Vaststelling en analyse van Tumor segment Explants als een voorwaarde voor het kenmerkende testen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in preklinisch onderzoek, waar drug response studies in tumor slice explants diagnostische doeleinden kunnen dienen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat slice explants voor een korte tijd de complexe biologie van inheemse weefsels kunnen modelleren, inclusief ruimtelijk gedistribueerde functies. Hoewel deze methode inzicht kan geven in het gebruik van plakjes van murine longtumoren, kan het ook worden toegepast op andere weefseltypen, waaronder menselijke weefsels.

Om te beginnen moet u de vibratome voorbereiden en een VibraCheck uitvoeren volgens de instructies in de handleiding. Vul vervolgens elke put van de 24-put plaat met een milliliter van Hank's Balanced zout oplossing aangevuld met penicilline en streptomycine en houd de plaat op ijs. Steek 25-gauge naalden in alle vier poten van een geëuthanaseerde muis geplaatst op een piepschuim deksel, zodat de borst wordt blootgesteld en het dier wordt uitgerekt.

Spray 70% alcohol op het oppervlak van de blootgestelde huid. Gebruik schaar geplaatst in een schuine positie om open te snijden de huid van de buik naar de borst en tot aan de nek regio. Strek de huid aan weerszijden met tangen en steek 25-gauge naalden.

Snijd de buikstreek open. Snijd vervolgens de ribbenkast en het middenrif open om de long en het hart bloot te leggen. Bloot de luchtpijp door het wegsnijden van het omliggende weefsel.

Ontleden de longen, samen met het hart. Plaats de weefsels in een buis van 50 milliliter met 30 milliliter ijskoude HBSS aangevuld met Pen-Strep geplaatst op ijs en ga zo snel mogelijk naar de volgende stap. Breng nu de tumordragende longen over naar een weefselkweekplaat van 10 centimeter.

Gebruik steriele schaar en tangen om de longkwabben te scheiden en selecteer lobben met tumoren op het oppervlak voor het snijden. Plaats een longkwab met een tumorweefsel op een stuk filterpapier om te voorkomen dat uitglijden en uitgesneden een deel van de normale long of extra tumorweefsel dat de tumor omringt met behulp van een steriele scalpel om een plat weefsel stuk oppervlak te genereren. Dompel de platte kant in een druppel cyanoacrylaat lijm en monteer het op de vibratome specimen houder, zodat de tumor geconfronteerd met het blad in een rechte positie, en laat het drogen voor twee tot drie minuten.

Plaats de vibratome specimen houder in de metalen buffer lade. Vul de lade met koude HBSS aangevuld met Pen-Strep totdat het weefsel wordt ondergedompeld in de buffer. Bedek de bufferlade met het plexiglasdeksel dat is voorzien van het instrument en plaats de lade in een wit ijsbad en voeg ijs toe om het weefsel koel te houden tijdens het snijden.

Bevestig het witte ijsbad aan het vibratome. Selecteer vervolgens geschikte snijinstellingen en begin met snijden. Breng het vibratomeblad naar de snijpositie en stel het snijraam in.

Gebruik steriele tangen om de plakjes te verzamelen in een 24-put plaat gevuld met een milliliter HBSS aangevuld met Pen-Strep per goed en houd op ijs. Terwijl u de snijvolgorde bijhoudt, markeert u elke put van de 24-putplaat volgens het experimentele plan. Verzamel een weefsel slice grenzend aan de gekweekte plakjes als een nul uur of onbeschaafde referentie.

Verzamel ten minste drie referentiesegmenten om de bovenkant, het midden en de onderkant van het weefsel te vertegenwoordigen. En zodra het snijden is voltooid, doorgaan met de vaststelling en verwerking. Bereid daarna een zes-put plaat met 2,5 milliliter cultuurmedium per put door het plaatsen van titanium roosters in.

Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden gevormd tussen het titanium rooster en het medium. Om een plak op het rooster te laden, houdt u de zes-put plaat in een schuine positie, zodat een deel van het medium het rooster bedekt. Plaats vervolgens het segment in het medium op het rooster en gebruik tangen om het te verspreiden.

Laad na het plaatsen van de plakjes de zes-putplaten op de roterende incubatieunit die in een bevochtigde couveuse wordt geplaatst die bij 95%02 en 5% CO2 wordt gehandhaafd. Start de rotatiecyclus. Voor langdurige teelt vul het kweekmedium elke dag aan door steriele tangen te gebruiken om het rooster met de weefselschijfjes op te tillen en in een lege put van de zesputtenplaat te plaatsen.

