Name: Een Syngeneic B-cel lymfoom muismodel voor pre-klinische evaluatie van CD19 auto T cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Leer hoe u murine CD19 CAR T-cellen produceert via retrovirale transductie voor de behandeling van syngene A20 B-cel lymfoom in BALB/c muizen. Dit protocol vergelijkt lymfo-replete en lymfo-gedepleteerde omstandigheden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zouden graag bedanken Bloodwise voor financiering van dit onderzoek (grant 13031) en de CRUK Manchester biologische resource eenheid, beeldvorming en cytometry en moleculaire biologie core faciliteiten voor de ondersteuning van dit werk.

<ol><li>Brian, W. Food and Drugs Administration Biologics Licence Application Approval letter. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/CellularGeneTherapyProducts/ApprovedProducts/UCM574106.pdf ">https://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/CellularGeneTherapyProducts/ApprovedProducts/UCM574106.pdf </a> (2017).</li>
<li>Malarkey, M., Brian, W. Food and Drugs Administration Biologics Licence Application Approval letter. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/cellulargenetherapyproducts/approvedproducts/ucm581259.pdf ">https://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/cellulargenetherapyproducts/approvedproducts/ucm581259.pdf </a> (2017).</li>
<li>Liu, Y., Zeng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+and+Innate+Immune+System+Interactions%3A+Translational+Potentials+for+Cancer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Cancer and Innate Immune System Interactions: Translational Potentials for Cancer Immunotherapy.</a> Journal of Immunotherapy. 35 (4), Hagerstown, Md. 299-308 (2012).</li>
<li>Janssen, L. M. E., Ramsay, E. E., Logsdon, C. D., Overwijk, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+system+in+cancer+metastasis%3A+friend+or+foe%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">The immune system in cancer metastasis: friend or foe.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5 (1), 79(2017).</li>
<li>Pandya, P. H., Murray, M. E., Pollok, K. E., Renbarger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Immune+System+in+Cancer+Pathogenesis%3A+Potential+Therapeutic+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">The Immune System in Cancer Pathogenesis: Potential Therapeutic Approaches.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 13(2016).</li>
<li>Vinay, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+evasion+in+cancer%3A+Mechanistic+basis+and+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Immune evasion in cancer: Mechanistic basis and therapeutic strategies.</a> Seminars in Cancer Biology. 35, S185-S198 (2015).</li>
<li>Gajewski, T. F., Meng, Y., Harlin, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16699366">Immune Suppression in the Tumor Microenvironment.</a> Journal of Immunotherapy. 29 (3), 233-240 (2006).</li>
<li>Munn, D. H., Bronte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+suppressive+mechanisms+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Immune suppressive mechanisms in the tumor microenvironment.</a> Current opinion in immunology. 39, 1-6 (2016).</li>
<li>Vanderlugt, C. L., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+spreading+in+immune-mediated+diseases%3A+implications+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epitope spreading in immune-mediated diseases: implications for immunotherapy.</a> Nature Reviews Immunology. 2, 85(2002).</li>
<li>Hardwick, N., Chain, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+spreading+contributes+to+effective+immunotherapy+in+metastatic+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Epitope spreading contributes to effective immunotherapy in metastatic melanoma patients.</a> Immunotherapy. 3 (6), 731-733 (2011).</li>
<li>Makkouk, A., Weiner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Immunotherapy+and+Breaking+Immune+Tolerance-New+Approaches+to+an+Old+Challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Cancer Immunotherapy and Breaking Immune Tolerance-New Approaches to an Old Challenge.</a> Cancer research. 75 (1), 5-10 (2015).</li>
<li>Jackson, S. R., Yuan, J., Teague, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+CD8%28%2B%29+T-cell+tolerance+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Targeting CD8(+) T-cell tolerance for cancer immunotherapy.</a> Immunotherapy. 6 (7), 833-852 (2014).</li>
<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://ascopubs.org/doi/abs/10.1200/jco.2011.29.15_suppl.2534">Lymphodepletion and tumor burden govern clinical responses in patients with B-cell malignancies treated with autologous, CD19-targeted T cells.</a> Journal of Clinical Oncology. 29 (15_suppl), 2534(2011).</li>
<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+persistence+of+adoptively+transferred+autologous+CD19-targeted+T+cells+in+patients+with+relapsed+or+chemotherapy+refractory+B-cell+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias.</a> Blood. 118 (18), 4817(2011).</li>
<li>Hay, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+Biomarkers+of+Severe+Cytokine+Release+Syndrome+after+CD19+Chimeric+Antigen+Receptor-modified+T+Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Kinetics and Biomarkers of Severe Cytokine Release Syndrome after CD19 Chimeric Antigen Receptor-modified T Cell Therapy.</a> Blood. 130, 2295-2306 (2017).</li>
<li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+CD19+chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+treatment+of+B+cell+malignancies+in+phase+I+clinical+trials%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Efficiency of CD19 chimeric antigen receptor-modified T cells for treatment of B cell malignancies in phase I clinical trials: a meta-analysis.</a> Oncotarget. 6 (32), 33961-33971 (2015).</li>
<li>Kueberuwa, G., Kalaitsidou, M., Cheadle, E., Hawkins, R. E., Gilham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19+CAR+T+Cells+Expressing+IL-12+Eradicate+Lymphoma+in+Fully+Lymphoreplete+Mice+through+Induction+of+Host+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">CD19 CAR T Cells Expressing IL-12 Eradicate Lymphoma in Fully Lymphoreplete Mice through Induction of Host Immunity.</a> Molecular Therapy - Oncolytics. 8, 41-51 (2018).</li>
<li>Engels, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+vectors+for+high-level+transgene+expression+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Retroviral vectors for high-level transgene expression in T lymphocytes.</a> Human Gene Therapy. 14 (12), 1155-1168 (2003).</li>
<li>Parkinson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+Necropsy+and+Selected+Tissue+and+Sample+Collection+in+Rats+and+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2966(2011).</li>
<li>Kueberuwa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7%28%2B%29+selected+gene-modified+T+cells+maintain+a+central+memory+phenotype+and+display+enhanced+persistence+in+peripheral+blood+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">CCR7(+) selected gene-modified T cells maintain a central memory phenotype and display enhanced persistence in peripheral blood in vivo.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 5, 14(2017).</li>
</ol>

