Name: Oprichting van de dubbele gehumaniseerde TK-nog muis model voor HIV-geassocieerde lever pathogenese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 s
Description: Leer een dubbel gehumaniseerd muismodel opzetten met functioneel menselijk immuunsysteem en levercellen voor HIV-gerelateerde leverpathogenese-onderzoek. Deze methode maakt gedetailleerde studie van immunopathologie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door het National Institute of Health Grant R24OD018546 (to L.Y.P. and S.G.). De auteurs willen graag Weizhe Li, Ph.D. bedanken voor de hulp bij chirurgische ingrepen, Amanda Branch Woods, B.S., Yan Cheng voor immunohistologie, UNMC flow cytometrie Research Facility leden Director Phillip Hexley, Ph.D., Victoria B. Smith, B.S. en Samantha Wall, b.s., unmc Advanced microscopie kern faciliteit leden Janice A. Taylor, b.s., en James R. talaska, b.s., voor de technische ondersteuning. De auteurs erkennen drs. Mamoru Ito en Hiroshi Suemizu van CIEA voor het verstrekken van TK-nog muizen en Dr. Joachim Baumgart voor het verstrekken van treosulfan. De auteurs danken Dr. Adrian Koesters, UNMC, voor haar redactionele bijdrage aan het manuscript.