Vervang 70% van het medium door vers cultuurmedium en plaats het raster er weer in. Doorgaan met de rotatiecyclus zoals voorheen. Voor medicamenteuze behandeling op de tumor plakjes voeg 2,5 milliliter media met de verdunde drug of voertuig controle in de zes-put plaat.

Plaats de titanium roosters in de putten en plaats de plakjes op de roosters zoals eerder gedaan. Na het uitvoeren van de behandelingen gedurende 24 uur, blijven met de vaststelling en verwerking. Om te beginnen met de vaststelling van de gewenste plak zorgvuldig overbrengen met behulp van tangen in een 10-centimeter plaat met een geweekt filter papier gevuld met twee tot drie milliliter PBS en laat het drijven.

Til vervolgens het filterpapier met een paar tangen op en plaats het in een histo cassette. Zet het filterpapier in een histo cassette. Voeg een druppel verdunde hematoxylin op de top van het weefsel slice om de positie van de slice voor de volgende stappen te markeren.

Sluit de cassette en breng deze over in een 4% neutrale gebufferde formalin-oplossing en laat 's nachts op vier graden Celsius. Na het wassen en verwerken van de cassette zoals beschreven in het protocol, open je de histocassette en gebruik je een scalpel om het vaste plak voorzichtig uit het filterpapier te tillen. Gooi het filterpapier weg en breng het plakje over in een mal met vloeibare paraffine.

Gebruik een vlak gewicht om het weefsel tegen de bodem van de inbeddingsvorm te drukken om zelfs sectie te verzekeren. Leg het onderste deel van de histo cassette op de top van de mal. Voeg vloeibare paraffine op de top van het.

En laat de mal afkoelen op een koude plaat voor 30 minuten. Daarna scheiden de gekoelde schimmel van de paraffine blok. Gebruik een microtome voor te bereiden vier-micrometer dunne delen van de FFPE weefsel slice blokken.

Trim weg de overmaat van paraffine rond het weefsel. Om gelijkmatige secties in het weefsel te verkrijgen, pas de hoek van het blok aan, zodat het oppervlak van het blok horizontaal is gericht ten opzichte van het blad. Met behulp van een dunne borstel verzamelen sequentiële weefselsecties van de paraffine-ingebedde weefsel slice vanaf het bovenste deel van de glazen dia's.

Ga verder met het verzamelen van de delen van de diepere weefsellagen naar het midden, gevolgd door het onderste deel van de glazen dia's. Het verzamelen van secties van verschillende lagen van elk weefselsegment tot de objectdia's wordt gedaan om potentiële door cultuur geïnduceerde gradiënten in levensvatbaarheid, celmigratie of biomarkerexpressie vast te leggen. Na het verzamelen van de secties blijven met hun verwerking en verdere analyse zoals beschreven in het protocol.

Weefsel slice dikte kan invloed hebben op de levensvatbaarheid van gekweekte plakjes. In dit geval, 250-micrometer dikke plakjes tonen verhoogde necrose gradiënten in vergelijking met 200-micrometer dikke plakjes als gevolg van dikkere plakjes steeds gevoelig voor tekorten in zuurstof of nutriënten diffusie over de plakjes. Echter, 160-micrometer dunne plakjes bevatten grote necrotische gebieden waarschijnlijk veroorzaakt door technische behandeling tijdens de positionering van de plakjes als deze zijn kwetsbaar en hebben de neiging om te krullen.

Analyse van NKX2-1, een marker van goed gedifferentieerd longadenocarcinoom, toont aan dat de expressie ervan niet significant is veranderd in gekweekte plakjes in vergelijking met nul uur onbeschaafde plakjes. Kwantitatieve analyse van NKX2-1 expressie bevestigde verder dat de uitdrukking niet significant was veranderd in gekweekte versus onbeschaafde plakjes, wat suggereert dat het teeltproces de differentiatiestatus van adenocarcinoomweefsel niet zichtbaar beïnvloedt. Om te testen of de plakjes van het tumorweefsel kunnen worden gebruikt om de werkzaamheid van gerichte geneesmiddelen te evalueren, werden ze behandeld met DMSO of getitreerde hoeveelheden verbindingen.

Wanneer behandeld met een micromolar dactolisib die zich richt op de mTOR-route fosforylatie van 4EBP1 werd geremd. 0,5 micromolar selumetinib die zich richt op de MAP kinase route was effectief in het remmen van de fosforylatie van ERK1/2. Na het bekijken van deze video moet je een goed begrip van hoe om te werken met en kritisch analyseren plakjes vers gesneden uit kostbare tumorweefsels.

Onze voormalige postdoc, Katja Narhi, heeft in samenwerking met collega's van het IMI Predect Consortium Tissue Slice Platform een belangrijke bijdrage geleverd aan de totstandkoming van deze methode.