Name: Fluorescerende zilveren kleuring van eiwitten in Polyacrylamide Gels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Leer een nieuwe fluorescerende zilverkleuring voor eiwitten in polyacrylamidegels met een fluorogene zilverprobe. Deze methode biedt hogere gevoeligheid en eenvoudiger protocol dan traditionele zilvernitraatkleuring.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedank Patrick Chan in de Ming Wai Lau centrum voor herstellend geneeskunde, Karolinska Institutet, voor zijn technische ondersteuning. S. X. is dankbaar voor de steun van de Zweedse Onderzoeksraad (Grant No. 2017-06344).

1. voorbereiding van het Gel
Opmerking: De demonstratie volgt een standaardprotocol ter voorbereiding van het gel van kleuring kort na SDS-pagina12. Kortom, de volgende stappen beschrijven de voorbereiding van de monsters en gel elektroforese.
<ol><li>SDS-pagina met 4% - 12% Bis-Tris eiwit gels (1 mm, 15-well) uitvoeren met behulp van een mini gel tank gevuld met 2-(N -morfolino) ethanesulfonic zuur (MES) buffer.</li>
	<li>Verdun de monsters met een mengsel van gedestilleerd water, lithium dodecyl sulfaat (LDS) buffer en een monster-reducerende agent.</li>
	<li>Laden van de eerste baan met dubbele van het bedrag van aandelen (10 µL), gevolgd door de normale voorraad bedrag (5 µL) en een reeks tweevoudige verdunningen van het materieel daarna (13 verdunningen, van 2 x tot 8192 x).</li>
	<li>Stel de gel met een constante spanning van 200 V voor 30 min.</li>
</ol>2. de fixatie van het Gel
<ol><li>Na elektroforese, dompelen de gels in een 100 mL oplossing van 40% ethanol/10%-azijnzuur op een roteerschudapparaat 50 rpm bij kamertemperatuur 2 x (elk gedurende 30 minuten), of 's nachts bij 4 ° C.</li>
	<li>De gels 3 x 10 minuten, elk in ultrazuiver water in een schone recipiënt te wassen. De wassen stap is essentieel. Als het zuur uit de fixing oplossing is niet correct verwijderd in de derde stap van fluorogenic, de buitensporige TPE-4TA wordt geactiveerd door het zuur en leiden tot sterke achtergrond fluorescentie in de gel.</li>
</ol>3. voorbereiding van de AgNO3oplossing en zilveren impregneren van het Gel
<ol><li>Om de oplossing3 AgNO (0,0001%) voor de impregnering, de eerst los 0.01 g van AgNO3 in 10 mL ultrazuiver water voor te bereiden van een stamoplossing van 0,1% AgNO3 . Voeg 100 µL van de stockoplossing van 0,1% AgNO3 vervolgens in 100 mL ultrazuiver water om de werkoplossing. Opmerking: De AgNO3 oplossing moet worden opgeslagen in het donker vóór gebruik.</li>
	<li>De gel met 100 mL werkoplossing gedurende 1 uur op een roteerschudapparaat 50 rpm in een gesloten glazen container zilver impregneren. Het is van cruciaal belang voor het uitvoeren van de zilveren impregnering onder een zuurkast, beschermd tegen licht met aluminiumfolie.</li>
	<li>Wassen van de gel met ultrazuiver water (ongeveer 100 mL) in een schone container voor 2 x 60 s.</li>
</ol>4. Fluorogenic ontwikkeling van het Gel
<ol><li>Ter voorbereiding van de stockoplossing kleurstof (0.1 mM), in 50 mL ultrazuiver water met toevoegen van 3,0 mg van de kleurstof TPE-4TA . Bewerk ultrasone trillingen ten de oplossing voor een paar minuten en sommige NaOH-oplossing (bijvoorbeeld 1 M) om te helpen oplossen van de kleurstof toe te voegen.</li>
	<li>Controleer de fluorescentie van de oplossing onder een 365 nm UV lamp om ervoor te zorgen dat de kleurstof molecule volledig is opgelost. Zwakke of nonemissive oplossingen geven alleen volledige ontbinding. Opmerking: De kleurstof die TPE-4TA werd gesynthetiseerd volgende het protocol onlangs gemeld door Xie et al. 10 de TPE-4TA oplossing is zeer stabiel en kan worden bewaard in het donker voor maanden.</li>
	<li>Ter voorbereiding van 100 mL van de fluorogenic ontwikkelen oplossing (10 µM), voeg toe 10 mL van de stockoplossing van TPE-4TA in 90 mL ultrazuiver water. Controleer de pH van de oplossing met behulp van een pH-meter en het af te stemmen op 7-9 met behulp van een natriumhydroxide-oplossing (1 µM).</li>
	<li>De gel overbrengen in een schone en afsluitbare container met 100 mL van de fluorogenic ontwikkelen oplossing. Zorg ervoor dat de gel is volledig ondergedompeld in de oplossing. Het verzegelen van de container. Van licht het deksel, en schud het 's nachts op een roteerschudapparaat 50 rpm bij kamertemperatuur. Als alternatief, de incubatie stap kan ook worden verkort tot ongeveer ~ 2 h door de voorverwarming van de oplossing AIE ontwikkelen tot 80 ° C voor vlekken en dan het verlaten bij kamertemperatuur.</li>
</ol>5. destaining en beeldvorming
<ol><li>Breng de gel aan een schone container en het destain in 100 mL 10% ethanol voor 30 min. Opmerking: Alleen Water kan worden gebruikt om te wassen van de gel. Het is echter tijd efficiënter te gebruiken van een 10% ethanol-oplossing voor de destaining. Dit zal helpen te verminderen van het destaining proces van uur tot 30 min.</li>
	<li>Spoel de gel in ultrazuiver water gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Het imago van de gel op de 365 nm-kanaal of 302 nm kanaal door een gel documentatie machine.</li>
</ol>

