Zuivering van H3 en H4 Histone eiwitten en de kwantificering van geacetyleerd Histone merken in cellen en hersenweefsel

Deze methode maakt nauwkeurige kwantificering van de kern histonen H3 en H4 en hun post-translationele wijzigingen uit cel-en weefselextracten die bijgevolg leiden tot het genereren van hoge kwaliteit, reproduceerbare resultaten. De gepresenteerde techniek heeft drie belangrijke voordelen. Ten eerste behoudt het inheemse post-translationele wijzigingen van histonen.

Ten tweede omzeilt het dure methoden voor lage doorvoer. Ten slotte is het volledig compatibel met downstream medium-throughput toepassingen. Het aantonen van de procedure zal Karolina Janczura een getalenteerde afgestudeerde student uit mijn laboratorium die volledig geoptimaliseerd dit protocol en gebruikte de techniek om belangrijke vragen met betrekking tot epigenetische regulering bij de ziekte van Alzheimer te beantwoorden.

Om te beginnen plaat de cellen in 10-centimeter weefsel cultuur behandelde gerechten met de juiste cel cultuur media volgens de tekst protocol. Laat de cellen groeien tot ze ongeveer 90% samenvloeiing bereiken. Nadat de cellen de gewenste samenvloeiing hebben bereikt, evenals de kweekmedia en was de cellen twee maal met voorverwarmde serumvrije media.

Verwijder hierna de serumvrije media uit de cellen en leg de 10-centimeter schotels op ijs. Voeg een milliliter ijskoude extractiebuffer toe aan elke schotel. Met behulp van een plastic cel schraper verzamelen van de cellen in de extractie buffer en breng ze naar een gelabelde 1,5-milliliter buis.

Leg dan de buizen op ijs. Als bevroren weefsel wordt gebruikt, plaats het weefsel in een voorgekoelde 1,5 milliliter buis en even ontdooien op ijs. Vervolgens homogeniseren het hersenweefsel met een handheld homogenisator met behulp van de aanbevolen hoeveelheid extractie buffer en het aantal slagen.

Homogenisatie is voltooid wanneer er geen zichtbare weefselfragmenten zijn en de oplossing een melkachtig uiterlijk krijgt. Gebruik hierna een single-channel 1.000-microliter pipet om het homogenaat over te brengen naar een voorgekoelde buis van 1,5 milliliter en leg de buizen op ijs. Plaats de buis met de cellysates en gehomogeniseerd hersenweefsel op een roterend platform draaien op 15 RPMs op vier graden Celsius.

Daarna, centrifugeren de buis op maximale snelheid gedurende 10 minuten op vier graden Celsius. Breng vervolgens de supernatant over naar een nieuwe voorgekoelde buis van 1,5 milliliter en gooi de pellet weg. Neutraliseer vervolgens de histonen met een 1/4 volume neutralisatiebuffer en meng door op en neer te pipetten.

Gebruik pH-strips om de pH van het mengsel te controleren en pas de pH indien nodig verder aan met neutralisatiebuffer. Als zure histonen tijdens deze stap niet worden geneutraliseerd, binden ze zich niet goed aan het kolommembraan, gaan ze er doorheen en worden ze gedetecteerd in de doorstroom. Voeg 37,5 microliter van het monster toe aan 12,5 microliter monsterbuffer.

Na een korte centrifugatie denature het mengsel op 99 graden Celsius gedurende 10 minuten. Plaats hierna de buizen op ijs en draai ze kort om condensaat te verzamelen. Laad het monster op een SDS-PAGE gel en voer de gel op 100 volt gedurende een uur.

Bevlek de gel dan 's nachts. En houd het vast tijdens drie opeenvolgende wasbeurten. Voeg eerst 500 microliter van evenwichtsbuffer toe aan elke rotatiekolom.

Centrifuge de kolom gedurende drie minuten. Gooi de doorstroom weg en herhaal de centrifugatie nog een keer. Voeg hierna 500 microliter van het monster toe aan de kolom.

Centrifuge de kolom gedurende drie minuten en het verzamelen van de flow-through. Analyseer vervolgens de kolomstroomdoorgang zoals eerder beschreven. Voeg 500 microliter wasbuffer toe aan de kolom.

Centrifuge de kolom gedurende drie minuten en het verzamelen van de flow-through. Breng de kolom over naar een nieuwe gelabelde buis van 1,5 milliliter. Voeg 50 microliters histone elution buffer toe aan de kolom.