David Gilham werkt voor Celyad die bij de productie van auto T-cellen betrokken is. De rest van de auteurs hebben niets te onthullen.

Syngeneic Muismodellen toestaan het testen van de progressie van de ziekte en therapie met behoud van een intact immuunsysteem. Dit is essentieel als het gaat om therapieën die interactie met het immuunsysteem en in het bijzonder voor immunotherapeutische agenten.
Het protocol hier beschreven heeft twee kritische werkstromen, de ene is genetisch muis T cel om het uiten van de auto's wijzigen. Hiervoor 7 dagen vanaf de inleiding tot de validatie van de transductie. Gelijktijdig met de productie van auto T-cellen is de oprichting van systemische lymfoom in muizen. Moet auto T celproductie mislukt of kwaliteit zijn onvoldoende, er is meestal niet genoeg tijd om te produceren vervanging cellen voordat muizen bezwijken aan lymfoom. Het is daarom cruciaal dat onderzoekers met behulp van deze modellen nauwkeurig tumor doseren en ziekte progressie studies uitvoeren om tijd met succes de productie van auto T cellen voor therapeutische administratie.
Voorkomende oorzaken van lage T-cel transductie efficiëntie omvat arme transfectie efficiëntie van producent cellen, meestal veroorzaakt door een slechte plasmide zuiverheid of onjuiste bepaling van de pH van transfectie media. Het wordt aanbevolen om de efficiëntie van producent cel transfectie alvorens met het volledige protocol zoals slechte transfectie Beperk de efficiëntie van de transductie van T-cel te controleren. Recombinante menselijke fibronectine fragmenten kunnen worden verzameld en opgeslagen bij-20 ° C voor hergebruik, echter meerdere freeze-watervalen leiden tot verminderde transductie efficiëntie. Snelle verwerking van de milt van de muis na collectie ook belangrijk is voor het verkrijgen van hoge rendementen van levensvatbare T-cellen.
Opgemerkt moet worden dat het protocol hier beschreven gebruik maakt van A20 cellen luciferase uitdrukken. Dit heeft de voorkeur als het biedt de mogelijkheid voor het meten van systemische tumor last door bioluminescentie imaging. Echter in de aanwezigheid van een functionele immuunsysteem, kon reacties op luciferase vertekenen de resultaten. We hebben eerder getest immuunreacties muizen tot markering transgenen17te overleven. Het is sleutel tot het repliceren van belangrijke experimenten cuvetten A20 gratis transgenen om te valideren die deze niet een belangrijke rol in de uitroeiing van de tumor door immune cellen spelen.
Terwijl klinische agenten alleen gebruikt in vivo bij immuun-deficiënte muizen worden kunnen, kan het gebruik van muis auto T cellen tegen muis kankercellen we de bijdragen van het immuunsysteem te therapeutische werkzaamheid of ziekte progressie evalueren. Dit protocol kan worden gebruikt voor de pre-klinische evaluatie van auto's die zijn gericht op de B-cel lymfoom of andere auto's met aanvullende wijzigingen zoals secretie van IL-12 zoals hier beschreven. Hierbij moet worden opgemerkt dat hoewel het samenspel tussen immune cellen kan worden geëvalueerd in syngeneic muismodellen, ze niet nauwkeurig interactie in mens in vivo recapituleren kunnen. Bijzondere opmerking, menselijke en muis auto's zal variëren in de structuur die stroomafwaartse gevolgen wellicht; optimale activering en cel cultuur voorwaarden voor groei van T-cellen zijn verschillende20, weefsel verdeling van doel antigeen expressie kan variëren tussen mensen en muizen en ervaren toxicities radicaal afwijken. Het is daarom essentieel om ex vivo en XENOGENECELLEN modellen te bevestigen de resultaten te gebruiken.
Kortom recapituleren het syngeneic lymphodepleted en lymphoreplete model van lymfoom patiënten met en zonder voorafgaande chemo/radiotherapie. Dit biedt een modelsysteem waarin na te bootsen de klinische instellingen zodat het testen van een aantal therapeutische strategieën die belangrijke met de komende golf van nieuwe immuun therapie agenten zullen.
Met het gebruik van pre-conditionering, zal opgemerkt worden dat alle de muizen meestal duidelijk het lymfoom. Met is tot 90% volledig respons bij de mens, dit vertegenwoordiger. Nochtans, de uitdagingen voor CD19 auto T-cel therapie zal afhangen van het voorkomen van de hoge frequentie van hervallen waargenomen die zijn vaak CD19. Hervallen zijn niet waargenomen in dit model tot, en vaak meer dan 100 dagen. Wijzigingen na te bootsen de hervallen gezien in de kliniek kon helpen de toekomstige uitdagingen van CD19 auto T-cel therapie.

Chimeer antigeen receptor (auto) T-cel therapie blijkt verbazingwekkend klinische succes in de behandeling van CD19+ maligniteiten leiden tot de goedkeuring van tisagenlecleucel voor recidiverende acute lymfatische leukemie1 en axicabtagene ciloleucel voor progressieve large B-cel non-Hodgkin lymfoom2 in 2017.
Het belang van interacties tussen kanker en het immuunsysteem in zowel de progressie van de ziekte en de therapeutische mechanismen wordt steeds meer erkend3,4,5. Het is bijvoorbeeld goed gedocumenteerd dat de tumor communicatie (TME) wordt overspoeld met factoren die de effector functies van immuuncellen6,7,8kunnen onderdrukken. Als alternatief kunnen priming endogene immune cellen en de verspreiding van epitoop sleutel in de uitroeiing van de tumor en lange termijn verzet tegen tumor uitdaging9,10. Beide van deze fenomenen kunnen niet worden geëvalueerd in XENOGENECELLEN modellen dat het gebrek aan een immuunsysteem. Ook komen systemen met behulp van transgene eiwitten niet nauwkeurig overeen met de uitdaging van het breken van immuun tolerantie die is vereist voor epitoop verspreiding van11,12. Een syngeneic model met een volledig functionele immuunsysteem is daarom primordiaal voor het modelleren van deze belangrijke aspecten van kanker ziekte progressie en het immuunsysteem therapeutics.
Een belangrijk voorbehoud van auto T-cel therapie is dat lymphodepleting pre-conditionering vereist voor therapeutische succes13,14 is. Dit gebeurt meestal bij patiënten door het toedienen van chemotherapie vóór infusie van auto T cellen15,16. Als een standaard methode, om na te bootsen lymphodepletion gebruikt in de instelling van de patiënt, beheren we 5 Gy totale lichaam bestraling (TBI) om de lymphodepletion vóór de toediening van therapeutische auto T cellen aan muizen die systemische A20 B-cel lymfoom.
Hoewel lymphodepleting pre-conditionering niet een probleem voor de meerderheid van de patiënten is, betekent toxiciteit die wordt geleverd met chemotherapeutische agenten dat patiënten van lage performance status niet in aanmerking voor auto T-cel therapie komen. Een om testsysteem te maken dat de patiënten niet in aanmerking voor lymphodepletion vertegenwoordigt, opgericht wij een lymphoreplete syngeneic muismodel waarin we model auto T-cel therapie van lymfoom. In dit model, we toonden dat de secretie van IL-12 van binnen auto T cellen tot uitroeiing van gevestigde lymfoom met een slagingspercentage van leiden kan ~ 25%17. Bovendien toonden we dat endogene immune cellen bij de uitroeiing van de kanker betrokken waren.
Hier beschrijven we in detail het protocol voor de productie van muis auto T-cellen, tot oprichting van lymfoom in syngeneic muizen en behandeling van het lymfoom met auto T cellen met of zonder het gebruik van lymphodepleting pre-conditionering. Dit kan gebruikt worden voor combinatie studies van auto T cellen met andere stoffen, testen van auto T cellen met andere transgenen of voor het gebruik van andere adoptief cel therapie of immunotherapie strategieën tegen lymfoom.