Dit protocol is goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) aan de Universiteit van Nebraska Medical Center.
Opmerking: Verkrijg toestemming van de lokale IACUC voordat u experimenten op dieren uitvoert.
1. verwerking van navelstreng bloed en de isolatie van menselijke Hspc's
<ol><li>Voer alle stappen van het protocol uit onder steriele omstandigheden in laminaire flow kasten.</li>
	<li>Neem de navelstreng bloed (CB) verzameld in gehepariniseerd tubes en maak het volume tot 35 ml door toevoeging van fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Laag het monster bovenop de lymfocyten scheidings medium (LSM) zoals geïllustreerd in Figuur 1 en centrifugeer de LSM met de gelaagde CB bij 400 x g voor 35 min bij 4 °c zonder remmen. Opmerking: Verdun het bloed voorzichtig en voorzichtig om te voorkomen dat het mengen in de interface.</li>
	<li>Verwijder de bovenste LSM-en plasmaslaag zorgvuldig en breng de witte buffy coat-interface over naar een nieuwe buis met behulp van een pipet voor overdracht.</li>
	<li>Rebreng de Buffy coat in 30-40 mL ijskoude buffer (PBS + 0,5% boviene serumalbumine [BSA] + 2 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur [EDTA]). Combineer met een pipet 20 μl van de celsuspensie met 20 μL van 0,4% trypeen blauw en Pipetteer 10 μL van het mengsel in de buitenste opening van een van de twee kamers van een teldia en plaats de dia in een geautomatiseerde cel teller om de cellen te tellen. Opmerking: Gebruik ijskoude buffer in alle stappen, omdat het helpt de cellen levensvatbaar te houden.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c en zuig het supernatant voorzichtig op. Voeg vervolgens 300 μL ijskoude buffer toe.</li>
	<li>Voeg 100 μL humaan FC-receptor blokkerende reagens en 100 μL monoklonale muis anti-humane CD34 antilichaam-geconjugeerde microbeads toe voor maximaal 1 x 108 cellen (Zie de tabel met materialen). Inincuberen gedurende 30 minuten bij 4 °C, voeg 10 mL ijskoude buffer toe om de cellen te wassen en centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c. Opmerking: Schaal dit volgens het celnummer als er meer dan 1 x 108 cellen aanwezig zijn.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig het supernatant, hervat de pellet in 500 μL buffer en ga verder met de magnetische scheidings stap om Hspc's te verrijken.</li>
	<li>Plaats een positieve selectie LS kolom (Zie de tabel van de materialen) in de magnetische-geactiveerde cel sorteren veld en doorgeven met 3 ml buffer.</li>
	<li>Laad het monster in de LS-kolom die microbeads gebonden aan humaan CD34 + in monsters kan verankeren en laat het onder invloed van de zwaartekracht in de opvang buis stromen.</li>
	<li>Was de kolom 3x met buffer en verzamel de Elueer in dezelfde verzamelbuis van de CD34- Fractie van cellen.</li>
	<li>Dompel de kolom in met 5 mL buffer om de CD34+ cellen in een nieuwe verzamelbuis te elzen. Herhaal de procedure om een zuiverheid van > 90% te bereiken.</li>
	<li>Tel de eluteerde CD34+ cellen met behulp van trypan blauwe kleurstof in een hemocytometer. Centrifugeer na het tellen de CD34+ -cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g en gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Respendeer de CD34+ cellen in 25 μL PBS voor een injectie die onmiddellijk wordt gebruikt bij transplantatie of invriezen de cellen met een concentratie van 1-2 miljoen/ml in Vries medium (Roswell Park Memorial Institute medium [rpmi 1640 medium] + 50% foetaal runderserum (FBS) + 10% dimethylsulfoxide [DMSO]) voor verder gebruik bij transplantatie. Opmerking: Altijd te vertellen levensvatbare cellen alvorens ze te gebruiken in transplantatie.</li>
	<li>Om de zuiverheid van de CD34+ elute te controleren, neemt u 50 μL van de suspensie en inbroed deze met 10 μL PE-geconjugeerd anti-humaan CD34-antilichaam gedurende 30 minuten bij 4 °c. Na de incubatie van het antilichaam, de bevlekte cellen wassen met PBS, ze hervatten in 100 μL PBS en vervolgens doorgaan met het uitvoeren van Flowcytometrie. Voeg een extra buis van cellen toe zonder antilichamen om de poort in de flow-cytometer te ontwerpen.</li>
	<li>Analyseer na aanschaf de gegevens door het interessegebied te selecteren op een plot voor forward Scatter (FSC) en side Scatter (SSC), gevolgd door gating voor afzonderlijke cellen op FSC-gebied en FSC-Height plots. Gate CD34-positieve cellen op afzonderlijke cellen in het PE-kanaal en het SSC-gebied plot.</li>
</ol>2. bereiding van humane hepatocyten voor transplantatie
<ol><li>Verwijder de cryopreserved hepatocyten uit de vloeibare stikstof, snel onderdompelen de flacon in het waterbad, en ontdooien voor ongeveer 90-120 s.</li>
	<li>Verwijder de dop van de injectieflacon en giet de ontdooide hepatocyten in de conische buis van 50 mL van het verwarmde medium.</li>
	<li>Onderbreek de cellen door de buis van 50 mL met de hand te rocken voor een paar seconden. Opmerking: Draai de buis niet Vortex.</li>
	<li>Pellet de cellen bij 100 x g gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur. Was de omhulde cellen in PBS met 0,1% BSA en bad ze met verse of ontdooide Hspc's (verhouding 10:1) in PBS in een eindvolume van 80 μL/muis.</li>
</ol>3. verwerking van dieren, screening, genotypering en behandeling van humane HSPC en hepatocyten transplantatie
<ol><li>Omgaan met dieren
	<ol>
<li>Als gevolg van ernstige immunodeficiëntie, ras, huis, en omgaan met TK-nog muizen onder aseptische omstandigheden.</li>
		<li>Draag altijd een Labcoat, handschoenen, schoen hoezen en een gezichtsmasker om besmetting met potentieel pathogene micro-organismen te voorkomen.</li>
		<li>Gebruik steriele handschoenen en instrumenten voor chirurgie en behandel de dieren aseptisch gedurende de hele operatie.</li>
	</ol></li>
	<li>Selecteren van TK-nog-muizen voor het experiment
	<ol>
<li>Onderhouden van de TK-nog stam kolonie door het fokken van vrouwelijke TK-nog muizen met mannelijke niet-TK-nog littermates en selecteer transgene nakomelingen door genotypering. Opmerking: Voer genotypering uit (zie stap 3,3) om de aanwezigheid of afwezigheid van het transgen bij pasgeboren mannelijke en vrouwelijke muizen op het moment van spening te bepalen.</li>
		<li>Selecteer mannetjes op 6-8 weken voor transplantatie vanwege hun hoge gevoeligheid voor de door GCV gemedieerde depletie van HSV-TK transgene-het uitdrukken van hepatocyten21.</li>
		<li>Oor-tag de muizen op het moment van spening of chirurgie om identificatie te verlichten. Noteer het gewicht en de gezondheidstoestand van de dieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Genotypering voor de aanwezigheid van het HSV-TK-transgen met behulp van kwantitatieve real-time polymerase kettingreactie
	<ol>
<li>Voer genotypering uit op het moment van spenen (meestal op 3-4 weken oud). Snijd voor genotypering een stukje van het muis oor in een biologische veiligheidskast van laminaire stroming om de steriliteit te behouden en het genomisch DNA uit te pakken met behulp van een genomische DNA-isolatiekit.</li>
		<li>Amplify genomisch DNA geëxtraheerd uit het oorstukje in een 20 μL reactiemengsel op het scherm voor HSV-tk-transgen onder controle van de promotor van humane albumine door 1 μL voorwaartse primer 5 '-ccatgcacgtctttatcctgg-3 ' toe te voegen; 1 μl omgekeerde primer 5 '-taagttgcagcagggcgtc-3 ', 0,5 μL van FAM probe 5 ′-FAM-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3 ', en 10 μL Master mix op een real-time polymerase kettingreactie (PCR) instrument22.</li>
		<li>Stel de real-time PCR-instellingen als volgt in: 60 °C gedurende 30 sec. (preread fase), 95 °C gedurende 10 min (Hold stage), 40 cycli van 95 °C gedurende 15 s en 60 °C gedurende 1 minuut (PCR-fase) en 60 °C gedurende 30 s (postread stage). Opmerking: Een cyclus van drempel (CT) onder 22 wordt beschouwd als positief voor HSV-TK transgene.</li>
	</ol></li>
	<li>Behandeling met ganciclovir en treosulfan
	<ol>
<li>Injecteer met een naald van 27 G de TK-nog-muizen met intraperitoneale GCV-injecties (6 mg/kg) 2x per dag op dag 7 en op dag 5 in 100 μL zoutoplossing vóór de operatie om de transgene parenchymale cellen van de muizen af te putten (zoals weergegeven in de experimentele strategie in Figuur 2)23 .</li>
		<li>Op de dagen 3, 2 en 1 voor de operatie, voor waarde muizen met nonmyeloablative intraperitoneale doses van treosulfan (1,5 g/kg/dag) in 100 μL zoutoplossing, met behulp van een naald van 27 G.</li>
		<li>Trek één dag voor de operatie twee tot drie druppels (~ 100 μL) bloed uit de submandibulaire ader door het te prikken met een lancet van 5 mm, en Isoleer het serum door centrifugeren (1.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c) voor de ALANINEAMINOTRANSFERASE (ALT) assay om de degr te beoordelen ee van leverbeschadiging.</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbereiding voor de operatie