<ol><li>Chevalier, F. <a target="_blank" href="https://proteomesci.biomedcentral.com/articles/10.1186/1477-5956-8-23">Highlights on the capacities of &#34;Gel-based&#34; proteomics.</a> Proteome Science. 8 (1), (2010).</li>
<li>Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+detection+methods+for+gel-based+proteomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses.</a> Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).</li>
<li>Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics%3A+assessing+the+spectrum+of+in-gel+protein+detection+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods.</a> Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).</li>
<li>Candiano, G., Bruschi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+silver%3A+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).</li>
<li>Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Silver staining of proteins in polyacrylamide gels.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).</li>
<li>Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+silver+staining+of+protein+in+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+an+azo+dye%2C+calconcarboxylic+acid%2C+as+a+silver-ion+sensitizer%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).</li>
<li>Celis, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCelis%2C+JE+%22Cell+Biology%3A+A+Laboratory+Handbook%22">Cell Biology: A Laboratory Handbook</a>. , Elsevier Academic Press. Amsterdam, the Netherlands. (2006).</li>
<li>Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+Staining+Techniques+of+Polyacrylamide+Gels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels.</a> Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).</li>
<li>Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver-staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels%3A+a+general+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview.</a> Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).</li>
<li>Zhou, M., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analysis+by+Two-Dimensional+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Protein+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).</li>
<li>Xie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+Ag%2B-Tetrazolate+Aggregation+Enables+Efficient+Fluorescent+Biological+Silver+Staining%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).</li>
<li>Protein gel electrophoresis technical handbook. , Thermo Fisher Scientific. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015).</li>
</ol>

Een octrooiaanvraag op deze TL zilveren kleuring is ingediend.

Hier is een nieuwe TL silver kleuring methode voor eiwitten in polyacrylamide gels. Deze strategie integreert conventionele zilveren vlekken en fluorescerende vlekken. De kleuring exploot de selectieve binding van zilveren ion aan eiwitten zoals in andere zilver vlekken maar maakt gebruik van een hooggevoelige fluorogenic silver sonde TPE-4TA aan het licht van de zilveren afhankelijke eiwitten. Aangezien de fluorogenic sonde TPE-4TA kan zin zilver-ionen in een vrij lage concentratie in d...