<table><tbody><tr><td>0.2 &micro;m syringe filter</td><td>Appleton Woods</td><td>FC121</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &micro;m syringe filter</td><td>Appleton Woods</td><td>FC122</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml pestle and microtube</td><td>VWR</td><td>431-0098</td><td></td></tr><tr><td>100X penicillin-streptomycin-glutamine (PSG)</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (50 mM)</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidine S hydrochloride</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>15205</td><td></td></tr><tr><td>Bottle Top Filter (0.2 &micro;m)</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>FIL8192</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 711 anti-mouse CD8a Antibody</td><td>BioLegend</td><td>100759</td><td>1 in 100 staining dilution. Clone 53-6.7</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 785 anti-mouse CD4 Antibody</td><td>BioLegend</td><td>100552</td><td>1 in 100 staining dilution. Clone RM4-5</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Cell counting beads &ndash; CountBright absolute counting beads</td><td>Molecular Probes</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 100&mu;m</td><td>VWR</td><td>734-0004</td><td></td></tr><tr><td>Cyclophosphamide Monohydrate</td><td>Merck</td><td>239785-1GM</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle medium (DMEM) - High Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6546</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads</td><td>Gibco</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-1440-03</td><td>Sold by Sigma- Aldrich</td></tr><tr><td>Flow cytometer - LSR Fortessa x20</td><td>BD Biosciences</td><td>658222R1</td><td></td></tr><tr><td>Foetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>Haemacytometer</td><td>Appleton Woods</td><td>HC001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES solution</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>H0887&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>IL-12 p70 Mouse Uncoated ELISA Kit</td><td>Invitrogen</td><td>88-7121-76</td><td></td></tr><tr><td>IL2, Proleukin</td><td>Novartis</td><td>PL 00101/0936</td><td></td></tr><tr><td>in vivo bioluminescence imaging system &ndash; in vivo xtreme II imaging system</td><td>Bruker</td><td>T149094</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin Calcium Salt</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Live/dead stain - Zombie Violet Fixable Viability Kit</td><td>BioLegend</td><td>423114</td><td>1 in 100 staining dilution</td></tr><tr><td>Luminometer - Lumistart Omega</td><td>BMG Labtech</td><td>415-301</td><td></td></tr><tr><td>Murine IFN-&gamma; ELISA kit</td><td>Diaclone</td><td>861.050.010</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>pCL-Eco</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP229540</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Platinum E cell line</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-101</td><td>(RRID:CVCL_B488)</td></tr><tr><td>Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28</td><td>BD Biosciences</td><td>553294</td><td>Clone &nbsp;37.51</td></tr><tr><td>Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3&epsilon;</td><td>BD Biosciences</td><td>553057</td><td>Clone &nbsp;145-2C11&nbsp;</td></tr><tr><td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>1 in 100 staining dilution. Clone 2.4G2</td></tr><tr><td>Puromycin Dihydrochloride</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human fibronectin fragment - RetroNectin Reagent</td><td>TaKaRa</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse IL-7 (carrier-free)</td><td>BioLegend</td><td>577806</td><td></td></tr><tr><td>Red cell lysis buffer</td><td>eBioscience</td><td>004-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin - EDTA solution</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>T3924&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>XenoLight D-Luciferin</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr></tbody></table>

een syngeneic b-cel lymfoom muismodel voor pre-klinische evaluatie van cd19 auto t cellen

