Analyse van Actomyosin dynamiek op lokale cellulaire en weefsel schalen met behulp van timelapse-films van gekweekte Drosophila Eier kamers

Ons protocol helpt wetenschappers om subcellulaire actomyosine netwerk in individuele epitheelcellen te analyseren en hen ook in staat stelt om soortgelijke analyse uit te voeren op meercellige schaal in gebogen epitheelweefsels. Ons protocol is een mooi voorbeeld van een Fiji-toepassing. Het heeft een intuïtieve grafische gebruikersinterface, en het vereist geen kennis van scripting.

Daarom is het zeer geschikt ook voor beginnende gebruikers in het veld. Hoewel onze methode is ontwikkeld voor Drosophila eierkamers, is het ook van toepassing buiten Drosophila epithelia. We moedigen wetenschappers aan om ons protocol te testen in hun modelsystemen.

Gebruik de begeleide testbestanden om vertrouwd te raken met dit protocol. Het zal u helpen om te beslissen welk deel van dit protocol geschikt is voor uw individuele onderzoeksvraag. Dit deel van het protocol stelt gebruikers in staat om epitheelcellen te segmenteren in time-lapse films en vervolgens actomyosinepulsen in individuele cellen te analyseren met behulp van de Surface Manager.

Open Fiji en importeer de macro TissueCellSegmentMovie. ijm zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Open vervolgens een tiff-bestand met bleekmiddel gecorrigeerd en splits de kanalen van het voor bleekmiddel gecorrigeerde bestand door naar de menubalk te gaan, Afbeelding te selecteren, gevolgd door Kleur en Gesplitste kanalen te selecteren.

Voer het geüploade script uit op het actieve celmembraankanaal van de geselecteerde time-lapse-film door op het pictogram Uitvoeren in het geopende script te drukken. Om een mooi celmasker te krijgen, stelt u de Gaussische onscherpte in op 2.500 en de gevoeligheid voor celdetectie op min één en klikt u op OK. Stel vervolgens de geschatte ruistolerantie in tussen 10 en 20 voor time-lapse-films die zijn aangeschaft met de doelstelling 63x en klik op OK. Een gegenereerd celmasker verschijnt in de geanalyseerde time-lapse film, een nieuw venster genaamd ParticleStack verschijnt en een klein venster genaamd Actie vereist verschijnt ook. Richt u zich in het celmasker op de timelapse-film alleen op cellen in het midden en selecteer cellen die volledige en goed gedefinieerde contouren kunnen bieden in de time-lapse-film.

Wanneer de geselecteerde cellen in het midden mooi overeenkomen met de echte celmembranen, sla Dan ParticleStack op als een TIFF-bestand. Open het overeenkomstige ParticleStack TIFF-bestand in Fiji. Open de plug-in met de Surface Manager-plug-in die in Fiji is geïnstalleerd.

Klik in Surface Manager op de knop Afbeelding lezen en stel de Jaccard-index in op 60%Het laden van de contouren kan enkele minuten duren, afhankelijk van het aantal cellen. Zodra deze cel is geladen, krijgt ze een S-nummer toegewezen en wordt deze weergegeven in het linkerdeel van het Surface Manager-venster. Klik op het geselecteerde S-nummer, zodat de geïmporteerde celcontour van ParticleStack1.

tiff verschijnt op de time-lapse film. Controleer elk geïmporteerd S-getal op celcontourkwaliteit in de film en verwijder ongewenste cellen die onjuiste celcontouren weergeven. Als u een ongewenste cel wilt verwijderen, markeert u de celomtrek en klikt u op de knop Verwijderen.

Gebruik het gereedschap Penseel om celcontouren te corrigeren. Sla de gecorrigeerde cellen op als RoiSet als u klaar bent. zip-bestand.

Om te bepalen of actomyosine pulsen aanwezig zijn in het geanalyseerde weefsel en om het gedetailleerde gedrag te begrijpen, evenals de directionaliteit van actomyosine signalen, beginnen met het openen van Fiji. Open een time-lapse film en laad de opgeslagen ParticleStack1. tiff-celmasker en de niet-gebleekgestuurde time-lapse-film en laad vervolgens de Surface Manager-plug-in en het bijbehorende interessegebied van de RoiSet.

zip-bestand. Activeer vervolgens in Surface Manager een kanaal met signalen van interesse. Klik op de knop Statistieken om het venster met de naam Gemiddelde grijze waarde Slice by Slice te verkrijgen.

De gemiddelde en mediane intensiteiten van de actomyosine signalen zullen worden weergegeven in de tijd in willekeurige eenheden, evenals andere parameters met betrekking tot het gebied en de vorm van de cel. Sla de waarden op als een spreadsheetbestand door naar het venster Statistieken te gaan, op Bestand te klikken en Opslaan als.Op dezelfde manier genereert u een celmasker en laadt u het in Surface Manager om actomyosinepulsen op de weefselschaal te analyseren. Dit deel van het protocol stelt gebruikers in staat om selectief een dunne laag actomyosine in het gebogen epitheelweefsel in de loop van de tijd te extraheren.

Deze stappen zijn gebruiksvriendelijk en gebaseerd op een intuïtieve grafische interface. Open Fiji en zorg ervoor dat de Ellipsoid Surface Projection-plug-in is geïnstalleerd. Open vervolgens een time-lapse-film en exporteer deze als een XML/HDF5-bestand door op Plug-ins te klikken, naar BigDataViewer te gaan en Huidige afbeelding exporteren als XML/HDF5-bestand te selecteren.