	<ol>
<li>Gebruik de Clippers om de vacht van de muis rond de incisieplaats te scheren (links van de peritoneale muur) vóór de operatie.</li>
		<li>Stel de zuurstoftoevoer in op 1 L/min en de Isofluraan stroom naar 3%-5% in een inductie kamer met behulp van een muis anesthesie machine. Plaats een muis in een tijd in de inductie kamer voor anesthesie.</li>
		<li>Bevestig het ene uiteinde van een steriele verlengbuis (met een vasthoud capaciteit van 550 μL suspensie; zie de tabel met materialen voor specificaties) op een 30 G naald en het andere uiteinde op een 1 ml spuit.</li>
		<li>Vul de spuit met de suspensie (80 μL/muis) van gepoolde HEPs en Hspc's (zie rubriek 2), plaats de spuit in de inkeping van een repetitieve doseerpipet en pas de dispenser aan om in elke pers 10 μL te doseren.</li>
		<li>Zodra de muizen verdoiliseerd zijn (meestal na 3-4 min), schakelt u de Isofluraan stroom naar de neuskegel en verlaagt u het isofluraandebiet tot 2%-3%.</li>
	</ol></li>
	<li>Intrasplenische transplantatie van humane Hspc's en hepatocyten bij muizen
	<ol>
<li>Voer alle operatie stappen uit in een laminaire flowkast onder steriele omstandigheden.</li>
		<li>Plaats een schone steriele draperen over het werkoppervlak en Schrob de linkerzijde van het lichaam van elke muis met 10% Povidon-jodium gevolgd door 70% isopropylalcohol, alvorens een incisie te maken.</li>
		<li>Maak een kleine incisie (~ 1-1,5 cm in lengte en 5 mm diep) in de huid, spier, en peritoneum links van de peritoneale wand met Vanna's type schaar om de peritoneale holte ongeveer 5 mm onder de onderrand van de ribbenkast te betreden.</li>
		<li>Zoek de milt, trek het iets met een tang naar het werkgebied voor gemakkelijke toegang, en steek de 30 G naald in de onderste pool van de milt.</li>
		<li>Ontgrendel de zuiger van de doseerpipet en verdeel 10 μL van het volume per keer, met een limiet van 60-80 μL op de milt. Trek de naald langzaam in en knip de milt met ligende clips met behulp van een ligatie-Applier.</li>
		<li>Duw de milt terug in de lichaamsholte met katoen-getipt applicatoren bevoafd met steriel PBS.</li>
		<li>Sluit de spierlaag van de buikwand met behulp van een absorbabel hechtdraad onderbroken hecht patroon (niet continu). Bereiken van de huid sluiting met een onderbroken hecht patroon met behulp van niet-absorbabele hechtingen.</li>
		<li>Gebruik warm water circulerende pads om de muizen te beschermen tegen hypothermie na de operatie.</li>
		<li>Verwijder niet-absorbabele hechtingen 10-14 dagen na de operatie.</li>
	</ol></li>
	<li>Postoperatieve zorg
	<ol>
<li>Wanneer het getransplanteerde dier wordt wakker, Injecteer dan analgetische buprenorfine (0,1 mg/kg) intraperitoneaal, 2x per dag gedurende een opeenvolgende 3 dagen.</li>
		<li>Observeer de dieren ten minste 1x per dag totdat ze terugkeren naar normale fysieke omstandigheden. Opmerking: Controleer het lichaamsgewicht van elk dier, aangezien sommige muizen een postoperatieve ingreep kunnen verliezen. Muizen krijgen meestal hun oorspronkelijke gewicht in 1 tot 2 weken terug.</li>
	</ol></li>
</ol>4. engraftment validatie van de humane lever door ELISA en het menselijk immuunsysteem door flow Cytometrie
Opmerking: Evalueer de reconstitutie van de menselijke lever en het immuunsysteem maandelijks, beginnend 1 maand na transplantatie door enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) en Flowcytometrie, respectievelijk.
<ol><li>Verzamel bloedmonsters van de submandibulaire ader met behulp van lantes in EDTA-buisjes en Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 1.500 x g . Isoleer serum om de humane albuminespiegels te controleren om de engraftment-efficiëntie van de lever van de muis voor getransplanteerde humane hepatocyten te beoordelen, met behulp van een humane albumine ELISA-kwantitatie set (Zie de tabel met materialen) door de fabrikant Instructies. Opmerking: Gooi de pellet niet weg en gebruik de gepileerde cellen voor een Flowcytometrie analyse om de reconstitutie van het menselijk immuunsysteem te evalueren.</li>
	<li>Respendeer de celpellet zonder serum in 35 μL FACS buffer (PBS + 2% FBS) en gekleurd met 5 μL muis-specifieke CD45 (concentratie 0,5 mg/mL), 5 μL elk van de humaan-specifieke antilichamen CD45 (0,1 mg/mL), CD3 (0,2 mg/mL), CD8 (0,1 mg/mL) en CD19 (0,5 mg/mL) , en 20 μL CD4 (0,25 mg/mL) en CD14 (0,25 mg/mL) elk gedurende 30 minuten bij 4 °C, om de ontwikkeling van een functioneel immuunsysteem van CD34+ hspc's te controleren. Opmerking: Overweeg het toevoegen van een extra buis van Onbevlekte cellen om te bepalen van de gating van de bevlekte cellen.</li>
	<li>Breng na incubatie de bevlekt suspensie (~ 100 μL) in een polystyreen ronde bodem Flow cytometrie buis en gebruik 2 mL 1x lysisbuffer (Zie de tabel met materialen) door 1 deel van de 10x lysisbuffer met 9 delen gedistilleerd water te verdunen en 10- 15 min naar lyse rode bloedcellen. Opmerking: observeer troebelheid om de rode bloedcel lysis te evalueren. Zodra het monster duidelijk wordt, is de lysis compleet.</li>
	<li>Na de lysis, voeg 3 mL van de FACS buffer in de buis en centrifugeer op 300 x g bij 4 °c gedurende 5 minuten om een pellet te krijgen. Herhaal de wassing door 3 mL FACS buffer toe te voegen aan de pellet en centrifugeer bij 300 x g bij 4 °c gedurende 5 min.</li>
	<li>Repareer de cellen in vers gemaakte 1% Paraformaldehyde (PFA) en verkrijg bevlekte cellen op de flow cytometer, geanalyseerd met Flow software.</li>
	<li>Selecteer voor de analyse lymfocyten gating op een FSC/SSC-plot, gevolgd door eencellige gating op FSC-gebied/FSC-hoogte.</li>
	<li>Verder, poort voor humaan-specifieke CD45 (hCD45) op de eencellige populatie en omvatten muis-specifieke CD45 (mCD45) voor de uitsluiting van cellen van Murine oorsprong. Strategize gating van de bevlekte bevolking op basis van het gating van Onbevlekte cellen.</li>
	<li>Gate hCD45+ cellen om de frequentie van CD3+ T-cellen en CD19+ B-cellen te bepalen. Gate T-cellen om de CD4-en CD8-subsets te bepalen. Om monocyten te evalueren, Gate op hCD45 om te bepalen CD14+ monocyten.</li>
</ol>5. HIV-infectie van TK-nog-muizen en het effect ervan op de menselijke lever en het immuunsysteem
<ol><li>Behandel het HIV-1-virus en alle geïnfecteerde muizen in een aangewezen bioveiligheid Level 2-faciliteit. Let op: Autoclaaf en gooi alle HIV-geïnfecteerde afvalstoffen weg in dubbele Biohazard zakken. Draag om veiligheidsredenen snijbestendige handschoenen bij het overhandigen van HIV-geïnfecteerde muizen.</li>
	<li>Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), met inbegrip van een wegwerp overall Gown, schoen hoezen, een gezichtsmasker en dubbele handschoenen te allen tijde tijdens het werken met het virus.</li>
	<li>Selecteer muizen met een reconstitutie van meer dan 15% van de humane CD45+ cellen (getest in stap 4,7) en met een aanwezigheid van humaan albumine in het serum voor HIV-1-infectie (getest in stap 4,1).</li>
	<li>Injecteer de muizen met 1 x 103 tot 1 x 104 weefselkweek infectieuze DOSES 50 (TCID50) HIV-1ADA in een volume van 100-200 μL per muis, intraperitoneaal.</li>
	<li>Euthanuseer de HIV-geïnfecteerde muizen 5 weken na infectie met behulp van Isofluraan (met een Isofluraan dampconcentratie van > 5%).</li>
	<li>Na het euthanaseren van de muizen, het verzamelen van bloed in EDTA buizen door een cardiale punctie voor de isolatie van serum, om het effect van HIV-1 op de lever te zien door het evalueren van humaan-specifieke albumine niveaus door ELISA (zie stap 4,1) en bloedcellen om te controleren op veranderingen in het menselijk immuunsysteem cellen met behulp van Flowcytometrie (Zie stappen 4,2-4,8). Opmerking: Evalueer de perifere virale belasting 5 weken na infectie op een bioanalysator om te bevestigen of de muizen besmet zijn.</li>
	<li>Na het tekenen van bloed, accijnzen de lever van de geëeuthanaseerde muizen.</li>
	<li>Voor de lever excisie, bloot de buikholte door het maken van een incisie van 1,5-2 cm lang en 0,5 cm diep in de huid, spieren, en peritoneum, van de xyphoid. Maak een snede loodrecht op de wervelkolom tussen de lever en het diafragma. Til de lever op en Sever alle membranen die het aan de maag en darmen bevestigen.</li>
	<li>Verzamel en fixeer de lever in 4% Paraformaldehyde 's nachts en volg een standaard immunohistochemisch protocol om het effect van HIV op CK18+ hepatocyten te evalueren met behulp van humaan-specifieke CK18 antilichamen8.</li>
</ol>

