionaliteit van de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 constructie te beoordelen in het bevorderen van ongeplande celproliferatie, cultuur HEI-OC1 cellen in DMEM met 10%FBS, onder tolerante omstandigheden. Voor celproliferatiestudies telt u de HEI-OC1-cellen met behulp van een celteller. Plaat 10.000 HEI-OC1 cellen per put op een 96-put plaat in 200 microliters van volume elk.Broed de cellen 's nachts uit op 33 graden Celsius met 5%CO2. Om transgene expressie te induceren, voeg een microgram per milliliter doxycycline toe aan een subset van transfected HEI-OC1 cellen. Gebruik de andere subset gelabeld als min-doxycycline en de niet-transfected HEI-OC1 cellen als controles, en incubeer de cellen als 33 graden Celsius met 10% CO2.Om celproliferatie te beoordelen, 48 uur na transfectie, verwijder het celkweekmedium en voeg 100 microliter van 1x kleurstofbindingsoplossing toe aan een celproliferatiekit aan elke put van de microplaat. Volg het protocol van de fabrikant en broed gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Gebruik een fluorescentie microplate lezer om de fluorescentie intensiteit van elk monster te meten.Om de celproliferatie verder te beoordelen met behulp van immunocytochemie, plaat de HEI-OC1 cellen op een cover glas geplaatst in elke put van een 12-well plaat in DMEM. Broed de cellen 's nachts bij 33 graden Celsius. Op de volgende dag, cotransfect naar de cellen in twee putten met de pTet-Splice en de pCMV-Tet3G vectoren, en voer vervolgens de doxycycline behandeling op een goed als gedaan met de NIH3T3 cellen.Gebruik een onverzettede goed als een controle. Als u de cellen voor Ki-67-etikettering wilt verwerken, bevestigt u ze met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Daarna, was ze drie keer met ijskoude PBS gedurende vijf minuten per stuk.Voeg 0,25% nonionisch wasmiddel toe in PBS en broed gedurende 10 minuten uit. Herhaal de was drie keer in PBS gedurende elk vijf minuten. Gebruik 10% serum om de cellen te blokkeren.In een bevochtigde kamer gedurende een uur op kamertemperatuur. Voeg 500 microliters van Ki-67 primaire antilichaam en incubbate 's nachts op vier graden Celsius. Was de cellen opnieuw drie keer in PBS gedurende vijf minuten per stuk.Voeg een milliliter van het secundaire antilichaam toe en broed de cellen gedurende een uur bij kamertemperatuur in het donker uit. Na het verwijderen van de secundaire antilichaamoplossing, was de cellen opnieuw drie keer gedurende vijf minuten in PBS in het donker. Om de HEI-OC1 cellen te labelen met phalloïdine, incuberen ze in 1:200 phalloidin gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.Om de celkernen te labelen, 10 minuten lang de cellen incubeer maken met vijf microgram per milliliter DAPI gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na de levering van de transgene muizen, genotype de pups met behulp van een primer set specifiek voor de CBRb1 fusie regio zoals beschreven in het manuscript. Ras volwassen TetO-DN-CB-myc6-Rb1 muizen aan de ROSA-CAG-rtTA en tetrecycline inducer lijn om experimentele DN-CBRb muizen te genereren, en genotype hun nakomelingen zoals beschreven in het manuscript.NIH3T3 drukt geen endogene RB1-eiwit uit, dus de robuuste RB1-expressie die hier wordt gezien, is te wijten aan transgene inductie in aanwezigheid van Dox, maar niet in zijn afwezigheid, wat de efficiënte activering van de TetO-DN-CB-myc6-Rb1-mix RB1 construct bevestigt. Hek293-cellen daarentegen hebben endogene RB1-expressie. De toevoeging van doxycycline leidde tot TetO-DN-CB-myc6-Rb1 activatie en RB1 down-regulation.RB1 expressie werd hervat 21 uur na doxycycline werd verwijderd uit de media. HEI-OC1 cellen gecotransfected met dezelfde vectoren, toonde een bescheiden, maar aanzienlijke toename van het celnummer volgen doxycycline behandeling in vergelijking met transfected cellen niet behandeld met doxycycline, en de onveronfecteerde cellen. Fluorescerende in situ hybridisatie bevestigde de genomische invoeging van TetO-DN-CB-myc6-RB1 transgene in muizen.Er was een eerste toename van de totale RB1-eiwitexpressie in slakkenkel van de transgene muizen die drie dagen met doxycycline werden behandeld in vergelijking met de controlegroep. In groepen die gedurende zeven en 10 dagen met doxocycline werden behandeld, werd echter een aanzienlijke vermindering van de RB1-expressie waargenomen. Ongeacht het geanalyseerde weefsel werd een significante vermindering van het RB1-eiwit waargenomen bij transgene muizen die met doxocycline werden behandeld, maar niet in de controlegroep, wat de efficiëntie van de TetO-DN-CB-myc6-RB1-constructie bevestigt.Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te controleren of elk van de coderingselementen van de transgene zijn in frame met elkaar. Als de coderingsgebieden van Cathepsin B en retinoblastoom beschreven in dit rapport, bij toeval, buiten beeld verbonden waren, zou het niet het beoogde fusie-eiwit opleveren. Zo moet DNA-sequentie verificatie worden gedaan voordat het transgene injecteren in eencellige muisembryo's.Na deze procedure kan de alomtegenwoordige CAG-promotor worden vervangen door specifieke promotors om de genfunctie op de specifieke manier van een cel te bestuderen.

inducible-and-reversible-dominant-negative-dn-protein-inhibition

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Een snelle en eenvoudige manier om humane cellijnen met induceerbare en omkeerbare cDNA overexpressie of shRNA-gemedieerde knock-down van het gen van belang genereren. Deze methode kunnen onderzoekers betrouwbaar en zeer reproduceerbaar manipuleren cellijnen die moeilijk te veranderen door transiënte transfectie methoden of conventionele knockdown / knockout strategieën.