Na het centrifugeren van de kolom sla de flow-through met histon eiwitten. Onder een chemische kap voeg perchloorzuur aan de gezuiverde histonen om een definitieve concentratie van 4% perchloorzuur te bereiken. Pipette zes keer op en neer om te mengen.

Als de histonen in het monster zeer geconcentreerd zijn, zal de oplossing troebel worden na de toevoeging van perchloorzuur. Daarna, incubeer de buis op vier graden Celsius voor 24 uur. Als de histone neerslag 's nachts succesvol is, zal een kleine witte pellet zichtbaar zijn op de bodem van de flacon na de centrifugatiestap.

Bij het wassen van de pellet in de opeenvolgende stappen zorgen ervoor dat de pellet niet wordt verstoord omdat het gemakkelijk los kan komen van de flaconbodem. De volgende dag centrifugeren de monsters gedurende 75 minuten in voorgekoelde microcentrifugebuizen. Zorgvuldig aspirate de supernatant en voeg 500 microliters ijskoude perchloorzuur aan de pelleted monster.

Na het centrifugeren van het monster gedurende 10 minuten op maximale snelheid, aspirate de supernatant. Voeg 500 microliter ijskoude aceton toe aan het monster en zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord. Verwijder vervolgens de supernatant en laat de buizen te drogen uncapped op ijs voor 30 minuten.

Haal vervolgens de buizen uit het ijs en laat het monster vijf minuten drogen bij kamertemperatuur. Nadat de pellet droog is, wordt deze opnieuw opgetrokken in 30 microliter steriel water. Dop de buizen af en laat de histonen 30 tot 50 minuten op ijs reconstrueren.

Na controle of de pellet opnieuw wordt opgetrokken, recapituleren de buizen en verwijder ze uit het ijs. In dit protocol werden histonen van menselijke microgliale BV-2 cellen gezuiverd en werd de extractsamenstelling geanalyseerd. De gekleurde gel toont aan dat de extractietijden tussen 15 minuten en 24 uur geen invloed hadden op de algehele samenstelling van de ruwe histonextracten.

De efficiëntie van histone binding aan de matrix van de kolom werd geanalyseerd via kleuring van de gel. De kolomefficiëntie was ongeveer 100%, zoals blijkt uit de afwezigheid van detecteerbare histoneiwitten in de kolomstroom. Ongeacht de duur van de extractietijd, d.w.z.

15 minuten, twee uur of 24 uur. eerste kolom wassen elimineert de grootste hoeveelheid niet-histon eiwitten uit het extract. De gezuiverde histoneiwitfracties van de 24-uurs extractiegroep bevatten meer H3- en H4-histonen in vergelijking met 15 minuten en twee uur extractietijden.

De eerste kolom elutie was ongeveer 100% efficiënt, zoals blijkt uit het ontbreken van histon eiwitten in de tweede eluaat. Ruwe histonen werden vervolgens gewonnen uit hele muis hersenen en post-translationele wijzigingen werden gemeten. In reactie op de breedwerkende HADC-remmer, tributyrin, H4K12 acetylatie toegenomen in het extract.

De specificiteit van het antilichaam daalde echter als gevolg van de aanwezigheid van onzuiverheden in het ruwe extract. Het histonzuiveringsprotocol werd voltooid met de prefrontale cortex van drievoudige transgene A/D muizen behandeld met de Klasse I en IIb HDAC remmer, M344, en de enkele zuivere kern histone fractie werd geëvalueerd voor veranderingen in H4K12 acetylatie. Totale histonen werden gedetecteerd en een aanzienlijke toename van H4K12 acetylatie werd waargenomen in reactie op M344.

Tijdens het proberen van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om de meerdere controlepunten beschreven binnen het protocol uit te voeren om succesvolle histonzuivering gedurende het hele proces te valideren. Na deze procedure kunnen aanvullende vragen met betrekking tot histonfoylatie en methylatiestatus worden beantwoord. De ontwikkeling van deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers in ons lab om de genetische mechanismen te analyseren die betrokken zijn bij de ziekte van Alzheimer.

Het kan echter worden gebruikt in een verscheidenheid van ziektemodellen waar chromatine modificatie wordt verondersteld om een belangrijke rol te spelen.