<ol><li>Smith, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+associated+with+specific+causes+of+death+amongst+HIV-positive+individuals+in+the+D%3AA%3AD+Study%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study.</a> AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).</li>
<li>Puoti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+for+liver+disease+in+patients+with+HIV+infection%3A+a+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Acquired+Immune+Deficiency+Syndromes%22%5BJournal%5D)">Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24 (3), 211-217 (2000).</li>
<li>Rodriguez-Mendez, M. L., Gonzalez-Quintela, A., Aguilera, A., Barrio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence%2C+patterns%2C+and+course+of+past+hepatitis+B+virus+infection+in+intravenous+drug+users+with+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Prevalence, patterns, and course of past hepatitis B virus infection in intravenous drug users with HIV-1 infection.</a> The American Journal of Gastroenterology. 95 (5), 1316-1322 (2000).</li>
<li>Scharschmidt, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+in+patients+with+HIV+infection%3A+relationship+to+AIDS+and+patient+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B in patients with HIV infection: relationship to AIDS and patient survival.</a> Annals of Internal Medicine. 117 (10), 837-838 (1992).</li>
<li>Lacombe, K., Rockstroh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+and+viral+hepatitis+coinfections%3A+advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">HIV and viral hepatitis coinfections: advances and challenges.</a> Gut. 61, Suppl 1 47-58 (2012).</li>
<li>Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+for+the+study+of+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized mice for the study of infectious diseases.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).</li>
<li>Billerbeck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+efficiently+engrafted+with+fetal+hepatoblasts+and+syngeneic+immune+cells+develop+human+monocytes+and+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Humanized mice efficiently engrafted with fetal hepatoblasts and syngeneic immune cells develop human monocytes and NK cells.</a> The Journal of Hepatology. 65 (2), 334-343 (2016).</li>
<li>Dagur, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatocyte+depletion+in+the+presence+of+HIV-1+infection+in+dual+reconstituted+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Human hepatocyte depletion in the presence of HIV-1 infection in dual reconstituted humanized mice.</a> Biology Open. 7 (2), (2018).</li>
<li>Gaska, J. M., Ploss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+viral+pathogenesis+in+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Study of viral pathogenesis in humanized mice.</a> Current Opinion in Virology. 11, 14-20 (2015).</li>
<li>Gorantla, S., Poluektova, L., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+for+HIV-associated+neurocognitive+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Rodent models for HIV-associated neurocognitive disorders.</a> Trends in Neurosciences. 35 (3), 197-208 (2012).</li>
<li>Xu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+TK-NOG+mice%3A+a+predictive+model+for+cholestatic+human+liver+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Chimeric TK-NOG mice: a predictive model for cholestatic human liver toxicity.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (2), 274-280 (2015).</li>
<li>Washburn, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+humanized+mouse+model+to+study+hepatitis+C+virus+infection%2C+immune+response%2C+and+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection, immune response, and liver disease.</a> Gastroenterology. 140 (4), 1334-1344 (2011).</li>
<li>Gutti, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatocytes+and+hematolymphoid+dual+reconstitution+in+treosulfan-conditioned+uPA-NOG+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice.</a> The American Journal of Pathology. 184 (1), 101-109 (2014).</li>
<li>Strick-Marchand, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mouse+model+for+stable+engraftment+of+a+human+immune+system+and+human+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel mouse model for stable engraftment of a human immune system and human hepatocytes.</a> PLoS One. 10 (3), 0119820(2015).</li>
<li>Keng, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+liver+pathogenesis%2C+human+immune+responses+and+drug+testing+in+a+humanised+mouse+model+of+HCV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Characterisation of liver pathogenesis, human immune responses and drug testing in a humanised mouse model of HCV infection.</a> Gut. 65 (10), 1744-1753 (2016).</li>
<li>Li, F., Nio, K., Yasui, F., Murphy, C. M., Su, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+HBV+Infection+and+Therapy+in+Immune-Deficient+NOD-Rag1-%2F-IL2RgammaC-null+%28NRG%29+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+%28Fah%29+Knockout+Mice+Transplanted+with+Human+Hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Studying HBV Infection and Therapy in Immune-Deficient NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null (NRG) Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Knockout Mice Transplanted with Human Hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1540, 267-276 (2017).</li>
<li>Poluektova, L. Y., Garcia, J. V., Koyanagi, Y., Manz, M. G., Tager, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPoluektova%2C+LY+%22Humanized+Mice+for+HIV+Research%22">Humanized Mice for HIV Research</a>. , Springer-Verlag New York. New York, NY. (2014).</li>
<li>Cheng, L., Ma, J., Li, G., Su, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+Mice+Engrafted+With+Human+HSC+Only+or+HSC+and+Thymus+Support+Comparable+HIV-1+Replication%2C+Immunopathology%2C+and+Responses+to+ART+and+Immune+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized Mice Engrafted With Human HSC Only or HSC and Thymus Support Comparable HIV-1 Replication, Immunopathology, and Responses to ART and Immune Therapy.</a> Frontiers in Immunology. 9, 817(2018).</li>
<li>Zhang, L., Su, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+immunopathogenesis+in+humanized+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 immunopathogenesis in humanized mouse models.</a> Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 237-244 (2012).</li>
<li>Nunoya, J., Washburn, M. L., Kovalev, G. I., Su, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+prevent+liver+fibrosis+during+HIV+type+1+infection+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells prevent liver fibrosis during HIV type 1 infection in a humanized mouse model.</a> The Journal of Infectious Diseases. 209 (7), 1039-1044 (2014).</li>
<li>Hasegawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reconstituted+%27humanized+liver%27+in+TK-NOG+mice+is+mature+and+functional%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">The reconstituted 'humanized liver' in TK-NOG mice is mature and functional.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 405 (3), 405-410 (2011).</li>
<li>Higuchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+hepatic+cell+line+HepaRG+as+a+possible+cell+source+for+the+generation+of+humanized+liver+TK-NOG+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Xenobiotica%22%5BJournal%5D)">The human hepatic cell line HepaRG as a possible cell source for the generation of humanized liver TK-NOG mice.</a> Xenobiotica. 44 (2), 146-153 (2014).</li>
<li>Kosaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+TK-NOG+based+humanized+mouse+model+for+the+study+of+HBV+and+HCV+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A novel TK-NOG based humanized mouse model for the study of HBV and HCV infections.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (1), 230-235 (2013).</li>
<li>Crane, M., Iser, D., Lewin, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+infection+and+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus infection and the liver.</a> World Journal of Hepatology. 4 (3), 91-98 (2012).</li>
<li>Bility, M. T., Li, F., Cheng, L., Su, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+immune-pathogenesis+and+therapy+of+human+liver+tropic+virus+infection+in+humanized+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver immune-pathogenesis and therapy of human liver tropic virus infection in humanized mouse models.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28, Suppl 1 120-124 (2013).</li>
<li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-level+HIV+infection+of+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Low-level HIV infection of hepatocytes.</a> Virology Journal. 9, 1-7 (2012).</li>
<li>Dash, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-acting+nanoformulated+antiretroviral+therapy+elicits+potent+antiretroviral+and+neuroprotective+responses+in+HIV-1-infected+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Long-acting nanoformulated antiretroviral therapy elicits potent antiretroviral and neuroprotective responses in HIV-1-infected humanized mice.</a> AIDS. 26 (17), 2135-2144 (2012).</li>
<li>Sun, S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+chimeric+mouse+models+of+hepatitis+B+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Humanized chimeric mouse models of hepatitis B virus infection.</a> International Journal of Infectious Diseases. 59, 131-136 (2017).</li>
<li>Shafritz, D. A., Oertel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+and+experimental+conditions+that+lead+to+effective+repopulation+of+the+liver+by+transplanted+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43 (2), 198-213 (2011).</li>
<li>Almeida-Porada, G., Porada, C. D., Chamberlain, J., Torabi, A., Zanjani, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+human+hepatocytes+by+human+hematopoietic+stem+cells+in+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep.</a> Blood. 104 (8), 2582-2590 (2004).</li>
<li>Streetz, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+parenchymal+replacement+in+mice+by+transplanted+allogeneic+hepatocytes+is+facilitated+by+bone+marrow+transplantation+and+mediated+by+CD4+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells.</a> Hepatology. 47 (2), 706-718 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De lever is aangetast en beschadigd bij HIV-geïnfecteerde patiënten24. Experimentele kleine diermodellen voor het bestuderen van menselijke leverziekten in de aanwezigheid van HIV-1 is zeer beperkt, ondanks de beschikbaarheid van een paar gecotransplanteerde diermodellen met CD34+ hspcs en hepatocyten7,12, 25. In in vitro experimenten, hepatocyten worden aangetoond dat een laag niveau HIV-1-in...

