Een zebravis Embryo Model voor In Vivo visualisatie en Intravital analyse van Biomaterial-geassocieerde goudhoudende Stafylokok infectie

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over hoe biomaterialen de gevoeligheid voor infectie beïnvloeden, hoe ze de progressie van dergelijke infecties beïnvloeden en hoe ze het immuunsysteem gedrag rond dergelijke biomaterialen in vivo beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een nieuw diermodel biedt dat in vivo visualisatie en intravitale analyse van biomaterieel-geassocieerde infecties mogelijk maakt. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang omdat de injectie van biomateriële microsferen een zeer delicate procedure is.

Om een bacterie-only suspensie te genereren, breng eerst vier naar vijf kolonies van de fluorescerende Staph aureus mCherry-stam, gekweekt op tryptische sojalandbouwplaten aangevuld met 10 microgram per milliliter chlooramfenicol in 10 milliliter tryptische sojabouillon aangevuld met chloramphenicol, voor groei in de mid-logaritmische groeifase bij 37 graden Celsius met schudden. Wanneer de cultuur een optische dichtheidsmeting bereikt op 620 nanometer van 0,4 tot 0,8, verzamel de bacteriën door centrifugatie en was de cellen twee keer met één milliliter steriele PBS per wasbeurt. Na de tweede wasbeurt, resuspend de pellet in 1,1 milliliter PVP, en vortex de bacteriële suspensie voor het meten van de optische dichtheid weer.

Pas vervolgens de concentratie van de bacteriële suspensie aan met PVP volgens de experimentele vereisten om de ënsuspensie alleen voor bacteriën te genereren. Om een bacterie microsfeer suspensie te genereren, centrifuge commerciële polystyreen microsferen, PS-10, en resuspend de microsfeer pellet in de bacteriën-only suspensie. Verdun de microsfeersuspensie van de bacteriën met een 1/2 volume PVP om een geschikte concentratie van bacteriën in de suspensie te bereiken die ongeveer 2/3 van die in de bacteriën-slechts suspensie is.

Meng de suspensie door vortexing. Om de concentratie van de bacteriën-only en bacteriën microsfeer suspensie te controleren, voeg 100 microliters van elke suspensie aan individuele putten van een 96-put plaat. Verdun serieel 10 microliter aliquots van de suspensies in 90 microliter van steriele PBS in volgende putten, met behulp van verse tips voor elke verdunningsstap.

Breng dubbele 10-microliter aliquots van de onverdunde en verdunde bacteriële suspensies aan op agarplaten en broed de platen 's nachts bij 37 graden Celsius uit. De volgende ochtend, tel de kolonies om het aantal bacteriën te berekenen binnen de voorbereide bacteriën-only en bacteriën microsfeer suspensies. Na het verzamelen van de zebravis embryo's, gooi alle niet-transparante niet-levensvatbare embryo's, en incuberen ongeveer 60 embryo's per 100-milliliter petrischaaltje op 28 graden Celsius in verse E3 medium.

Na anesthesie, sequester de GFP-positieve embryo's voor fluorescentie microscopie. Breng ze naar een petrischaaltje van 100 milliliter van E3-medium. Om een spuitgietvorm te maken, vul een petrischaaltje van 100 milliliter met één tot 1,5% vloeibare agarose.

Gebruik een plastic mal sjabloon om groeven te maken in de agarose. Wanneer de agarose is gestold, verwijder de mal, en bedek de agar met E3 medium aangevuld met 0,02%tricaine. Op een dag drie na de bevruchting, gebruik tangen om het puntje van een getrokken glazen microcapillaire naald te breken om tips te bereiken met een ongeveer 20 micrometer buitendiameter onder een lichtmicroscoop met een schaal bar in de oculaire.

De aanpassing van de opening van de naaldpunt is praktisch voor het injecteren van microsferen. De diameter van de opening moet worden aangepast voor microsferen van verschillende grootte. Gebruik vervolgens een Microloader pipettip om de naald te laden met ongeveer 20 microliters van de bacterie microsfeer of bacteriën-only suspensie, en monteer de naald op een micromanipulator aangesloten op een micro-injector.

Breng nu de geselecteerde embryo's over naar de gegroefde agaroseplaat. Na vijf minuten wachten op de embryo's te zijn verdoofd, uitlijnen van de embryo's in de groeven in een enkele oriëntatie voor hun injectie. Stel de microinjector in op de juiste injectie-instellingen en steek de naald in het spierweefsel van het eerste embryo onder een hoek van 45 tot 60 graden onder een stereomicroscoop.