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Het verbazingwekkende klinische succes van CD19 chimeer antigeen receptor (auto) T-cel therapie heeft geleid tot de goedkeuring van twee tweede generatie chimeer antigeen receptoren (auto's) voor acute lymfatische leukemie (ALL) andnon-Hodgkin lymfoom (NHL). De focus van het veld is nu op emuleren deze successen in andere hematologische maligniteiten waar minder indrukwekkend volledige berekening van responsrates in acht worden genomen. Verder engineering van auto T-cellen of andere behandelmodaliteiten co rechtsbedeling kan met succes belemmeringen voor succesvolle therapie in de instellingen van andere kanker.
Daarom presenteren we een model waarin anderen kunnen voeren preklinische testen van CD19 auto T-cellen. Resultaten in dit goed geteste model van de B-cel lymfoom dreigen te worden informatieve auto T-cel therapie in het algemeen.
Dit protocol staat toe de reproduceerbare productie van muis auto T cellen via de transfectie van het calciumfosfaat Plat-E producent cellen met MP71 retrovirale constructies en pCL-Eco verpakking plasmide gevolgd door verzameling van secreted retrovirale deeltjes en transductie gebruik van recombinante menselijke fibronectine fragment en centrifugeren. Validatie van retrovirale signaaltransductie, en bevestiging van de mogelijkheid van auto T cellen te doden doel lymfoom cellen ex vivo, door het gebruik van stroom cytometry, luminometry en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), is ook beschreven.
Protocollen voor het testen van auto T cellen in vivo in lymphoreplete en lymphodepleted syngeneic muizen, rekening houdend met gevestigde, systemische lymfoom worden beschreven. Antikanker activiteit wordt gecontroleerd door de in vivo bioluminescentie en ziekte progressie. Tonen we typische resultaten van uitroeiing van gevestigde B-cel lymfoom bij gebruik van 1st of 2nd generatie auto's in combinatie met de lymphodepleting pre-conditionering en een minderheid van muizen bereiken lange termijn remissies bij gebruik van auto T cellen uiten van IL-12 bij lymphoreplete muizen.
Deze protocollen kunnen worden gebruikt voor het evalueren van CD19 auto T cellen met verschillende extra wijziging, combinaties van auto T-cellen en andere therapeutische agenten of aangepast voor het gebruik van auto T cellen tegen antigenen van de verschillende doelgroepen.