Sinds de komst van antiretrovirale therapie, is er een aanzienlijke afname van sterfgevallen gerelateerd aan HIV-1 monoinfectie. Echter, leverziekte is ontstaan als een veel voorkomende oorzaak van morbiditeit bij HIV-geïnfecteerde patiënten1,2. Coinfecties van hepatitis virussen met HIV-1-infectie komen vaker voor dan 10%-30% van de HIV-geïnfecteerde personen in de Verenigde Staten3,4,5.
De gastheer-specificiteit van HIV-1 en hepatitis virussen beperkt het nut van kleine diermodellen om humane-specifieke infectieziekten te bestuderen of om meerdere aspecten van HIV-1-geassocieerde lever pathogenese onderzoeken. Immunodeficiënte muizen die het engraftment van menselijke cellen en/of weefsels (aangeduid als gehumaniseerde Muismodellen) toelaten, zijn acceptabele diermodellen voor preklinische studies6,7,8. Sinds de introductie van gehumaniseerde muizen in de vroege jaren 2000, meerdere Preklinische studies van cholestatische menselijke lever toxiciteit, humaan-specifieke pathogenen, met inbegrip van HIV-1 en HIV-geassocieerde Neurocognitieve stoornissen, Epstein Barr virus, hepatitis, en andere infectieziekten, zijn onderzocht bij deze muizen6,9,10,11. Meerdere Muismodellen voor CD34+ hspc's en/of humane hepatocyten transplantatie zijn al lang ontwikkeld en zijn na verloop van tijd verbeterd om de pathogenese van de ziekte van het hepatitis B-virus (HBV)-geassocieerde leverziekte12te bestuderen, 13 , 14. verschillende modellen voor hspc en humane hepatocyte (HEP) transplantatie zijn gebaseerd op stammen, bekend als nog (NOD. CG-prkdcscid Il2rgtm1Sug/jictac)8,13, NSG (NOD. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj)15, Balb/C-Rag2-/- γc-/- (Rag2TM 1.1 FLV Il2rgTM 1.1 FLV/j)12, en Fah-/- NOD rag1-/- il2rγnull muis16. Elk model heeft echter zijn eigen voordelen en beperkingen; bijvoorbeeld, AFC8 dubbele gehumaniseerde muizen voor HEPs en menselijke stamcellen (HSCs) op een Balb/C-Rag2-/- γc-/- achtergrond maakt de succesvolle engraftment van immune cellen en hscs, maar er is een afwezigheid van een antigeen-specifieke T-en B-cel antwoord in dit model12. De belangrijkste zorgen bij het reconstitueren van dubbele gehumaniseerde muizen zijn suboptimale engraftment, een gebrek aan geschikte modellen ter ondersteuning van verschillende weefsels, niet-overeenkomende aandoeningen, immuunafstoting of transplantaat-versus-hostziekte (gvhd), en technische moeilijkheden, zoals riskante manipulaties met pasgeborenen en hoge sterftecijfers als gevolg van metabole afwijkingen13.
Hoewel gehumaniseerd muizen zijn gebruikt voor HIV-onderzoek voor vele jaren17,18,19, het gebruik van gehumaniseerde muizen te bestuderen van leverschade veroorzaakt door HIV-1 is beperkt20. We eerder gemeld de oprichting van een dubbele gehumaniseerd TK-nog muismodel en de toepassing ervan in HIV-geassocieerde leverziekte8. Dit model toont de robuuste engraftment van lever en immune cellen en aan HIV infectie pathogenese. Deze discussie presenteert een gedetailleerd protocol, met inbegrip van de meest kritische stappen in de transplantatie van menselijke hepatocyten. Een beschrijving van de Hspc's die nodig zijn voor een geslaagde engraftment van HEPs en de oprichting van een functioneel immuunsysteem bij TK-nog muizen wordt ook gepresenteerd. Het gebruik van deze muizen om HIV-geassocieerde lever immunopathogenese te bestuderen is gedetailleerd. TK-nog mannelijke muizen met een lever-specifieke herpes simplexvirus type 1 thymidine kinase (HSV-tk) transgen worden gebruikt. Muis levercellen die dit transgen uitdrukken, kunnen gemakkelijk worden ablatie na een korte blootstelling aan een niet-toxische dosis van gcv. Getransplanteerde humane levercellen worden stabiel onderhouden binnen de muis lever zonder exogene drugs21. De muizen zijn ook voorgeconditioneerd met niet-myeloablatieve doses van treosulfan om een niche te creëren in het beenmerg van de muis voor menselijke cellen8. Immunodeficiënte TK-nog-muizen zijn intrasplenisch geïnjecteerd met HEPs en multipotente Hspc's. De muizen worden vervolgens regelmatig gecontroleerd op bloed en lever reconstitutie door immunofhenootypering in het bloed en metingen van respectievelijk serum humaan-albuminespiegels. Muizen met een succesvolle reconstitutie van meer dan 15% voor zowel menselijke immuuncellen als HEPs zijn intraperitoneaal geïnjecteerd met HIV-1. Het effect van HIV op de lever kan worden beoordeeld al in 4-5 weken na infectie. Het is van cruciaal belang om op te merken dat, omdat HIV-1 wordt gebruikt, alle nodige voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij het hanteren van het virus en het injecteren in muizen.