Beweeg de naald voorzichtig heen en weer om de positie in het weefsel zo nodig aan te passen en gebruik het microinjector voetpedaal om de geladen vering te injecteren. Bij het injecteren van een bacterie microsfeer suspensie in het weefsel van zebravis embryo's, moet de naald voorzichtig worden ingebracht, maar met een vaste hand. Na een succesvolle inbreng moet er voor de injectie een ruimte voor de materialen worden gecreëerd.

Wanneer alle embryo's zijn geïnjecteerd, score de embryo's voor een succesvolle injectie onder een stereo fluorescentie microscoop, en onderhouden van de embryo's in E3 medium zonder tricaïne in individuele putten van 48-well platen met dagelijkse medium veranderingen. Om de infectieprogressie door kolonievormende eenheid kwantificering te controleren, breng je vijf tot zes levensvatbare geïnfecteerde embryo's kort na de injectie willekeurig over in individuele twee milliliter microbuisjes en was je de embryo's voorzichtig met steriele PBS. Na het weggooien van de wasbeurten, voeg 100 microliter steriele PBS aan elke buis, gevolgd door twee tot drie steriele twee-millimeter-diameter zirconia kralen.

Plet vervolgens de embryo's in een homogenisator bij 3,500 tpm gedurende 30 seconden en kweek het homogenaat zoals aangetoond. Plaats een 100-millimeter petrischaal met E3 medium aangevuld met 0,02%tricaine op een stereo fluorescentie microscoop stadium, en voeg 500 microliter van 2%methylcellulose in de Petri schotel. Om de voortgang van de infectie door fluorescentiemicroscopie te volgen, de juiste heldere-veld en fluorescerende filters uit te rusten, lijn de verdoofde geïnfecteerde embryo's horizontaal in een plek van methylcellulose in een petrischaal.

Gebruik het heldere veldfilter om het beschadigde geïnjecteerde weefsel in beeld te brengen bij een vergroting van 160x. Stel de Z-stack diepte in op 10 micrometer en de stapgrootte op vijf micrometer om de opname van drie opeenvolgende beelden mogelijk te maken. Beeld vervolgens de afzonderlijke embryo's onder identieke geoptimaliseerde instellingen bij een vergroting van 160x.

Gebruik de ObjectJ-plug-in in ImageJ om de afbeeldingen te analyseren. Intramusculaire injectie van Staph aureus initieert een dosisafhankelijke infectie in embryo's, waarbij de levensvatbare infectieprogressie waargenomen wordt in embryo's die op dag één en twee na de injectie hoge-uitdagingsdoses toegediend kregen. Zoals aangetoond, is het mogelijk om vergelijkbare aantallen bacteriën te injecteren in de aanwezigheid of afwezigheid van microsferen.

Typisch, alle embryo's met meer dan 20 kolonie-vormende eenheden van Staph aureus mCherry zijn positief voor fluorescentie onder microscopische score, hoewel de aanwezigheid van microsferen lijkt niet significant invloed op de infectie progressie in de lage dosis embryo's. In hooggedoseerde uitgedaagde embryo's toont microscopisch scoren geen verschillen in geïnfecteerde embryofrequentie met of zonder microsferen, maar kwantitatieve cultuur onthult hogere kolonievormende eenheidsnummers die zijn opgehaald uit embryo's in de Staph aureus plus microsfeergroep in vergelijking met die welke twee dagen na de injectie uit de Staph aureus-only groep zijn geoogst. De aanwezigheid van een biomateriaal beïnvloedt zowel de immuuncelrespons als de aanvankelijke gevoeligheid voor infectie.

Bijvoorbeeld, op vijf uur na injectie, de macrofaag infiltratie in reactie op een Staph aureus-only injectie is aanzienlijk hoger dan in reactie op een Staph aureus plus microsferen injectie, terwijl op een dag na de injectie, de embryo's met microsferen vertonen aanzienlijk hogere niveaus van Staph aureus infectie dan de embryo's zonder microsferen. Het is belangrijk om te onthouden om altijd de opening van de naaldpunt aan te passen aan de grootte van de biomaterialen en om de verhouding van de bacteriënconcentratie in de bacteriën-only suspensie en de bacteriën microsfeersuspensie aan te passen. Dit zebravis embryomodel maakt de in vivo visualisatie en de intravitale analyse van de infectieprogressie en de uitgelokte immuuncelreacties in de aanwezigheid en afwezigheid van biomaterialen mogelijk.

Deze techniek biedt een nieuw model voor het hele dier voor de ontwikkeling van antimicrobiële biomaterialen en behandelingsstrategieën voor veilige medische hulpmiddelen.