Visualisering en opvolging van endogene Mrna's in levende Drosophila melanogaster Eier kamers

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het RNA-biologieveld over het mechanisme en de functie van gepolariseerde RNA-lokalisatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het zorgt voor de real-time visualisatie van endogene RNA-handel in levende weefsels. De implicaties van deze techniek uit te breiden tot de therapie van RNA-gerelateerde ziekten, omdat het een potentieel heeft om nieuwe therapeutische doelen te ontdekken.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in RNA-processen in de fruitvliegeierenkamer, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals in zebravissen of kweekcellen. Over het algemeen, individuen nieuw op deze methode zal worstelen vanwege de uitdagingen in verband met het ontwerp en de levering van de moleculaire baken rekwisieten. Voor moleculaire bakenmicroinjectie, selecteert u de 40X olie doelstelling en monteer een coverslip met de ontleed eikamer op de microscoop stadium.

Zoek een eikamer in het midden tot laat ontwikkelingsstadium dat goed is gericht op microinjectie. Zet vervolgens een microinjector op met de juiste injectie- en compensatiedruk. Met behulp van de micro manipulator joystick, zachtjes lager een naald geladen met een microliter van moleculaire baken oplossing in de oliedruppel.

Breng de tip in beeld naar de periferie van het gezichtsveld. Voer een schone functie uit om de lucht uit de naaldpunt te verwijderen en ervoor te zorgen dat er stroom uit de naald is en breng de naald naar de thuispositie. Focus op de eikamer te worden microinjected en breng de naald terug in focus in de buurt van de rand van de eikamer.

Voer een fijne aanpassing van de z-positie van het doel zodanig uit dat het membraan dat de follikelcellen scheidt van de verpleegcellen scherp is. Steek de naald in een verpleegstercel voor injectie van de moleculaire bakens over een periode van twee tot vijf seconden. Om reproduceerbaar microinjectie succes te garanderen, zorgvuldig richten op het membraan scheiden van de follikel cellen en de verpleegkundige cellen die zullen worden geïnjecteerd, terwijl het brengen van de punt van de naald in focus met de micro manipulator.

Wanneer alle moleculaire bakens zijn geïnjecteerd, verwijder voorzichtig de naald en trek deze naar de thuispositie. Verander de doelstelling naar de gewenste vergroting voor beeldverwerving. Focus dan op de eierkamer onder de nieuwe doelstelling en begin met de beeldaanwinst.

Open de beelden in Afbeelding J.Gebruik de converteren naar ICY-gereedschap om de beelden terug te zetten naar ICY voor spotdetectie van de moleculaire bakens. Een schaalbalk wordt automatisch op de stapel gelegd. Bewerk de schaalbalk indien nodig via het controlevenster.

Activeer vervolgens het oogpictogram voor de schaalbalk onder het tabblad laag om de schaalbalk uit de oorspronkelijke stapel te verwijderen. Selecteer detectie en tracking, detectie en spotdetector en bevestig de huidige sequentie-invoerdetectie en kanaalnul zijn geselecteerd voor respectievelijk de invoer- en voorbewerkingsparameters. Voor detector, selecteer detecteren lichtpunt boven donkere achtergrond met behulp van kracht gebruik van 2D golflengten voor 3D alleen als er niet genoeg z-segmenten in de stapels om de analyse uit te voeren.

Selecteer schalen en gevoeligheid voor elke schaal door meer schalen toe te voegen voor grotere plekken en bevestig dat het interessegebied van de reeks is ingesteld op het gebied van belang. Controleer voor het filteren of er geen filtering is ingesteld en selecteer de juiste bestandsindeling onder uitvoer. Als de resultaten van de spotdetector moeten worden gebruikt voor het bijhouden van analyses, selecteert u exporteren naar het zwembad.

Herhaal voor colocalisatieanalyse de spotdetectie voor het andere kanaal. Als u de moleculaire bakenvlekken wilt volgen, selecteert u detectie en tracking, tracking, spot tracking en voert u de spotdetector uit met dezelfde parameters als voor de spotdetectie. Klik op schattingsparameters en selecteer de gewenste doelbeweging in het pop-upvenster voor parameterschatting.

Klik vervolgens op tracking uitvoeren. Als u de tracks wilt visualiseren, selecteert u detectie en tracking, tracking en track manager. Selecteer voor de bek rupsprocessor een kleur voor de tracks inschakelen en selecteren.

Selecteer bij het toevoegen van de trackprocessor de optie processortijdclip bijhouden. Voer in het controleclippervenster het aantal detecties in dat voor en na het huidige tijdspunt moet worden weergegeven. Sla de trackinformatie op als een XML-trackbestand en gebruik het camerapictogram om een screenshot van de resultaten te verkrijgen.

Als u de stapel langs de z-richting wilt projecteren, gebruikt u de zoekbalk om de plug-in te vinden en selecteert u maximale projectie in het vervolgkeuzemenu. Selecteer in het venster controle het volgordetabblad, het canvas en de rotatie om de afbeelding aan te passen aan de gewenste richting en een screenshot van de geroteerde afbeelding te verkrijgen. Selecteer vervolgens interessegebied, 2D-interessegebied, kies regio van belang vorm en selecteer het gebied van belang op de afbeelding voor bijsnijden.

Installeer de tijdstempel overlay-plugin en voeg een tijdstempel toe volgens de instructies in het pop-upvenster voor aanwijzingen over het plaatsen en opmaken van de tijdstempel. Als u het tijdsinterval wilt wijzigen of toevoegen, klikt u op bewerken in het venster reekseigenschappen. Activeer het oogpictogram om de schaalbalk onder het tabblad laag in het venster van de controle weer toe te voegen.

Verkrijg vervolgens een screenshot van de getijdenstempelresultaten en sla de afbeelding op in zowel TIFF- als AVI-indelingen. Met behulp van deze methode zoals aangetoond, is het mogelijk om de transport- en lokalisatiepatronen van endogene mRNAs te visualiseren via moleculaire bakens in verschillende stadia van oogenese en in het bijzonder op en na het midden van oogenesis. Wanneer individueel geïnjecteerd in hetzelfde stadium eikamers, verschillende oskar specifieke moleculaire bakens presenteren hetzelfde patroon van lokalisatie.

Moleculaire bakens geïnjecteerd in het cytoplasma van een verpleegster cel zal vrij verspreiden in aangrenzende verpleegcellen en in de eicel. Zo zijn de bakens in staat om te hybridiseren met hun doelen en het genereren van fluorescentie signalen op andere locaties dan de micro-injectie site. In oskar GFP transgene eierkamers in het midden van oogenesis, analyse van de verwerving gegevens toont uitgebreide colocalisatie voor de fluorescentie signaal van genetisch gemanipuleerde GFP gelabeld oskar mRNA met de fluorescentie signaal gedetecteerd met behulp van moleculaire bakens.

Bovendien kunnen 5D-stapels verder worden geanalyseerd om oskar mRNA-trajecten te bepalen voor langeafstandstransport in zowel verpleegcel als eicelcytoplasma. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van RNA-biologie om endogene moedermRNA-transport en lokalisatie in de Drosophila-eierkamer te verkennen.