Hoogrenderende transductie van T-cellen is het noodzakelijk om verse retrovirale deeltjes. De transfectie van het Plat-E cellijn met pCL-Eco producent plasmide en pMP71 retrovirus plasmide geeft aanleiding tot de afscheiding van retrovirale deeltjes in de cel bezinken. Wanneer een fluorescerende marker-gen, zoals mCherry, is gecodeerd in het retrovirus, kan succesvolle transfectie worden bevestigd door fluorescentie microscopie (Figuur 1). Virus-bevattende supernatant van transfected cellen van Plat-E wordt gebruikt om de transduce van T cellen via 2 rondes van spin-fection op fibronectine fragment beklede platen. De efficiëntie van signaaltransductie kan worden bepaald 4 dagen post signaaltransductie via stroom cytometry. Succesvol getransduceerde cellen express het marker-gen gecodeerd in het retrovirus (Figuur 2). Transductie efficiëntie variëren van ~ 50-90% rendement met eerste generatie receptoren te ~ 10-40% met auto construeert dichtbij de retrovirale verpakking capaciteit. Terwijl marker genexpressie succesvolle retrovirale signaaltransductie toont, is het essentieel om te laten zien van de functionaliteit van auto T-cellen bij boeiende met cellen dat uitdrukkelijke doel antigeen op hun oppervlak. Doel cellijnen aan uitdrukkelijke luciferase gewijzigd kunnen worden gebruikt in luciferase testen om te testen de mate van cel-kill door auto T cellen rechtstreeks (figuur 3A). Het vrijkomen van effector cytokines uit auto T-cellen bij co cultuur met doelcellen, bepaald door ELISA, kan ook worden gebruikt als een indirecte maat voor de cytotoxiciteit voor auto T-cel (figuur 3B en 3 C).
AUTO T-cellen geproduceerd in dit protocol kunnen worden geëvalueerd in lymphoreplete muizen door de oprichting van systemische A20 lymfoom met een dosis van 100 mg/kg van Cyclofosfamide (geïnjecteerd intraveneus), 1 dag vóór IV injectie van 5 x 105 A20 cellen (Figuur 4). IP-injectie met luciferine en beeld vastleggen met behulp van een in vivo bioluminescentie imager kan worden gebruikt om te controleren op last van de tumor met behulp van een constant rendement en blootstelling tijd hele (figuur 5A-C). AUTO T cellen aangepast aan uitdrukkelijke IL-12 zijn geschikt voor het uitroeien van systemische lymfoom met lymphodepleting preconditionering ziektevrije overleving geven in ongeveer 25% van muizen (5D van de figuur). Lymphodepleting conditionering, verbetert bereikt door 5 Gy TBI 1 dag vóór de de IV toediening van auto T-cellen, aanzienlijk engraftment (Figuur 6). In dit model zijn eerste generatie auto T-cellen geschikt voor het uitroeien van systemische A20 lymfoom, meestal inducerende ziektevrije overleving in 100% van muizen (Figuur 7).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig1.jpg"> Figuur 1. Bevestiging van succesvolle transfectie van Plat E cellen. Plat-E cellen transfected met retrovirale auto construct en pMP71 en pcl-Eco verpakking vector plasmide DNA. Succesvolle transfectie wordt aangegeven door expressie van het mCherry fluorescerende marker-gen. A) helder veld microscopie, B) fluorescentie microscopie en C) samengevoegde afbeeldingen worden weergegeven. Vergroting = 50 X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig2.jpg"> Figuur 2. Bepaling van signaaltransductie rendement door stroom cytometry. Stroom cytometry wordt gebruikt om de efficiëntie van de transductie van de muis T-cellen op dag 4 post signaaltransductie, met behulp van Zombie UV leven/dood, mCherry, BV711 en BV785 voor de opsporing van de live, auto bouwen, CD4 en CD8 cellen, respectievelijk. Representatieve resultaten van A) Non-getransduceerde, B) mCherry.αmCD19.mCD3z en C) mCherry.