LDL Cholesterol opname Assay met behulp van levende cellen Imaging analyse met mobiele gezondheidsmonitoring

We presenteren een methode voor live beeldanalyse van LDL cholesterol opname in verschillende menselijke celtypes. Dit maakt het mogelijk om te screenen op verbindingen, die het transport van LDL-cholesterol wijzigen. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van live celbeeldvorming voor LDL influx kwantificering, is dat het mogelijk maakt monitoring celmorfologie gedurende de test duur, dus potentieel de giftige verbindingen kunnen worden gedetecteerd.

Om te beginnen, aspirate de media uit de eerder voorbereide cellen, en was de cellen met 5 milliliter van fosfaat Dulbecco's gebufferde zoutoplossing. De DPDS aanzuigen. Voeg naast het loskoppelen van de cellen van de 100 millimeter schotel 1,5 milliliter van 0,25%Trypsin-EDTA voor de HepG2 cellen, en voeg 1,5 milliliter van 0,05% Trypsin-EDTA oplossing voor de HK2 cellen, of de HCAECs.

Incubeer de platen op 37 graden celsius gedurende vier minuten. Neutraliseer vervolgens de Trypsin door 3 milliliter complete media toe te voegen voor de HepG2- en HCAEC-cellen. Gebruik 3 milliliter van de Trypsine neutraliserende oplossing, breng de DPDS in gevaar met 5%foetaal runderserum of FBS voor de HK2-cellen.

Breng de cellen in 15 milliliter conische buizen, dan centrifugeren de buizen op 250g gedurende vijf minuten. Na de spin, aspirate de media, en resuspend de cel pellet in volledige media. Filter de suspensie van de cellen voorzichtig door een 40 micron mesh zeef om celklonen op te breken.

Tel de cellen en plaat ze in een geoptimaliseerde dichtheid in een 24-well plaat. Incubeer de plaat 's nachts bij 37 graden celsius om de cellen te hechten. De volgende dag, verander de cel media naar de basis media zonder FBS voor de cellijn, plus 5% lipoprotein tekort serum, of 2% FBS media.

Gebruik 500 microliters van totale media per put in een 24-well plaat. Ga vervolgens 24 uur verder met de incubatie om de cellen te verhongeren. Samen met de hongerstap of de volgende dag kunnen cellen worden behandeld met de gewenste verbindingen en de juiste controles.

Voeg 24 uur na de honger 5 microliter pHrodo rood gelabeld LDL toe aan elke put met 500 microliter media om een uiteindelijke concentratie van 10 microgram per milliliter te verkrijgen. Verwijder voorzichtig eventuele bubbels uit de putten. Plaats de plaat onmiddellijk na het toevoegen van de gelabelde LDL in de incubator van het livecelanalysesysteem en laat de plaat gedurende 15 minuten equiliberen om condensatie in de plaat te verminderen.

Terwijl de cellen uitbroeden, open de software en plan de scan door het vat dat de plaat vasthoudt toe te voegen. Afbeelding 16 beelden per put, voeg een uur intervallen op 10x vergroting voor vier uur met behulp van de rode en fase kanalen. Maak vervolgens een plaatkaart om te gebruiken voor gegevensverwerking, selecteer het tabblad Eigenschappen en kies de plaatkaart.

Voer het celtype in het tabblad cellen en behandelingen in de samengestelde tik in. Klik vervolgens op het tabblad Regio's, selecteer elke set replica's en wijs regio's toe. Zodra een experimentele run is voltooid, maakt u een afbeeldingsset in de software om de computer te trainen om elke parameter in de telset te kwantificeren.

Open in de software de plaatweergave en kies vervolgens in het vak analysetaakprogramma's maken of toevoegen aan de afbeeldingsverzameling. Selecteer een nieuwe afbeeldingsverzameling, typ een naam voor de afbeeldingsverzameling en kies de rode en fasekanalen door de vakjes naast de kanalen aan te vinken. Selecteer nog vijf afbeeldingen uit verschillende putten en tijdstippen en voeg ze toe aan de afbeeldingsverzameling door toe te voegen aan de huidige afbeeldingsverzameling.

