Mechanismen die ten grondslag liggen aan de Gut hormoon afscheiding met behulp van de geïsoleerde geperfundeerd Rat dunne darm

De methode die we hier hebben ontwikkeld is zeer nuttig gebleken in ons werk, in een poging om de moleculaire mechanismen van afscheiding van hormonen uit de darm, maar ook de absorptie van voedingsstoffen, en de koppeling tussen de twee te achterhalen. Het belangrijkste voordeel van deze zeer fysiologische techniek is dat de darm in situ wordt gelaten, terwijl gedetailleerde studies worden toegestaan die gewoonlijk alleen worden uitgevoerd binnen In Vitro-modellen. Plaats de rat eerst op een verwarmde operatietafel, bevestig een gebrek aan respons op teensnuifje en maak een huid- en buikvliesexcisie om de buikholte bloot te leggen.

Verplaats de dunne darm naar de zijkant om het terminale gebied van de dikke darm bloot te leggen. En ligate de leverende vasculatuur aan de dikke darm. Geleidelijk extraheren van de dikke darm, vanaf de terminale regio, en bewegen naar de dunne darm, hydrateren van het weefsel met isotone zoutoplossing, en met behulp van wattenstaafjes om het bindweefsel te verwijderen als dat nodig is.

Wanneer alle van de dikke darm is verwijderd, steek een 15 centimeter stuk plastic buizen in het proximale uiteinde van de kleine darmlumen, en zet de slang met hechtingen. Gebruik vervolgens een spuit van 10 milliliter en een spuitpomp om de dunne darm zorgvuldig te spoelen met ruimtetemperatuur isotone zoutoplossing met een stroomsnelheid van 25 milliliter per minuut. Wanneer het weefsel is geleegd van chyme, pas de weefsels zo aan dat de bovenste mesenterische slagader toegankelijk is en verwijder het bindweefsel en het vetweefsel om de slagader bloot te leggen.

Gebruik fijne punt tangen om twee hechtingen onder de mesenterische slagader en twee hechtingen onder de poort ader. Vul een plastic 22-gauge katheter bevestigd aan een rollende pomp met perfusie buffer en gebruik een paar chirurgische schaar om een klein gaatje in de mesenterische slagader te snijden, onmiddellijk het inbrengen van de katheter in de incisie. Steek de katheter binnen twee minuten na het snijden van een gat in de slagader, anders zal de darm waarschijnlijk last hebben van ischemische schade.

Zodra de katheter is bevestigd met een hechting, start de rolpomp om perfusie te starten met een stroomsnelheid van 7,5 milliliter per minuut. Wanneer de bloedvaten in de darm en portaal ader bleek worden, snijd een gat in de poortader. Steek een metalen katheter, en zet de metalen katheter met een andere hechting.

Let op bij het inbrengen van de katheter in de poortader, omdat de ader dun ommuurd is. Echter, als de bewaker wordt nu geperfundeerd, snelle invoeging is niet cruciaal. Na het verzamelen van de perfusie-output gedurende een minuut, meet het volume en klik op uitvoeren experiment in de druk opname programma om de perfusie druk acquisitie opnames te starten.

Bedek vervolgens de darm met een bevochtigd labweefsel om te voorkomen dat het uitdroogt, en bevestig dat het distale uiteinde van de darm niet wordt geblokkeerd en een luminale haploïde kan uitstappen. Om de gedeeltelijke druk van zuurstof en kooldioxide te meten, verzamelt u de perfusiebuffer via een drieweg stop-cockklep vlak voordat het het orgaan binnenkomt, na ongeveer drie minuten perfusie en vanaf de katheter die in de poortader wordt ingebracht. Plaats de monsters op ijs, en gebruik een geautomatiseerde bloedgas analyzer om de monsters kort na het verzamelen te meten.

Gebruik een fractieverzamelaar om de eerste basislijnmonsters te verkrijgen. Na 10 tot 15 minuten van baseline collectie, gebruik maken van een spuit pomp om de eerste intraarteriale test stimulerend middel beheren door middel van een drie-weg stop-haan op een 35 milliliter per minuut stroomsnelheid. Voer luminale stimulaties uit door een initiële stimulatie boa's injectie geleverd met een 2,5 milliliter per minuut stroomsnelheid over de eerste vijf minuten van de stimulatie, gevolgd door toediening van de testoplossing met 5 milliliter per minuut debiet.

Zodra een luminale stimulatieperiode voorbij is, spoelt u het lumen door met isotone zoutoplossing met een stroomsnelheid van 2,5 milliliter per minuut gedurende vijf minuten. Verzamel vervolgens basislijnmonsters met 5 milliliter per minuut gedurende 15 tot 30 minuten voordat de volgende teststof wordt toegediend. Aan het einde van het experiment, beheren van een geschikte, positieve controle om te testen op de responsiviteit van het preparaat gedurende vijf tot 10 minuten, verzamelen en extra 10 tot 15 minuten van baseline monsters aan het einde van de positieve controle stimulatie periode.

Hier wordt een voorbeeld getoond van gegevens van goede kwaliteit, die Glucagon-achtig peptide-1 of GLP-1 aantonen, afscheiding van een geïsoleerde doorgesnede rat dunne darm verzameld met een minuut intervallen. Onder basale omstandigheden was de afscheiding stabiel, terwijl zowel voor als na toediening van de testprikkel en de positieve controle een robuuste secretoire respons zichtbaar was. Deze GLP-1 afscheidingsgegevens verkregen uit een geïsoleerde geperfundeerde rat dunne darm zijn van slechte kwaliteit met een onstabiele afscheiding gemeten onder basale omstandigheden die naar boven dreef tijdens het testen op een manier die leek te zijn los van de teststof administraties of de positieve controle.

Het is daarom onmogelijk om te concluderen of de verhoogde GLP-1 secretie waargenomen aan het einde van de vasculaire fructose stimulatie was een fructose gemedieerde reactie. Terwijl het proberen deze procedure om de zorg om de katheters goed te beveiligen en om de perfusieapparatuur grondig schoon te maken aangezien de perfusiebuffer een uitstekend middel voor bacteriële groei verstrekt. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals In Vitro-studies over hormoonafscheidende cellijnen van primaire darmcelculturen worden uitgevoerd om de intracellulaire productie van cyclisch AMP of intracellulair calcium direct te onderzoeken.

We hebben de methode nu al gebruikt voor opheldering van een aantal processen achter de opname van voedingsstoffen en het mechanisme van afscheiding van de hormonen en het is uiterst nuttig gebleken. Vergeet niet dat het werken met blokkers of activators van moleculaire sites zeer gevaarlijk kan zijn en voorzorgsmaatregelen zoals het gebruik van een labjas, handschoenen en veiligheidsbril, een rookkap moet altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.