αmCD19.mCD3z.mIL12 worden weergegeven met het gating van 1) Singlets 2) levende cellen 3) CD4 en CD8 4) en 5) evaluatie van mCherry positieve cellen uiten van de auto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig3.jpg"> Figuur 3. Validatie van auto T-cel activiteit. ΑmCD19 auto T-cellen werden mede gekweekte met A20 lymfoom cellen aangepast aan uitdrukkelijke luciferase (1 x 10,4: 1 x 10-4) voor 16 h in een U-onder 96-wells-plaat. Na co cultuur, cellen werden Ingehuld en supernatant werd verzameld. A) cellen werden opnieuw geschorst in PBS en luminometry werd gebruikt voor het beoordelen van de levensvatbaarheid van de doelcellen. Supernatant van co cultuur evalueerden voor de aanwezigheid van IFNγ (B) en IL-12 (C). De verhouding van auto T cel naar de doelcellen en lengte van de periode van de co cultuur moeten worden geoptimaliseerd voor elke auto construeren en cellijn richten. PMA en ionomycin behandeling kan als positieve controle worden gebruikt ter bevestiging van de kwaliteit van T-cellen en de cellen van hun vermogen om te reageren. Foutbalken Toon SD. statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van one-way ANOVA. p < 0,001). Dit cijfer is gewijzigd van17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig4.jpg"> Figuur 4. Tot oprichting van de A20 lymfoom zonder lymphodepletion. Cyclofosfamide kan verhogen efficiency van lymfoom inductie zonder veroorzaakt lymphodepletion. A) bloed graven van 6-8-week-oude BALB/c muizen na IV levering van 100 mg/kg van cyclophosphamide. Foutbalken Toon SD B) lymfoom last van 6-8-week-oude BALB/c muizen na IV levering van 100 mg/kg cyclofosfamide of zoutoplossing op dag -1 en IV levering van 5 x 105 A20 cellen op dag 0 gemeten met behulp van een luminometer. C) voortbestaan van muizen in B). Foutbalken Toon SD. statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van 2-way ANOVA. ** p < 0,01, *** p < 0,001). Dit cijfer is gewijzigd van Kueberuwa et al. 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig5.jpg"> Figuur 5. Toezicht op lymfoom last en overleving. Muizen die A20 lymfoom uiten luciferase ontvangen 100 µL intraperitoneaal (IP) injecties van 30 mg/mL luciferine en werden beeld met behulp van een in vivo bioluminescentie imaging systeem. A) muizen werden blootgesteld voor 1 min aan de ventrale zijde en onmiddellijk omgedraaid naar afbeelding dorsale te halen tumor massa's aan beide zijden van de organen (B). C) representatieve resultaten van het lymfoom last van muizen van de BALB/c ontvangen van verschillende αmCD19 auto T cellen zonder lymphodepletion. Foutbalken Toon SEM. D) overlevingspercentage van de dezelfde muizen. Dit cijfer is gewijzigd van Kueberuwa et al. 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig6.jpg"> Figuur 6. Effecten van lymphodepletion. A) bloed graven van 6-8-week-oude BALB/c muizen na ontvangst van 5 Gy TBI bij een dosering van 0,02 Gy/min; Foutbalken Toon SD. statistische analyse door two-way ANOVA. p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. B) Monitoring van CD4+ en CD8+ auto T cellen in het perifere bloed van muizen door stroom cytometry voor de mCherry marker gene 7 dagen post administratie. Foutbalken Toon SD. Dit cijfer is gewijzigd van Kueberuwa et al. 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig7.jpg"> Figuur 7. AUTO T cel activiteit met lymphodepleting pre-conditionering. Typische resultaten tonen het effect van 5 Gy TBI de dag vóór de toediening van auto T-cel. A) Imaging en (B) grafische weergaven van beeldvorming van muizen na 100 µL intraperitoneaal (IP) injecties van 30 mg/mL luciferine met behulp van een in vivo bioluminescentie imaging systeem. Foutbalken Toon SEM. C) voortbestaan van de dezelfde muizen. Dit cijfer is geweest gewijzigde fromKueberuwa et al. 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Hier presenteren we een protocol voor de productie en de preklinische beproeving van lymfkliertest CD19 auto T-cellen door retrovirale transductie en gebruik als een therapie tegen gevestigde syngeneic A20 B-cel lymfoom in BALB/c muizen met of zonder lymphodepleting Preconditionering.

