qKAT: kwantitatieve Semi-automated te typen van Killer-cel immunoglobuline-achtig Receptor genen
6 maart 2019
Kwantitatieve killer cel immunoglobuline-achtig receptor (KIR) semi-automatische te typen (qKAT) is een eenvoudige high-throughput en kosteneffectieve methode kopiëren nummer type KIR genen voor hun toepassing in de bevolking en ziekte vereniging studies.
Deze methode kan antwoord geven op belangrijke vragen over NK celreceptorgenetica zoals haplotypediversiteit en hoe dit zich verhoudt tot ziekte. Visuele demonstratie van deze methode zal helpen om het protocol in uw laboratorium in te stellen, inclusief het automatiseringsproces en data-analyse. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat qKAT, in tegenstelling tot conventionele methoden, staat voor kwantitatieve KIR geautomatiseerde typen, een hoge doorvoer is en het genexemplaarnummer biedt.
qKAT kan inzicht geven in de associatie van ziekten. De implicaties van deze techniek kunnen nuttig zijn voor therapie voor virale infecties zoals HIV en hepatitis C, bij kanker, bij stamceltransplantatie en zwangerschapsstoornissen. qKAT kan ook worden toegepast bij het bestuderen van populatiegenetica en het verkennen van expressie en functionele interacties tussen KIR- en HLA-moleculen.
qKAT bestaat uit 10 multiplexreacties die specifiek gericht zijn op exonen van de twee KIR-genen en één referentiegen. In dit protocol zijn specifieke primers ontworpen om de allelen van het gegeven gen en PCR-resultaten in korte amplicons te detecteren. Hierna worden tweegelabelde specifieke hydrolysesondes gebruikt om de PCR-versterking in realtime te monitoren.
Copy number analyse maakt gebruik van relatieve kwantificering van de doel KIR genen om een referentie gen. qKAT is ontworpen en opgezet om een hoge doorvoertechniek te zijn. Vandaar dat elke reactie kan worden uitgevoerd op iets minder dan 1.000 monsters.
De volgende stappen tonen de stappen die betrokken zijn bij de voorbereiding en beplating van elke 96-put DNA-plaat. Om te beginnen, na het kwantificeren van DNA, verdun het DNA in een 96-goed diep-goed plaat. Neem ten minste één besturingselementvoorbeeld op met een bekend kopienummer en één niet-sjabloonbesturingselement.
Centrifuge de plaat op 450 gs gedurende twee minuten. Dan, doe elk monster in viervoudige in 384-well qPCR platen. Daarna droogt de lucht het DNA 24 uur lang op kamertemperatuur in een schone ruimte.
Om één qKAT-reactie op te zetten voor 10 384-putplaten, ontdooit u eerst eerst de qPCR-buffer, primer en sonde aliquots bij vier graden Celsius. Bereid de master mix op ijs volgens het tekstprotocol. Gebruik vervolgens een multi-channel pipet om de master mix gelijkmatig over een 96-well deep-well plaat te verdelen.
Doe 9,5 microliter van de master mix in elke put van de plaat met de gedroogde gDNA monsters. Sluit hierna de plaat af met folie en bewaar deze onmiddellijk op vier graden Celsius. Vergeet niet om een korte waterwas uit te voeren om de naalden van de vloeibare handling systeem schoon te maken als het afgeven van master mix op meer dan een 384-well DNA-plaat.
Centrifugeren de plaat met de gDNA monsters op 450 gs gedurende drie minuten. Vervolgens, incubeer de plaat op 4 graden Celsius om het DNA opnieuw op te zetten en alle luchtbellen te verdrijven. Na het uitbroeden van de plaat 's nachts, herhaal de centrifugatie om eventuele luchtbellen te verdrijven.
Plaats vervolgens de plaat in het gekoelde opslagdok. Sluit de qPCR-machine aan op een microplate-handler. Programmeer vervolgens de microplate-handler volgens het tekstprotocol.
Zodra de run is voltooid, laat de robot de plaat van de qPCR-machine verzamelen en in het teruggooidok plaatsen. Na het voltooien van de versterking, open de qPCR software. Open onder het tabblad Navigator het opgeslagen reactieexperimentbestand voor een plaat.
