Bloedplaatjes gebaseerde detectie van stikstofmonoxide in bloed door het meten van VASP fosforylatie

Dit protocol richt zich op het mogelijke gebruik van bloedplaatjes als zeer gevoelige stikstofmonoxidesensor, zowel in vitro als in vivo in het bloed. Verhoogde fosforylated Vasodilator-Gestimuleerde Fosphoprotein of P-VASP serine 239 in bloedplaatjes stikstofmonoxide heeft een aantal voordelen, waaronder het vermogen om de aanwezigheid van stikstofmonoxide in nanomoerische geslachten te detecteren. Binnen twee uur na het verzamelen van 30 tot 50 milliliter volbloed van een gezonde donor, voeg vijf milliliter aliquots van het bloed in het juiste aantal van 15 milliliter conische buizen voor centrifugatie.

Gebruik een plastic transfer pipet om het bloedplaatjesrijke plasma voorzichtig te verzamelen uit het bovenste gedeelte van de supernatants. Pellet de plasma-rijke bloedplaatjes met een tweede centrifugatie en voorzichtig wassen van de pellets in vijf milliliter CGS buffer. Centrifuge op 400 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Aan het einde van de centrifugatie, resuspend de pellets in drie milliliter van gemodificeerde Tyrode buffer. Gebruik een hemocytometer voor het tellen en pas de dichtheid van de bloedplaatjessuspensiesussenspensies aan op drie keer 10 tot de achtste cellen per milliliter in de verse Tyrode-buffer. Dan incubeer de bloedplaatjes schorsingen voor een uur op 37 graden Celsius.

Verzamel ondertussen de rode bloedcellen uit de plaatvrije plasmalagen van de bloedmonsters door centrifugatie, gevolgd door vier wasbeurten in vijf milliliter PBS per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt, gooi de supernatants en meng de rode bloedcellen met een milliliter van de plasma-rijke bloedplaatjes op de juiste experimentele hematocriet in polypropyleen flessen gesloten met rubberstoppers. Steek een naald aangesloten op een helium gastank in elke septa en steek 26 meter naalden om gasuitlaten te maken.

Draai vervolgens langzaam de flessen op kamertemperatuur en gebruik een oximeter om de gedeeltelijke zuurstofdruk te meten voor het monitoren van het zuurstofproces. De snelheid van zuurstofdaling is afhankelijk van de heliumstroomsnelheid en de roersnelheid. Daarom moet de tijd van de oxygenatie worden geoptimaliseerd voordat een experiment wordt begonnen, omdat dit sterk afhankelijk is van de geometrie van de experimentele opstelling.

Voor de vermindering van nitriet in rode bloedcellen gebruikt u een microsyringe om nitriet via het septum in de zuurstofarme monsters van PRP en RBC's te injecteren, zodat een uiteindelijke concentratie van 10 micromolar wordt bereikt. Incubeer de monsters gedurende ten minste 10 minuten bij 37 graden Celsius en breng één milliliter van elk monster over in een microcentrifugebuis voor centrifugatie. Breng 300 microliter bloedplaatjessuspensie van het bovenste gedeelte van de supernatants over in nieuwe microcentrifugebuizen en voeg zuurcitraatdextrose toe aan elke buis met een verhouding van één tot negen.

Centrifugeren de bloedplaatjes opnieuw en resuspend de pellets in 80 microliters van ijskoude lyse buffer met proteaseremmer cocktail drie aan elke buis. Laad vervolgens 15 microgram eiwit uit elk monster tot twee afzonderlijke 10% SDS-PAGE gels. Voer de gels op 120 volt gedurende 1,3 uur.

Breng de gels aan het einde van de run over op individuele stikstofcellulosemembranen en blokkeer elke niet-specifieke binding met een passend volume van 5%vetvrije droge melk. Incubeer de membranen met de juiste primaire antilichamen 's nachts bij vier graden Celsius, gevolgd door etikettering met een geschikte secundaire paardenradoxidase antilichaam gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Stel vervolgens de membranen bloot met een imager om de banddichtheid te kwantificeren met een geschikt beeldanalyseprogramma.

Gezonde veneuze bloedmonsters hebben gedeeltelijke zuurstofdrukwaarden tussen 50 tot 80 millimeter kwik. Deoxgenatie door helium vermindert snel de gedeeltelijke druk van zuurstof tot 25 millimeter kwik binnen 10 minuten. Verdere vermindering van de gedeeltelijke zuurstofdruk kan worden bereikt met een verhoogde deoxygenatietijd.

Verhoogde deoxygenatie leidt tot verhoogde niveaus van hemolyse zoals aangegeven door steeds rode kleurenplasma. Dit is een effect van deoxygenatie en wordt niet veroorzaakt door zelf te roeren, zoals aangegeven door het gebrek aan hemolyse in monsters geroerd zonder helium. Zowel Vasodilator-Gestimuleerde Fosfor of VASP en Fosforylated-VASP expressie niveaus in bloedplaatjes daalde met toenemende hematocriet in zuurstofarme monsters zoals gedetecteerd door westerse vlek.

Behandeling met een kortlevende stikstofmonoxidedonor verhoogt de fosforyleerde vaatverwijdende fosfoverexpressie in bloedplaatjes binnen 10 seconden na de behandeling. Verder bleven de niveaus van fosforylated-VASP of P-VASP stabiel tot 10 minuten na incubatie van de NO-donor met bloedplaatjesrijk plasma, wat aangeeft dat er voldoende tijd is om RBC's van bloedplaatjes te scheiden zonder dat dit gevolgen heeft voor de bestaande P-VASP-niveaus. Nitriet verhoogt ook de P-VASP-niveaus van bloedplaatjes in aanwezigheid van geoxygeneerde RBC's.

Hier is de verhouding van P-VASP tot totale VASP afhankelijk van het niveau van hematocriet. VASP wordt sterk uitgedrukt in bloedplaatjes en wordt snel fosforylated in aanwezigheid van stikstofmonoxide. Daarom biedt dit protocol een methode voor het bestuderen van de inductie van stikstofmonoxide door verschillende fysiologische stimuli.

Met deze methode hebben we met succes verhoogde P-VASP in bloedplaatjes gebruikt als marker van stikstofmonoxidestimulatie door ingeademde nitriet in vivo. Vergeet niet dat het werken met bloedplaatjes met een biologisch monster altijd moet worden uitgevoerd met behulp van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.