<table><tbody><tr><td>27 G1/2" naalden</td><td>BD biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>30 G1/2" naalden</td><td>BD biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>5 mL polystyreen&nbsp; ronde bodembuis 12 mm x 75 mm stijl</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 mL Tuberculin Syringe Zonder Naald</td><td>BD biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS array bioanalyzer&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Voor zuiverheidscontrole van geëludeerde CD34+ cellen&nbsp;</td></tr><tr><td>BD FACS array software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Software voor analyse van verkregen CD34+ cellen op FACS array</td></tr><tr><td>BD FACS lysing solution</td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td>Om rode bloedcellen te lyse</td></tr><tr><td>BD LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Instrument voor verwerving van flow cytometry monsters</td></tr><tr><td>BD&nbsp; Vacutainer Plastic Blood Collection Tube</td><td>BD biosciences</td><td>BD 367874</td><td>Om navelstrengbloed te verzamelen</td></tr><tr><td>Bos Serum Albumine&nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A9576</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfine</td><td></td><td></td><td>Gecontroleerde stof en pijnstiller</td></tr><tr><td>CD14-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555398</td><td>Specifiek voor mensen</td></tr><tr><td>CD19-BV605</td><td>BD Biosciences</td><td>562653</td><td>Specifiek voor mensen</td></tr><tr><td>CD34 MicroBead Kit, mens</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-046-702</td><td>Voor isolatie van&nbsp;&nbsp; CD34+ HSPC</td></tr><tr><td>CD34-PE, mens</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-081-002</td><td>Antilichaam gebruikt voor zuiverheidscontrole van geëludeerde CD34+ cellen&nbsp;</td></tr><tr><td>CD3-AF700</td><td>BD Biosciences</td><td>557943</td><td>Specifiek voor mensen</td></tr><tr><td>CD45-PerCPCy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>564105</td><td>Specifiek voor mensen</td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>BD Biosciences</td><td>555349</td><td>Specifiek voor mensen</td></tr><tr><td>CD8-BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562428</td><td>Specifiek voor mensen</td></tr><tr><td>Cell counting slides</td><td>Bio-rad</td><td>1450015</td><td></td></tr><tr><td>ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit</td><td>Thermofisher scientific</td><td>CS11204</td><td>voor extractie van genomisch DNA uit oorstuk</td></tr><tr><td>Cobas Amplicor systeem v1.5&nbsp;</td><td>Roche Molecular Diagnostics</td><td></td><td>bioanalyzer om virale lading te meten</td></tr><tr><td>Katoenen applicatoren&nbsp;</td><td>&nbsp;McKesson</td><td>24-106-2S</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeratin-18 (CK18)</td><td>DAKO</td><td>M7010</td><td>Specifiek voor mensen</td></tr><tr><td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D2650-5X5ML</td><td></td></tr><tr><td>Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile</td><td>BD biosciences</td><td>30914</td><td>Bevestigd aan doseerpijpje en om te laden met HSPC en HEP suspensie</td></tr><tr><td>FACS Diva versie 6</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>flow cytometer software vereist voor&nbsp; verwerving van monster</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>FLOWJO analysesoftware v10.2</td><td>FLOWJO, LLC</td><td></td><td>flow cytometry analysesoftware</td></tr><tr><td>Ganciclovir</td><td>APP Pharmaceuticals, Inc.</td><td>315110</td><td>Voorschriftgeneesmiddel</td></tr><tr><td>Greiner MiniCollect EDTA Tubes</td><td>Greiner bio-one</td><td>450475</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyten ontdooimedium&nbsp;</td><td>Triangle Research Labs&nbsp;</td><td>MCHT50</td><td></td></tr><tr><td>Horizon Open Ligating Clip Appliers</td><td>Teleflex</td><td>537061</td><td>Om de ligatureerclips vast te houden</td></tr><tr><td>Hospira steriele water voor injectie</td><td>ACE surgical supply co. Inc.</td><td>001-1187</td><td>Voor verdunning van Buprenorfine (pijnstiller)</td></tr><tr><td>Human Albumin ELISA Kwantitatieve Set</td><td>Bethyl laboratories</td><td>E80-129</td><td>Voor beoordeling van humane albumine niveaus in muizenserum</td></tr><tr><td>Human hepatocyte</td><td>Triangle Research Labs&nbsp;</td><td>HUCP1</td><td>&nbsp;Cryopreserved humane hepatocyten, inductie gekwalificeerd&nbsp;</td></tr><tr><td>Iris Schaar, Recht</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13295</td><td></td></tr><tr><td>Lancet</td><td>MEDIpoint</td><td>Goldenrod 5 mm</td><td></td></tr><tr><td>LS kolommen&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Gebruikt om CD34+ microbeads te vangen (positieve selectie)</td></tr><tr><td>Lymfocyt Separatie Medium (LSM)</td><td>MP Biomedicals</td><td>50494</td><td>Voor isolatie van&nbsp;&nbsp; lymfocyten uit perifeer bloed</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>houdt Qudro MACS separator en LS kolommen</td></tr><tr><td>McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5605</td><td>Gebruikt om een incisie in de huid te maken om de milt bloot te leggen</td></tr><tr><td>Micro Dissecting Forceps</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5157&nbsp;</td><td>om de milt uit de buikholte te trekken en vast te houden</td></tr><tr><td>muis CD45-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>553080</td><td>muis-specifiek</td></tr><tr><td>PBS (Phosphate Buffered Saline)</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td></td></tr><tr><td>Qudro MACS separator&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>houdt vier LS kolommen</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>StepOne Plus Real Time PCR&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>Instrument gebruikt&nbsp; om&nbsp; te genotyperen</td></tr><tr><td>Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml</td><td>DYMAX CORP</td><td>T15469</td><td>Gebruikt om&nbsp; HSPC en HEP suspensie op een gecontroleerde manier te doseren</td></tr><tr><td>Suturevet PGA synthetisch absorbeerbare hechting</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>41178</td><td>Hechten van huid en peritoneum</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Thermofisher scientific</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>TC20 geautomatiseerde celteller</td><td>Bio-rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>TK-NOG muizen&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Verstrekt

