Oprichting van de dubbele gehumaniseerde TK-nog muis model voor HIV-geassocieerde lever pathogenese

Het algemene doel van het protocol is het genereren van een gehumaniseerd muismodel met functioneel menselijk immuunsysteem en lever met behulp van menselijke hematopoietische stamcellen en hepato-site. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in genetische lever gehumaniseerde muizen. Deze methode biedt een krachtig hulpmiddel om immunopathologie veroorzaakt door HIV te bestuderen, zoals waargenomen bij mensen.

Het aantonen van het proces zal worden door Yimin Sun, een supervisor van de pathologie en microbiologie afdeling, samen met Weimin Wang en Edwrd Makarov, onderzoek technoloog. Om te beginnen, overdracht navelstrengbloed verzameld in heparinized buizen naar een steriele laminaire stroomkast. Voeg PBS toe tot het volume is verhoogd tot 35 milliliter.

Leg het monster op de top van lymfocyten scheiding medium en centrifugeren het 400 keer G en op vier graden Celsius gedurende 35 minuten zonder pauzes. Verwijder vervolgens voorzichtig de bovenste plasmalaag en gebruik een transferpipet om de witte buffy coat interface over te brengen naar een nieuwe buis. Hang de buffy jas opnieuw op in 30 tot 40 milliliter ijskoude buffer.

Combineer met behulp van een pipet 20 microliter van de celsuspensie met 20 microliter van 0,4% trypan blauw. Pipette 10 microliter van dit mengsel in de buitenste opening van een van de twee kamers van een telplaat, en steek de dia in een geautomatiseerde celteller om de cellen te tellen. Centrifugeren de cellen op 300 keer G en op vier graden Celsius gedurende 10 minuten.

Zorgvuldig aspirate de supernatant en voeg 300 microliters van ijskoude buffer. Voeg 100 microliters van menselijke FC receptor blokkeren reagens en 100 microliters van monoklonale muis anti-menselijke CD34 antilichaam geconjugeerde MicroBeads voor maximaal 100 miljoen cellen. Incubeer gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius.

Voeg 10 milliliter ijskoude buffer toe om de cellen te wassen en centrifuge het 300 keer G en vier graden celsius gedurende 10 minuten. Verwijder voorzichtig de supernatant en hang de pellet opnieuw op in 500 microliters ijskoude buffer. Plaats hierna een positieve ls-kolom met positieve selectie in het magnetisch geactiveerde celsorteerveld en geef deze door met drie milliliter ijskoude buffer.

Laad het monster in de LS-kolom die MicroBeads in monsters kan vastpluipen aan menselijke CD34-positieve cellen en laat het onder invloed van de zwaartekracht in de opvangbuis stromen. Was de kolom drie keer met ijskoude buffer en verzamel het eluent in dezelfde opvangbuis. Vervolgens, duik de kolom met vijf milliliter van ijskoude buffer om de CD34 positieve cellen zinspelen in een nieuwe collectie buis.

Herhaal de procedure om een zuiverheid van meer dan 90% te bereiken Vervolgens gebruikt u trypanblauwe kleurstof en een hemocytometer om de ontweken CD34-positieve cellen te tellen. Na het tellen, centrifugeren de cellen op 300 keer G gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en schort de cellen opnieuw op in 125 microliter PBS voor een injectie die onmiddellijk bij transplantatie kan worden gebruikt.

Om de zuiverheid van de CD34 positieve eluent te controleren, neem 50 microliter van de suspensie en incuberen met 10 microliter pe geconjugeerd anti-menselijke CD34 antilichaam op vier graden Celsius gedurende 30 minuten. Daarna was en schorst u de cellen opnieuw in PBS en voert u stroomcytometrie uit. Analyseer na de overname de gegevens zoals beschreven in het tekstprotocol.

Eerst halen en ontdooien de cryopreserved hepatocyten zoals beschreven in het tekstprotocol. Verwijder vervolgens de biodop en giet de ontdooide hepatocyten in een 50 milliliter conische buis met opgewarmd ontdooiingsmedium. Rock de buis met de hand voor een paar seconden om de cellen op te schorten.

Pellet de cellen op 100 keer G en bij kamertemperatuur gedurende acht minuten. Was de pelletcellen in PBS met 0,1%BSA en bundel ze met verse of ontdooide HSPCs in PBS tot een eindvolume van 80 microliters per muis. Bevestig eerst het ene uiteinde van een steriele verlengbuis aan een naald van 30 meter en het andere uiteinde aan een spuit van één milliliter.