Open vervolgens het geëxporteerde bestand in Ellipsoid Surface Projection door naar Plug-ins te gaan, op BigDataViewer te klikken, gevolgd door Ellipsoid Surface Projection, en XML-bestand te selecteren. Hiermee wordt een nieuw venster geopend met sagittale weergaven van de eierkamer en verschijnt er een dialoogvenster om de gebruiker door verwerking te leiden. Het dialoogvenster, Ovariaprojectie genaamd, heeft verschillende tabbladen.

Definieer in het eerste dialoogvenster, het selectiekader genoemd, de x- en y-randen van een eierkamer in de time-lapse-film samen met de z-breedte van het selectiekader en druk op de set. De geselecteerde delen van de eierkamer zijn roze gemarkeerd. Definieer vervolgens de grootte van signaalklodders op het dialoogvenster met de naam zoekklodders in het venster Projectie van eierstokken.

Definieer de sigma en de minimale piekwaarde. Druk vervolgens op compute om de actomyosinesignalen te identificeren, die worden weergegeven als groene blobs. Probeer deze stap opnieuw met verschillende parameters totdat er ongeveer 100 plekken zijn gevonden.

Het identificeren van de actomyosine signalen is een cruciale stap. Het hangt af van de signaalkwaliteit en de juiste grootte van de gedetecteerde blobs. Als er geen zichtbare groene vlekken in de afbeelding zijn, werkt de volgende stap niet.

Ga verder met het tabblad fit ellipsoïde om de ellipsoïde te ontwerpen. Stel willekeurige monsters in op 10,000, de buiten/binnen cutoff-afstand op één tot 10 en klik vervolgens op berekenen. Hierna wordt het tabblad projectie automatisch geopend en wordt de definitie van de oppervlakteextractie mogelijk.

Stel in het projectietabblad een minimale en maximale projectieafstand in als de breedte van de gewenste ellipsoïde. De minimale en maximale projectieafstand moet passen, zodat het roze gedefinieerde ellipsoïdegebied de gehele buitenlaag van de eierkamer omvat. Definieer vervolgens de segmentafstand als één.

Zorg ervoor dat het roze gebied van de ellipsoïde met de gedefinieerde op de eierkamer zichtbaar is voordat u op compute drukt. Het helpt om de kwaliteit van een nieuwe ellipsoïde pasvorm te evalueren. Stel vervolgens een uitvoerbreedte van de ellipsoïde in op meer dan of gelijk aan 800 en een hoogte die groter is dan of gelijk is aan 400.

Stel vervolgens de duur van de oppervlakte-extractie in en kies een bolvormige of een cilindrische projectie. Tik indien nodig Z om en lijn Y.Press compute uit om een oppervlakteextractie voor beide kanalen in nieuwe vensters met de naam image te verkrijgen. Pas de helderheid en het contrast van de verkregen afbeeldingsvensters aan om de geprojecteerde actomyosinesignalen te kunnen zien door op Image te klikken, naar Aanpassen te gaan en Helderheid/contrast te selecteren.

Als de oppervlakteextractie er goed uitziet, slaat u beide kanalen afzonderlijk op als TIFF-bestanden. Bewaar bovendien het logboekvensterbestand voor toekomstige verwijzing naar de manier waarop het oppervlak van deze specifieke eierkamer is geëxtraheerd. Voeg vervolgens de kanalen samen met een voorkeurskleurcode in Fiji en sla de resultaten op als TIFF-bestanden.

Dit protocol stelt wetenschappers in staat om het gedrag van actomyosinenetwerken in epitheliale weefsels te onderzoeken. Dit is alleen mogelijk wanneer een gedetailleerde analyse van actomyosine gedrag op lokale cellulaire schaal wordt gecombineerd met een vergelijkbare analyse op de weefselschaal. Hier worden representatieve voorbeelden gegeven van dynamisch myosine II-gedrag op lokale cellulaire schaal en op de weefselschaal voor controle en fat2 mutant Drosophila eierkamers.

Op het basale enkel vlak beweegt de groene gemodificeerde regelgevende lichtketen van myosine II-signalen loodrecht op de voorste achterste as van controle-eikamers. Deze polariteit gaat verloren in fat2 mutant eikamers en leidt tot anisotropische myosine II pulsen, oscillaties Op weefselniveau genereert de groene gemodificeerde regulerende lichtketen van myosine II in het controlemonster de gesynchroniseerde kracht die nodig is om epitheliale rotatie te bevorderen. In tegenstelling, de follikel epitheel van een fat2 mutant ei kamer puls sterk aan de basale kant en niet aan de gesynchroniseerde kracht die nodig is om epitheliale rotatie te bevorderen genereren.

In een dun apicale gebied van de Drosophila eikamer, de fat2 mutant presenteert ook met veranderd dynamisch gedrag van de groene gewijzigde regelgevende lichtketen van myosine II.After watching this video, moet u een goed idee van hoe een actomyosine netwerk te analyseren op lokale en weefselschaal in Drosophila eikamers met behulp van Fiji. Zie het discussiegedeelte na het protocol voor verdere praktische tips en probleemoplossing. Als u vragen heeft met betrekking tot Fiji of onze plug-ins, raadpleeg dan de betreffende webpagina's of neem contact met ons op.