Vele kleuring methoden zijn gebruikt om te visualiseren van eiwitten na de Elektroforese van het gel, bijvoorbeeld met behulp van colorimetrische kleurstoffen zoals Coomassie briljant blauw, zilver vlek, fluorescentie, of radioactieve labeling van1,2, 3 , 4. Zilveren kleuring wordt beschouwd als een van de meest gevoelige technieken voor de detectie van de eiwitten die eenvoudige en goedkope reagentia. Het kan worden onderverdeeld in twee grote families: de ammoniumstikstof zilveren vlek en de zilvernitraat vlek5,6. In de alkalische ammoniumstikstof zilveren methode, is de zilver-diamine-complex geproduceerd met ammoniak en natriumhydroxide en gereduceerd tot metallisch zilver tijdens de ontwikkeling met behulp van een zure formaldehyde-oplossing. De vlek herbergt efficiënt voor fundamentele eiwitten maar toont een gecompromitteerde prestaties voor zure en neutrale eiwitten en is bovendien beperkt tot klassieke glycine en taurine elektroforetische systemen. Ter vergelijking: de zilvernitraat vlekken exploiteren de hoge bio-affiniteit van zilver ionen aan proteïne, voornamelijk de sulfaatzuurstof carboxyl groepen van de zijketens en de neiging om vlekken van zure eiwitten efficiënter7. Na zilver ion bindend, een derde oplossing (meestal gemaakt van een oplossing van de metalen carbonaat met formaldehyde en natrium thiosulfaat) wordt toegepast ter vermindering van zilver-ionen tot metallisch zilver korrels, die een kleur bruin-naar-dark opbouwen te visualiseren de eiwit bands.
Hoewel zilver kleuring goed-gekend voor zijn veelzijdigheid en hoge gevoeligheid sinds haar ontwikkeling in de jaren 1970-8 is, wordt de methode vaak beschouwd als lastig. Zilver-kleuring methoden hebben tijd-beperkte stappen en reproduceerbaarheid van de lage tonen. Omdat de kleur van de zilveren vlek meestal niet is uniform en afhankelijk van de vermindering van de stap, die moeilijk te controleren is, de zilveren vlek is niet een kwantitatieve methode en, dus, niet aanbevolen voor gel vergelijking studie en eiwit kwantificering9. Methoden geoptimaliseerd in gevoeligheid kunnen gebruik maken van aldehyden die kunnen ook zorgen voor een meer uniform kleuring10. Dit is echter ten koste van verder stroomafwaarts analyse als gevolg van het crosslinking van eiwitten door aldehyden. Snelle protocollen meestal combineren of verkorten stappen ter vermindering van de tijd, de reproduceerbaarheid en de eenvormigheid van de vlek5in gevaar te brengen. Dientengevolge, zijn er talrijke zilver kleuring varianten binnen eiwit gel kleuring, elk geoptimaliseerd voor bepaalde wensen; bijvoorbeeld, eenvoud, gevoeligheid, of peptide terugvinding voor downstream-analyse. Deze kenmerken kunnen ook een invloed hebben op elkaar kan, en die voldoen aan alle eisen in één protocol moeilijk.
In dit werk introduceren wij een nieuwe TL silver methode voor de detectie van de eiwitten in polyacrylamidegel kleuring. In deze methode gebruiken we een fluorogenic-sonde voor zilver-ionen, TPE-4TA (Figuur 1), te visualiseren de zilver-geïmpregneerd eiwitten11. TPE-4TA is ontworpen door de aggregatie-geïnduceerde emissie (AIE)-principe. Het is niet-emissieve wanneer opgelost in waterige oplossing, maar is zeer emissieve in aanwezigheid van een zilver-ionen. Door vervanging van de chromogenic ontwikkeling in traditionele zilveren vlekken met een fluorogenic ontwikkeling van de stap, kunt de fluorescerende zilveren methode de robuuste kleuring van totale eiwitten met een beperkte achtergrond.
Bovendien bleek de fluorescerende zilveren vlek een goede dynamisch lineaire bereik voor eiwit kwantificering, die vergelijkbaar is met de veel gebruikte SYPRO Ruby vlek niet haalbaar is met traditionele zilveren vlekken en. De gel kan worden beeld op documentatiesystemen gebruikte gel met een UV-lamp (excitatie golflengte: 302/365 nm kanaal; emissie: ~ 490-530 nm) bij vele biologische labs.