Vul de spuit met de ophanging van gepoolde HEPs en HSPCs. Plaats de spuit in de inkeping van een repetitieve doseerpijp en pas de dispenser aan om 10 microliter in elke pers af te geven. Scheer elke muis zoals beschreven in het tekstprotocol en scrub de linkerkant van het lichaam van elke muis met 10%povidone jodium gevolgd 70% isopropyl alcohol.

Met behulp van Vannas type schaar, maak een kleine incisie in de huid, spier en buikvlies aan de linkerkant van de buikvlieswand om de buikholte ongeveer 5 millimeter onder de onderste rand van de ribbenkast in te voeren. Zoek de milt en gebruik tangen om het iets te trekken naar het bedieningsgebied voor gemakkelijke toegang en steek de 30 meter naald in de onderste pool van de milt. Ontgrendel vervolgens de zuiger van de doseerpijp en doseer 10 microliter van het volume per keer, met een limiet van 60 tot 80 microliter per milt.

Trek de naald langzaam in en knip de milt met ligatingclips met behulp van een ligatie-applier. Gebruik vervolgens met katoen getipte applicators bevochtigd met steriele PBS om de milt terug in de lichaamsholte te duwen. Gebruik een onderbroken hechtingspatroon om de spierlaag van de buikwand te sluiten.

Volbrengen huidsluiting met een onderbroken hechting patroon met behulp van niet-absorbeerbare hechtingen. Breng alle benodigde materialen over naar een aangewezen Biosafety Level Two Plus-faciliteit. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder een wegwerphoes alle jurken, schoenhoezen, een gezichtsmasker en dubbele handschoenen, inclusief snijbestendige handschoenen, te allen tijde tijdens het werken met het virus.

Selecteer muizen met een reconstructie van meer dan 15% van de menselijke CD45 positieve cellen en met een aanwezigheid van menselijke albumine in het serum voor HIV-1 infectie. Intraperitoneally injecteren de muizen met 1.000 tot 10.000 weefselkweek infectieuze doses van 50 HIV-1 ADA in een volume van 100 tot 200 microliter per muis. Na het euthanaseren van de muizen, accijns van de lever van elke muis zoals beschreven in het tekstprotocol.

Verzamel en fix de levers in 4%paraformaldehyde 's nachts. De oprichting van een dual gehumaniseerd muismodel met menselijke lever- en immuuncellen kan bij elke stap eenvoudig worden gecontroleerd met respectievelijk zeer eenvoudige ELIZA en stroomcytometrie. Flow cytometrie wordt regelmatig uitgevoerd om de ontwikkeling van een functioneel immuunsysteem te evalueren en om het effect van HIV-infectie op immuuncellen te zien.

Bij gehumaniseerde muizen kan de ontwikkeling van functionele immuuncellen variëren van 15 tot 90% van de lymfocytenpoort. Voor de evaluatie van de engraftment van menselijke hepatocyten wordt ELIZA voor mensspecifieke albumineniveaus maandelijks uitgevoerd op muisserum. Muizen geënt met zowel HSPCs en HEPs tonen mens-specifieke albumin niveaus variërend van ongeveer zeven microgram per milliliter tot 377 microgram per milliliter op een maand, blijven groeien in de tijd van observatie.

Het effect van HIV-infectie op menselijke immuuncellen in het bloed van dubbele gehumaniseerde muizen wordt gecontroleerd door stromingscytometrie en op HEPs in de lever door mensspecifiek albumin ELIZA. Tegen vijf weken veroorzaakt HIV-1 een afname van het aantal menselijke albumineniveaus in het serum en is er een uitputting van menselijke CK18 positieve hepatocyten in de leversecties van dubbele gehumaniseerde muizen. Een lagere verhouding van CD4 tot CD8 wordt meestal waargenomen in het bloed en de lever van hiv-geïnfecteerde muizen, in vergelijking met niveaus die in dezelfde muis voor infectie.

Bloed moet zorgvuldig worden gelaagd op de top van lymfocyten scheiding medium voor isolaties van buffy jas. Houd voor de operatie de milt voorzichtig vast en steek de naald in de onderste pool van de milt. Na de isolatie van hematopoietische stamcellen is het cruciaal om de zuiverheid van CD34 positieve hematopoietische stamcellen te controleren om CD3-positieve cellen en acute injecties van hepatocyat van verschillende donor te voorkomen.

Als de gehumaniseerde muizen fysiologisch aspect van het menselijk immuunsysteem en de lever vertonen, kunnen de ontwikkelde muizen worden gebruikt om fysiopathogenese van HIV en fysieke infecties en cirrose te bestuderen.