Open vervolgens het venster Nieuwe analyse maken en selecteer de juiste instellingen voor de methode 2e afgeleid max. Selecteer vervolgens Filter Comb en zorg ervoor dat de gegevens die voor STAT6 zijn verzameld, zijn geselecteerd. Selecteer de juiste kleurcompensatie.
Klik op Berekenen en klik vervolgens op Bestand opslaan. Als u de gegevens wilt analyseren met de methode Geschikte punten, opent u het venster Nieuwe analyse maken en selecteert u de juiste instellingen voor de methode Geschikte punten. Selecteer vervolgens de juiste filters en kleurcompensaties voor STAT6.
Stel de ruisband in om het achtergrondgeluid uit te sluiten. Open hierna het tabblad Analyse en stel de paspunten in op drie en selecteer Fit-punten weergeven. Sla wijzigingen op en herhaal de stappen met de juiste instellingen voor Fit Point en 2nd Derivative-analyse voor de KIR-genen.
Open het tabblad Navigator in de qPCR-software en selecteer Batch exporteren. Open vervolgens de map met de experimentbestanden en breng deze over naar de rechterkant van het venster. Klik op Volgende en selecteer de naam en locatie van het exportbestand.
Selecteer hierna het analysetype interesse en klik op Volgende. Controleer of de naam van het bestand, de exportmap en het analysetype correct zijn voordat u op Naast klikken om het exportproces te starten. Wanneer de exportstatus verandert in OK, wordt het scherm automatisch naar de volgende stap verplaatst.
Controleer of alle geselecteerde bestanden zijn geëxporteerd en klik op Gereed. Gebruik vervolgens de scripts in het tekstprotocol om de geëxporteerde platen op te splitsen in individuele reacties en om de bestanden om te zetten in een software die leesbaar is door analysesoftware voor kopienummer. Open vervolgens de analysesoftware voor kopienummeranalyse en selecteer Realtime PCR-resultatenbestand importeren om de tekstbestanden te laden die door de scripts zijn gemaakt.
Selecteer ten slotte Analyseren en voer de analyse uit door het meest voorkomende voorbeeldkopienummer te selecteren. In dit protocol werd semi-geautomatiseerd typen, of qKAT, gebruikt om nummertype KIR-genen te kopiëren. Het meest voorkomende exemplaarnummer voor KIR2DL4 was twee exemplaren, terwijl het meest voorkomende kopienummer voor KIR3DS1 nul was.
Tijdens het proberen van deze procedure, is het uiterst belangrijk om ervoor te zorgen dat het DNA nauwkeurig wordt gekwantificeerd, om alle stappen op ijs uit te voeren, en ervoor te zorgen dat de reagentia zijn bedekt met licht. Het is ook belangrijk om grondige controles uit te voeren op de ruwe gegevens voor monsters die niet voldoen aan de bekende LD-regels voor KIR-genen. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals sequencing worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, bijvoorbeeld de aanwezigheid van fusiegenen of de identificatie van nieuwe allelen.
Na de ontwikkeling maakte deze methode de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van immunogenetica om de rol van KIR in NK celbiologie, ziekteresistentie en menselijke voortplanting te onderzoeken.
Overzicht
De kwantitatieve semi-geautomatiseerde typering van killer cell immunoglobulin-like receptoren (qKAT) is een high-throughput methode voor het typeren van KIR-genen. Deze techniek draagt bij aan het begrip van de genetica van NK-celreceptoren en de implicaties hiervan bij diverse ziekten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Immunogenetica
- Populatiegenetica
- Celbiologie
Achtergrond
- KIR-genen spelen een cruciale rol in de immuunrespons.
- Inzicht in haplotype-diversiteit is belangrijk voor studies naar ziekteassociaties.
- Conventionele methoden hebben vaak een lage doorvoersnelheid en zijn kostbaar.
- qKAT biedt op efficiënte wijze informatie over het aantal genkopieën.
Doel van de studie
- Om een methode met een hoge doorvoer te ontwikkelen voor KIR-genotypering.
- Om de relatie tussen KIR-genetica en ziekten te onderzoeken.
- Om onderzoek in de immunogenetica en populatiestudies te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Ontwerp van specifieke primers voor de detectie van KIR-genen.
- Gebruik van multiplexreacties gericht op KIR-genen en een referentiegen.
- Real-time PCR voor het monitoren van de amplificatie.
- Data-analyse via gespecialiseerde software voor de bepaling van het kopie-aantal.