Kies in het vak hulpprogramma's voor analysetaak de optie nieuwe verwerkingsdefinitie, selecteer de afbeeldingsverzameling in het vervolgkeuzemenu en voert de parameters voor het type cellen in. Gebruik in het voorbeeldvak het vervolgkeuzemenu om een voorbeeld van alles te selecteren. Schakel in het vak analysemasker het samenvloeiingsmasker en de vakken van het rode objectmasker in om het gebied in de analyse voor de verwerkingsdefinitie weer te geven.

Blader door de afbeeldingsverzameling om ervoor te zorgen dat de cellen en LDL in het masker zijn opgenomen. Selecteer bestand en sla de verwerkingsdefinitie op. Open vervolgens de experimenteerplaatweergave om de set afbeeldingen van de experimentele run te analyseren.

Kies in het vak hulpprogramma's voor analysetaak de optie Nieuwe analysetaak starten en selecteer de opgeslagen verwerkingsdefinitie. Geef de analysetaak een naam, kies het tijdsbereik voor analyse en markeer de experimentele putten die u moet analyseren. Selecteer de startknop.

Zodra de analysetaak is voltooid, exporteert u de gegevens, selecteert u de voltooide analyse en drukt u op de weergave. Kies in het menu hulpprogramma's de export van metrische grafieken. Kies in het menu regio's alle putten en in het groepsmenu om de gemiddelde waarde voor elke set putten als groep te verkrijgen, kiest u repliceert.

En voor het exporteren van de individuele waarden voor elke put, kies er geen. Kies in het menu rode objectmetrische optie de totale geïntegreerde intensiteit van het rode object. Selecteer de knop Gegevens exporteren.

Controleer de opsplitsende gegevens in afzonderlijke afbeeldingen. De gegevens worden automatisch gekopieerd op een klembord en kunnen worden geplakt op een nieuw spreadsheetbestand. Kies in het metrische menu faseobject de samenvloeiing en klik vervolgens op de knop Gegevensexport.

Controleer op het tabblad Prompt de gegevens opsplitsen in afzonderlijke afbeeldingen. De gegevens worden automatisch gekopieerd op een klembord en kunnen worden geplakt op het spreadsheetbestand met totale geïntegreerde intensiteitsgegevens van rode objecten. Nu kunnen de geëxporteerde gegevens worden genormaliseerd, volgens de stappen 4.1.7 en 4.1.8 van het protocol, om een definitieve LDL-opnamewaarden te verkrijgen.

Na behandeling met Dynasore of recombinant PCSK9 vertoonden alle drie de geteste menselijke cellijnen een aanzienlijke afname van de LDL-instroom gedurende een tijdscursus van vier uur. De LDL instroom verminderd in menselijk levercarcinoom of HepG2 cellen, met behandeling van Dynasore in de loop van de tijd, in vergelijking met de cellen behandeld met DMSO als een controle. Live celbeeldvorming van de LDL-instroom in HepG2-cellen op verschillende tijdstippen toonde een toename van de LDL-opname na behandeling met Simvastatine ter ondersteuning van de gevoeligheid van deze methode om significante veranderingen in de LDL-instroom te detecteren.

Real-time beelden onderzocht op het eerste tijdstip en het eindpunt, bevestigen de normale morfologie van de cellen na de behandeling met Dynasore, wat de effectiviteit en de veiligheid van deze verbinding aangeeft. Na het toevoegen van verdere rode gelabelde LDL aan de cellen om het te behouden fluorescerende activiteit, is het belangrijk om de plaat te beschermen tegen licht totdat het wordt geplaatst in de live cel imaging systeem incubator. Cellen van verschillende organen kunnen anders reageren op behandelingen, wat betekent in tegengestelde richtingen, of ze kunnen reageren in dezelfde richtingen, maar tonen verschillende tarieven van verandering in cholesterolopname.

Alleen met de live celbeeldvorming kunnen dergelijke verschillen worden gedetecteerd en nauwkeurig worden gekwantificeerd.