Een Syngeneic B-cel lymfoom muismodel voor pre-klinische evaluatie van CD19 auto T cellen

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Deze methode kan ons helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de CAR T-cel immuuntherapie veld, zoals de genetische modificatie van CAR T-cellen en de combinatie met andere immuuntherapieën. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat vergelijkingen tussen de lymfe vol en de lymfe uitgeput instellingen. Dit stelt ons in staat om de rol van endogene immuuncellen te zien in zowel de progressie van de ziekte en hun interactie met therapeutische CAR T-cellen.The implicatie van deze techniek als 10 aan de therapie op de diagnose van vaste tumor, omdat de lessen geleerd in dit model kan direct worden vertaald naar het huis van snoep met andere doelen zoals CEA. Om deze procedure te beginnen. Bereid eerst alle benodigde media en cellen voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Op dag één bij volledige DMEM aan 15 vierkante centimeter cultuurschotels. Zaad 7,5 miljoen platina E-Cellen in deze gerechten en incubeer 's nachts op 37

a-syngeneic-mouse-b-cell-lymphoma-model-for-pre-clinical-evaluation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

In deze video, tonen we de procedure van de CD40-activatie en expansie van B-cellen van muizen splenocyten van C57BL / 6 muizen, die gebruikt kan worden als een model antigeen-presenterende cel (APC), de inductie van immuniteit bestuderen.

Muizenmodel van CD40-activatie van B-cellen

This video demonstrates an in vitro assay to validate chimeric antigen receptor (CAR) T cell activity. B-cell lymphoma cells expressing CD19 antigen and cytoplasmic luciferase are co-cultured with CD19-specific CAR T cells. CAR binding to CD19 on a tumor induces the CAR T cells to release cytokines and toxins that cause tumor cell cytotoxicity. The CAR T cell activity is evaluated by quantifying the released cytokine and decreased luciferase-mediated bioluminescence in the tumor cells.