<table><tbody><tr><td> LDS Sample Buffer (4X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0007</td><td>Reagens</td></tr><tr><td> 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td>Voorgevormd gel</td></tr><tr><td>Sample Reducing Agent (10X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0004</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>MES SDS Running Buffer (20X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0002</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Mini Gel Tank</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25977</td><td>Apparatuur</td></tr><tr><td>300W Power Supply (230 VAC)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PS0301</td><td>Apparatuur</td></tr><tr><td>Unstained Protein Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26614</td><td>Staal</td></tr><tr><td>Silver nitrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31630-25G-R</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Bragg and co.</td><td>42520J</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>J.T. Baker</td><td>103201A</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Milli-Q Synthesis A10</td><td>Merk</td><td>-</td><td>Leverancier van 18,2 M&Omega;.cm water</td></tr><tr><td>gel documentation system (c600 model)</td><td>Azure biosystems</td><td>-</td><td>Apparatuur</td></tr></tbody></table>

fluorescerende zilveren kleuring van eiwitten in polyacrylamide gels

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Zilveren kleuring is een colorimetrische techniek op grote schaal gebruikt om te visualiseren van eiwitten bands in polyacrylamide gels na natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-pagina). De klassieke zilveren vlekken hebben bepaalde nadelen, zoals hoge achtergrond kleuring, slechte eiwit recovery, lage reproduceerbaarheid, een smalle lineaire dynamische bereik voor kwantificering en beperkte compatibiliteit met massaspectrometrie (MS). Nu, met het gebruik van een fluorogenic Ag+ sonde, TPE-4TA, ontwikkelde we een fluorescerende silver kleuring van de methode voor de totale eiwit visualisatie in polyacrylamide gels. Deze nieuwe vlek vermijdt de lastige zilveren vermindering stap in traditionele zilveren vlekken. Bovendien toont de fluorescerende zilveren vlek aan lineaire kwantificering detectie van eiwit, waardoor het een nuttige en praktische eiwit gel vlek, goede reproduceerbaarheid en gevoeligheid.

De eiwit bands gekleurd door de fluorescerende zilveren vlek vertonen een intens groene fluorescentie onder een 365 nm UV lamp. Alle 14 eiwit bands (10-200 kDa), waren van boven naar beneden, duidelijk zichtbaar, correleren goed met degene rood-gekleurde 14 gekleurd door de SYPRO Ruby kleurstof (Figuur 2)10.
Met betrekking tot de kwantitatieve eiwit de detectie, de gels zijn ...

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol waarin een nieuwe TL kleuring techniek voor de detectie van de totale proteïne in polyacrylamide gels. Het protocol maakt gebruik van een zilveren ion-specifieke fluorescentie turn-on sonde, die Ag+detecteert-eiwitcomplexen, en elimineert bepaalde beperkingen van traditionele chromogenic zilveren vlekken.