Belangrijkste resultaten
- qKAT kan bijna 1.000 monsters in één run verwerken.
- De meest voorkomende kopie-aantallen voor KIR2DL4 en KIR3DS1 werden geïdentificeerd.
- De methode bleek betrouwbaar bij het kwantificeren van KIR-gen kopie-aantallen.
- Dit faciliteerde verdere exploratie van de rol van KIR bij ziekten.
Conclusies
- qKAT is een waardevolle tool voor onderzoekers in de immunogenetica.
- Het vergroot het begrip van de functies van KIR-genen bij gezondheid en ziekte.
- De methode kan worden aangepast voor diverse toepassingen in de populatiegenetica.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Nauwkeurige genotypering van polymorfe immuunreceptorloci zoals KIR is essentieel voor het verminderen van risico's bij targetvalidatie in immunologisch en transplantatieonderzoek. qKAT maakt kopieaantalanalyse met een hoge resolutie mogelijk over grote cohorten, wat mechanistische inzichten ondersteunt in NK-cel-gemedieerde ziekteresistentie en therapeutische respons. Deze mogelijkheid versterkt het voorspellend vertrouwen in vroege ontdekking door genetische variatie te koppelen aan functionele uitkomsten in ziektemodellen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om variaties in het kopie-aantal van KIR-genen te onderzoeken om haplotype-diversiteit en de impact daarvan op de receptorfunctie van NK-cellen te verduidelijken.
- Operationele waarde: Biedt semi-geautomatiseerde, high-throughput genotypering die compatibel is met 96- en 384-wells formats voor schaalbare monsterverwerking.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve, reproduceerbare kopie-aantallen voor alle KIR-genen met behulp van multiplex real-time PCR met hydrolysesondes.
- Operationele waarde: Ondersteunt de standaardisatie van de assay via normalisatie met referentiegenen en vooraf gedefinieerde analyse-workflows (2nd Derivative Max, Fit Points).
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert het onderzoek naar KIR-HLA-interacties in ziektecontexten zoals virale infecties, kanker en transplantaties.
- Operationele waarde: Genereert haplotype-informatieve gegevens die bruikbaar zijn in downstream sequencing of functionele assays voor de ontdekking van nieuwe allelen.
Integratie van Pipeline & Workflow
qKAT past binnen het ontdekkingscontinuüm van het testen van doelhypothesen tot preklinische validatie, in het bijzonder daar waar immuun-effectormechanismen de therapeutische effectiviteit beïnvloeden.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door het aantal kopieën van KIR te koppelen aan NK-celactiviteit bij ziekte-geassocieerde fenotypen.
- Screening: Maakt gebruik van direct inzetbare biologische systemen met gedefinieerde KIR-genotypen voor het screenen van verbindingen in immuun-gemedieerde modellen.
- Analytics: Levert relatieve kwantificeringsgegevens die geschikt zijn voor copy number calling en statistische vergelijking tussen experimentele groepen.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt genetische profilering met preklinische continuïteit in modellen van immuunreconstitutie of graft-versus-host-ziekte.
- Enterprise Hergebruik: Ontworpen als een herbruikbaar genotyperingsplatform dat toepasbaar is binnen portfolio's voor immunologie, oncologie en reproductieve gezondheidszorg.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van immuuntargets door middel van genetische profilering met hoge resolutie van polymorfe loci.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde reagentia-afhandeling, bereiding van de mastermix in de koudeketen en geautomatiseerde plaatverwerking.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door grootschalige genetische stratificatie in vroege fase-studies mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang door de identificatie van KIR-haplotypen die geassocieerd zijn met een differentieel behandelingsrespons.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de opzet van real-time PCR, het ontwerp van primers/probes en software voor kopie-aantalanalyse.
- Afhankelijk van qPCR-instrumentatie die compatibel is met 384-well platen en microplaat-handlers voor automatisering.
- Necessiteert cross-team standaardisatie van DNA-kwantificering, consistentie bij het vullen van platen en contaminatiecontroles.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij uitbreiding naar niet-humane modellen of alternatieve referentiegenen.
- Bevat praktische beperkingen zoals de noodzaak van nauwkeurige DNA-kwantificering, lichtgevoelige reagentia en QC van ruwe data voor naleving van de LD-regel.