An In Vitro Assay to Evaluate the Anti-Tumor Activity of Tumor-Specific CAR T Cells

De metastatische verspreiding van kanker de belangrijkste oorzaak van kankersterfte. Wij bieden een uitgebreide beschrijving van ons overleven chirurgie methodologie voor de oprichting van een "patiënt-achtige" orthotoop syngeen muis modelsysteem voor het bestuderen van de mechanismen van metastase in vaste orgel tumoren.

Een &quot;Patiënt-Like&quot; Orthotope Syngene Mouse Model van Hepatocellular carcinoom metastase

Implementatie van een orthotope model niercelcarcinoom in immunocompetente muizen levert de onderzoeker een klinisch relevante systeem gedefinieerd door de aanwezigheid van een primaire niertumor en longmetastasen in hetzelfde dier. Dit systeem kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan behandelingen in vivo preklinisch testen.

Een Syngenische muismodel van gemetastaseerd niercelcarcinoom voor Kwantitatieve en Longitudinale Evaluatie van de preklinische therapieën

Hier presenteren we een protocol voor de voorbereiding en het stereotaxic beheer van allogene menselijke lymfocyten in immunodeficiëntie muizen uitvoering orthotopic menselijke primaire hersentumoren. Deze studie biedt een bewijs-van-concept voor zowel de haalbaarheid en antitumorale werkzaamheid van cellulaire immuuntherapie intrabrain-geleverd.

Stereotactische adoptief overdracht van cytotoxische immuuncellen in lymfkliertest modellen van Orthotopic mens Glioblastoma Multiforme Xenografts

We beschrijven een aanpak om betrouwbaar te genereren chimeer antigeen receptor (auto) T cellen en testen hun differentiatie en functie in vitro en in vivo.

Productie van Chimerische antigeen receptor (auto) T cellen voor adoptie immunotherapie

Dit artikel beschrijft een protocol voor het genereren van antigeen-specifieke CD8 T-cellen, en de uitbreiding ervan in vitro, met als doel het opleveren van een hoog aantal functionele T-cellen voor gebruik in vitro en in vivo.

Zeer efficiënte generatie van antigeen-specifieke cytotoxische T-cellen voor de functionele test in een auto-immune diabetes model

Hier beschrijven we een protocol waarin een acuut lymfoblastische leukemiepatiënt-afgeleid xenograftmodel wordt gebruikt als een strategie om CD19-gerichte chimere antigeenreceptor T-cel-geassocieerde toxiciteiten te beoordelen en te monitoren.

Beoordeling van chimere antigeenreceptor T-celgeassocieerde toxiciteiten met behulp van een acuut lymfoblastische leukemiepatiënt-afgeleid xenograftmuismodel

Dit protocol stroomlijnt de productie van retrovirale vectoren en de transductie van T-cellen bij muizen, waardoor de efficiënte generatie van CAR-T-cellen van muizen wordt vergemakkelijkt.

Efficiënte generatie van muizen chimere antigeenreceptor (CAR)-T-cellen

Hier beschrijven we een methode voor het maken van dubbele emulsiedruppeltjes die één T-cel en een kankerdoelcel inkapselen om celdoding op eencellig niveau te onderzoeken. Deze methode maakt dubbele kwantificering mogelijk van zowel cytotoxische moleculen als apoptose van doelcellen binnen een grote populatie T-cellen.

Op druppels gebaseerde cytotoxiciteitstest om chimere antigeenreceptor-T-cellen op eencellig niveau te beoordelen

Gezien de beperkte xenotransplantaatmodellen die beschikbaar zijn om interacties tussen menselijke CART- en myeloïde cellen te bestuderen, hebben we in vitro en in vivo modellen opgesteld om de effecten van menselijke macrofagen op CART-cellen te begrijpen. Bevindingen kunnen mogelijk worden gegeneraliseerd om de rol van macrofagen in de micro-omgeving van de tumor te evalueren en macrofaaggerichte immunotherapieën te testen.

Onderzoek naar interacties tussen myeloïde cellen en CAR T-cellen in vitro en in vivo

Leer hoe u murine CD19 CAR T-cellen produceert via retrovirale transductie voor de behandeling van syngene A20 B-cel lymfoom in BALB/c muizen. Dit protocol vergelijkt lymfo-replete en lymfo-gedepleteerde omstandigheden.

Een Syngeneic B-cel lymfoom muismodel voor pre-klinische evaluatie van CD19 auto T cellen

Meer video's verkennen