oprichting van de dubbele gehumaniseerde tk-nog muis model voor hiv-geassocieerde lever pathogenese

Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis

Ondanks de toegenomen levensverwachting van patiënten die geïnfecteerd zijn met humaan immunodeficiëntie virus-1 (HIV-1), is de leverziekte ontstaan als een veelvoorkomende oorzaak van hun morbiditeit. De lever Immunopathologie veroorzaakt door HIV-1 blijft ongrijpbaar. Kleine xenotransplantaatmodellen is diermodellen met humane hepatocyten en menselijk immuunsysteem kunnen de menselijke biologie van de pathogenese van de ziekte recapituleren. Hierin wordt een protocol beschreven om een dubbel gehumaniseerd muismodel tot stand te brengen door humane hepatocyten en CD34+ hematopoietische stam/voorlopercellen (HSPCs) transplantatie, om lever Immunopathologie te bestuderen zoals WAARGENOMEN bij HIV-geïnfecteerde patiënten. Om dubbele reconstitutie te bereiken, mannelijke TK-nog (NOD. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Sug TG (Alb-tk) 7-2/shijic) muizen zijn intraperitoneaal geïnjecteerd met ganciclovir (gcv) doses te elimineren muis transgene levercellen, en met treosulfan voor nonmyeloablative conditionering, die beide vergemakkelijking van humane hepatocyten (HEP) engraftment en menselijk immuunsysteem (zijn) ontwikkeling. Humaan albumine (ALB) niveaus worden geëvalueerd voor lever engraftment, en de aanwezigheid van menselijke immuuncellen in bloed gedetecteerd doorstroming cytometrie bevestigt de oprichting van menselijk immuunsysteem. Het model ontwikkeld met behulp van het protocol beschreven hier lijkt op meerdere componenten van leverschade van HIV-1-infectie. De inrichting ervan kan essentieel blijken te zijn voor onderzoeken naar co-infectie met Hepatitis virus en voor de evaluatie van antivirale en antiretrovirale geneesmiddelen.

De oprichting van een Dual gehumaniseerd muismodel met menselijke lever en immune cellen kan gemakkelijk worden bewaakt bij elke stap met zeer eenvoudige ELISA en flow cytometrie, respectievelijk. Flow cytometrie wordt regelmatig uitgevoerd om de ontwikkeling van een functioneel immuunsysteem te evalueren en om het effect van HIV-infectie op immuuncellen te zien. In Dual gehumaniseerde muizen kan de ontwikkeling van functionele immuuncellen variëren van 15% tot 90% van de lymfocyten poort...

Dit protocol biedt een betrouwbare methode om gehumaniseerde muizen te vestigen met zowel menselijk immuunsysteem als levercellen. Dubbele gereconstitueerde immunodeficiënte muizen bereikt via intrasplenische injectie van humane hepatocyten en CD34+ hematopoietische stamcellen zijn vatbaar voor humaan immunodeficiëntie virus-1 infectie en even leverschade zoals waargenomen in HIV-geïnfecteerde patiënten.