Fluorescerende zilveren kleuring van eiwitten in Polyacrylamide Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Dit is een nieuwe gel-kleuring methode die gebruik maakt van een fluorogenic zilveren sonde om de traditionele zilveren kleuring om te zetten in een fluorescerende zilveren kleuring. Deze methode toonde verbeterde prestaties in vergelijking met conventionele zilvernitraat vlekken en SYPRO Ruby vlekken tijdens het gebruik van een eenvoudig en eenvoudig protocol zonder aldehyden. Het aantonen van de procedure zal Alex Wong zijn, een onderzoeksassistent van mijn laboratorium.Om met deze procedure te beginnen, verdun de eiwitmonsters met een oplossing die gedestilleerd water, LDS-buffer en een monsterreducerend middel bevat. Stel een mini gel tank gevuld met MES buffer om SDS-PAGINA uit te voeren met een 4-12%Bis-Tris eiwitgel. Laad de putten met het bereide eiwitmonster en voer de gel vervolgens gedurende 30 minuten op een constante spanning van 200 volt uit.Na elektroforese dompelt u de gel onder in een 100-milliliteroplossing die ethanol en azijnzuur op een orbitale shaker bevat en twee maal gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur wordt geïnceerd terwijl u bij 50 rpm schudt. Was vervolgens de gel drie keer met ultrazuiver water in een schone container met elke wasbeurt van 10 minuten. Los eerst 0,01 gram zilvernitraat op in 10 milliliter ultrazuiver water om een voorraadoplossing voor te bereiden met een concentratie van 0,1%Voeg 100 microliter van de voorraadoplossing toe aan 100 milliliter ultrazuiver water om de zilvernitraatwerkoplossing te maken.In een rookkap dompelt u de gel onder in 100 milliliter van de zilvernitraatwerkoplossing in een verzegelde glazen kamer. Gebruik aluminiumfolie om de gel te beschermen tegen licht tijdens impregneren en een uur lang in te broeden terwijl je bij 50 rpm schudt op een orbitale shaker. Daarna was je de gel twee keer met ultrazuiver water in een schone container, waarbij elke wasbeurt ongeveer 100 milliliter water gebruikt en 60 seconden duurt.Het is belangrijk om ultrazuiver water te gebruiken om de gel schoon te maken na de zilveren impregnatie stap om achtergrond vlekken te minimaliseren. Voeg eerst 50 milliliter ultrazuiver water toe aan drie milligram TPE-4TA-kleurstof. Sonicate de oplossing voor drie minuten en voeg vijf microliters van een-molaire natriumhydroxide oplossing tussen elke sonicatie sessie om te helpen oplossen van de kleurstof, meestal tot drie keer.Controleer vervolgens de fluorescentie van de oplossing onder een 365-nanometer UV-lamp om ervoor te zorgen dat de kleurstof volledig is opgelost. Alleen zwakke of niet-emissive oplossingen wijzen op volledige ontbinding. Om de fluorogene ontwikkelingsoplossing voor te bereiden, voegt u 10 milliliter van de TPE-4TA-voorraadoplossing toe aan 90 milliliter ultrazuiver water.Gebruik een pH-meter om de pH van de oplossing te controleren. Stem de oplossing af op een pH tussen 7 en 9, met behulp van verdunde natriumhydroxideoplossing of azijnzuur als de pH buiten bereik is. Breng de gel vervolgens over naar een schone en afsluitbare container met 100 milliliter fluorogeen ontwikkelingsoplossing en zorg ervoor dat de gel volledig wordt ondergedompeld.Verzegel de container en bedek deze om deze tegen licht te beschermen. Schud de container 's nachts op een orbitale shaker bij 50 tpm en bij kamertemperatuur. Breng de gel naar een schone container en houd deze gedurende 30 minuten vast in 100 milliliter ethanol.Spoel de gel vervolgens vijf minuten in ultrazuiver water. De gel kan worden gevisualiseerd op een benchtop transilluminator of afgebeeld op een gel documentatie machine op de 365-nanometer kanaal of de 302-nanometer kanaal. In deze studie wordt een nieuwe fluorescerende zilverkleuringsmethode gebruikt om eiwitten in polyacrylamidegels te bevlekken.De eiwitbanden gekleurd door de fluorescerende zilvervlek vertonen een intens groen onder een 365-nanometer UV-lamp. Alle 14 eiwitbanden zijn duidelijk zichtbaar en correleren goed met de roodgekleurde banden gekleurd door de SYPRO Ruby kleurstof. Deze fluorescerende zilver kleuring methode lijkt te hebben een hoge resolutie.Voor sommige eiwitbanden is de gevoeligheid van de fluorescerende zilvervlek ook iets beter dan die van de fluorescerende SYPRO Ruby vlek. Met name de prestaties van deze vlek worden verbeterd voor de eiwitbanden tussen 10 en 40 kilodaltons, wat aangeeft dat de nieuwe methode bijzonder nuttig is voor de detectie van eiwitten met een laag moleculair gewicht. Zoals kan worden gezien, de gegevens suggereert ook dat de fluorescerende zilver vlek geeft een goede en uniforme lineariteit voor alle 14 eiwitten over een relatief breed scala van eiwit kwantificering.Terwijl de zilvernitraat vlek gaf een hoog niveau van achtergrond signaal en vervormde pieken, de fluorescerende zilver vlek gedetecteerd de banden met een goed contrast en uniforme intensiteit distributie vergelijkbaar met de SYPRO Ruby vlek over alle 14 eiwitten. Wasstappen zijn belangrijk omdat ze de restfixatieoplossing beperken tegen het verstoren van zilverimpregnatie of fluorogene ontwikkeling. Vermijd bij het gebruik van zilvernitraat huidcontact.Maak eventuele morsen onmiddellijk schoon. Draag beschermende kleding en handschoenen en gooi als chemisch afval.