Genereren van stabiele humane cellijnen met tetracycline induceerbare (Tet-on) shRNA of cDNA Expression

De hier beschreven methode wordt gebruikt om de apoptotische signaleringskaskade te induceren in gedefinieerde stappen om de activiteit van een anti-apoptotisch bacterieel effector-eiwit te onderzoeken. Deze methode kan ook worden gebruikt voor inductieve expressie van pro-apoptotische of toxische eiwitten, of voor het onderzoeken van interferentie met andere signaalwegen.

Het toepassen van een induceerbare Expression Systeem om interferentie van bacteriële virulentiefactoren met intracellulaire signalering Studie

We beschrijven hier een systeem dat gebruikmaakt van een locatie-specifieke, omkeerbare in vivo eiwitblokkering om replicatievorken in Escherichia coli te stoppen en te laten instorten. De totstandkoming van de replicatieblokkering wordt geëvalueerd door middel van fluorescentiemicroscopie en neutrale-neutrale 2-dimensionale agarosegelelektroforese wordt gebruikt om replicatie-intermediaten te visualiseren.

Induceren van een Site Specific Replication Verstopping in<i&gt; E. coli</i&gt; Met behulp van een TL-repressor aandrijfsysteem

Dit protocol fungeert als een regeling voor de oprichting van een functioneel Tet-ON systeem in cellijnen van kanker en het latere gebruik ervan, in het bijzonder voor de studie van de rol van tumor cel afkomstige eiwitten in de aanwerving van monocyten/macrofagen aan de communicatie van de tumor.

Voorwaardelijke Knockdown van genexpressie in kanker cellijnen te bestuderen van de aanwerving van monocyten/macrofagen naar de Tumor communicatie

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn voor het genereren van een modelsysteem waarin de transcriptie van een endogene gen van belang voorwaardelijk kan worden gecontroleerd in de levende dieren of cellen met behulp van verbeterde lac -onderdrukker en/of tet activator systemen.

In vivo toepassing van het systeem van de afstandsbediening voor de manipulatie van de endogene genexpressie

Gerichte DNA epigenome bewerken vertegenwoordigt een krachtige therapeutische aanpak. Dit protocol beschrijft de productie, reiniging en concentratie van de alles-in-één lentivirale vectoren herbergen van de CRISPR-dCas9-DNMT3A-transgenic voor bewerken van epigenome's in menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleid van neuronen.

Lentivirale Vector Platform voor de efficiënte levering van Epigenome-bewerkingsgereedschap in mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige ziekte modellen

Hier beschrijven we een genoombewerkingstool op basis van de temporele en voorwaardelijke stabilisatie van geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische repeat- (CRISPR-) geassocieerd eiwit 9 (Cas9) onder het kleine molecuul, Shield-1. De methode kan worden gebruikt voor gekweekte cellen en diermodellen.

Een nieuwe toolkit voor het evalueren van genfuncties met behulp van voorwaardelijke Cas9-stabilisatie

De interactie van een ATP-afhankelijke chromatine remodeller met een DNA-ligand wordt beschreven met behulp van CD-spectroscopie. De geïnduceerde conformatieveranderingen op een genpromotor geanalyseerd door de gegenereerde pieken kunnen worden gebruikt om het mechanisme van transcriptionele regulatie te begrijpen.

CD-spectroscopie om DNA-eiwitinteracties te bestuderen

Hier presenteren we een protocol voor de in vitro selectie van gemanipuleerde transcriptionele repressoren (ETR's) met een hoge, langdurige, stabiele, on-target uitschakelingsefficiëntie en een lage genoombrede, off-target activiteit. Deze workflow maakt het mogelijk om een initieel, complex repertoire van kandidaat-ETR's terug te brengen tot een shortlist, geschikt voor verdere evaluatie in therapeutisch relevante settings.

In vitro Selectie van gemanipuleerde transcriptionele repressoren voor gerichte epigenetische uitschakeling

Deze studie beschrijft methoden voor de T7-gemedieerde co-expressie van meerdere genen uit een enkel plasmide in Escherichia coli met behulp van het pMGX plasmide systeem.

Induceerbaar T7 RNA Polymerase-gemedieerde Multigene Expression System, pMGX

Leer een afleidbaar en omkeerbaar dominant-negatief systeem voor voorwaardelijke eiwitinactivering met behulp van NIH3T3-cellen. Deze methode behoudt residuale endogene expressie en is toepasbaar op zowel multimerische als monomerische eiwitten.

Afleidbare en omkeerbare Dominant-negatief (DN) eiwit remming

Meer video's verkennen