Oprichting van de dubbele gehumaniseerde TK-nog muis model voor HIV-geassocieerde lever pathogenese

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of ...

Het algemene doel van het protocol is het genereren van een gehumaniseerd muismodel met functioneel menselijk immuunsysteem en lever met behulp van menselijke hematopoietische stamcellen en hepato-site. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in genetische lever gehumaniseerde muizen. Deze methode biedt een krachtig hulpmiddel om immunopathologie veroorzaakt door HIV te bestuderen, zoals waargenomen bij mensen.Het aantonen van het proces zal worden door Yimin Sun, een supervisor van de pathologie en microbiologie afdeling, samen met Weimin Wang en Edwrd Makarov, onderzoek technoloog. Om te beginnen, overdracht navelstrengbloed verzameld in heparinized buizen naar een steriele laminaire stroomkast. Voeg PBS toe tot het volume is verhoogd tot 35 milliliter.Leg het monster op de top van lymfocyten scheiding medium en centrifugeren het 400 keer G en op vier graden Celsius gedurende 35 minuten zonder pauzes. Verwijder vervolgens voorzichtig de bovenste plasmalaag en gebruik een transferpipet om de witte buffy coat interface over te brengen naar een nieuwe buis. Hang de buffy jas opnieuw op in 30 tot 40 milliliter ijskoude buffer.Combineer met behulp van een p

establishment-dual-humanized-tk-nog-mouse-model-for-hiv-associated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Het genereren en karakteriseren van tumorspecifieke T-cellen met gehumaniseerde muizen wordt hier beschreven. Human thymusweefsel en genetisch gemodificeerde humane hematopoietische stamcellen worden getransplanteerd in immunodeficiënte muizen. Dit resulteert in de bereiding van een op menselijke immuunsysteem waardoor in vivo onderzoek van anti-tumor immuunrespons.

Met behulp van de BLT Gehumaniseerd Muis als een Stem Cell gebaseerde Gene Therapy tumormodel

This video demonstrates an assay to evaluate the effectiveness of oral combined antiretroviral therapy (oral cART) in a human immunodeficiency virus-1 (HIV-1)-infected humanized mouse model. A combination of drugs targeting HIV-1, including nucleoside reverse transcriptase inhibitors and integrase strand transfer inhibitors, is administered along with a nutritional supplement and antibiotics. Following the consumption of this mixture by the humanized mice infected with HIV-1, the effective...

Oral Combinational Antiretroviral Therapy to Treat HIV-1 Infection in a Humanized Mouse Model

This video demonstrates a method for generating a dual humanized mouse model with a human immune system and liver cells. It involves transplanting human liver cells and hematopoietic stem and progenitor cells into a transgenic immunodeficient mouse via intrasplenic injection, leading to engraftment of liver cells and development of human immune cells.

Developing a Humanized Mouse Model with Human Liver Cells and Immune Cells

The video demonstrates a technique to generate a humanized mouse model with stem-cell-based engineered immunity against the human immunodeficiency virus (HIV). Human fetal thymus tissue and engineered hematopoietic stem cells (HSCs) are implanted into the kidney capsule of a severely immunocompromised mouse. The HSCs, which express chimeric antigen receptors (CARs) against HIV, are mixed in a gelatinous protein mixture that promotes their co-localization with thymus tissue. Post-procedure, the...

Constructing a Humanized Mouse Model with Engineered Immunity against HIV

Dit protocol beschrijft de methoden voor het construeren van een gehumaniseerd muismodel voor beenmerg/lever/thymus met stamcelgebaseerde geëngineerde immuniteit tegen HIV-infectie.

Stamcel-Based Engineered immuniteit tegen HIV infectie in het gehumaniseerde muismodel

Dit protocol biedt een methode om vast te stellen gehumaniseerd muizen (hu-NSG) via Intrahepatische injectie van menselijke hematopoietische stamcellen in straling-geconditioneerd neonatale NSG muizen. De hu-NSG muis is gevoelig voor HIV-infectie en combinatorische antiretrovirale therapie (cART) en dient als een geschikt pathofysiologisch model voor HIV-replicatie en latentie onderzoeken.

Gehumaniseerd knik/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) muis Model voor HIV-replicatie en Latency Studies

Hier beschreven zijn drie experimentele benaderingen voor het bestuderen van de dynamiek van HIV-infectie in gehumaniseerde muizen. De eerste maakt de studie van chronische infectie gebeurtenissen, terwijl de twee laatsten voor de studie van acute gebeurtenissen na primaire infectie of virale reactivatie.

Chronische, acute en Gereactiveerde HIV-infectie in gehumaniseerde Immunodeficiënte Muismodellen

We hebben een protocol ontwikkeld voor de generatie en evaluatie van een gehumaniseerd en menselijk immunodeficiëntievirus besmet NOG muismodel op basis van stamceltransplantatie, intravaginale blootstelling aan het menselijke immunodeficiëntievirus en druppeldigitale PCR RNA Kwantificering.

Gehumaniseerde NOG Muizen voor intravaginale HIV Blootstelling en behandeling van HIV-infectie

Hier presenteren we een protocol om een nieuw rattenmodel van actieve hiv-infectie met chimerische hiv (EcoHIV) vast te stellen, wat van cruciaal belang is voor het verbeteren van ons begrip van hiv-1 virale reservoirs in de hersenen en het aanbieden van een systeem om hiv-geassocieerde neurocognitieve aandoeningen en bijbehorende comorbiditeiten (d.w.z. drugsmisbruik) te bestuderen.

Een rattenmodel van EcoHIV-herseninfectie

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode om orale gecombineerde antiretrovirale geneesmiddelen te leveren die met succes hiv-1-RNA-replicatie bij gehumaniseerde muizen onderdrukken.

Orale gecombineerde antiretrovirale behandeling bij hiv-1 geïnfecteerde gehumaniseerde muizen

Leer een dubbel gehumaniseerd muismodel opzetten met functioneel menselijk immuunsysteem en levercellen voor HIV-gerelateerde leverpathogenese-onderzoek. Deze methode maakt gedetailleerde studie van immunopathologie mogelijk.

Oprichting van de dubbele gehumaniseerde TK-nog muis model voor HIV-geassocieerde lever pathogenese

Meer video's verkennen