fluorescent-silver-staining-of-proteins-in-polyacrylamide-gels

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Na de scheiding door elektroforetische methoden, kunnen eiwitten in een gel worden gedetecteerd door verschillende kleuren methoden. Kleuring van eiwitten met Coomassie Blauw, Zilver kleuring, SYPRO Orange, SYPRO Ruby worden gedemonstreerd in deze video.

Kleuring Eiwitten in Gels

Een eenvoudige en specifieke methode werd aangetoond voor tl-etikettering en de verbeterde detectie van cel-oppervlakte-eiwitten zonder fractionering stap. Differentiële overvloed in cel oppervlakte-eiwitten werd geanalyseerd met behulp van twee-dimensionale (2-D) elektroforese en Ettan ™ DIGE technologie.

Selectieve Etikettering van Cell-oppervlakte-eiwitten met behulp van CyDye DIGE Fluor Minimal Kleurstoffen

Een kort protocol voor eiwitkleuring met Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels wordt beschreven zonder gebruik te maken van organische oplosmiddelen of azijnzuur als in de klassieke kleuren procedures met CBB.

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

Deze video zal populariseren een colloïdale Coomassie G-250 kleuringsprotocol volgens...

Snelle en gevoelige colloïdaal Coomassie G-250 Kleuring voor Eiwitten in polyacrylamidegels

In this video, we demonstrate a silver staining method of polyacrylamide gels for the visualization of total protein by using fluorogenic probes.

Fluorescent Silver Staining: A Technique to Visualize Total Protein in Polyacrylamide Gels

In this video, we demonstrate a procedure for combined Alcian blue and silver staining of sulfated glycosaminoglycan oligosaccharide fragments. This combined staining technique significantly amplifies the bands of glycosaminoglycan polymers of different lengths in polyacrylamide gels.

Silver Staining of Sulfated Glycosaminoglycans: A Staining Method for Visualization of Sulfated Glycosaminoglycans in Polyacrylamide Gels

This video demonstrates a denaturing polyacrylamide-based separation technique for proteins. This technique helps in the preliminary identification of proteins based on their molecular weights.

Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis for Protein Analysis: A Technique to Separate and Visualize Proteins Based on Molecular Weight

In this video, we demonstrate a two-dimensional gel electrophoresis method that separates individual proteins from a complex protein mixture obtained from tumor tissues of human nonfunctional pituitary adenoma (NFPA). The proteins are separated based on their electric charge in the first dimension and further separated based on molecular weights in the second dimension.

Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis: A Separation Technique for Analysis of Proteins in Complex Protein Mixture Based on Charge and Molecular Weight

Wij rapporteren hier een eenvoudige en goedkope silver kleuring protocol dat vereist slechts drie reagentia en 7 min van verwerking, en is geschikt voor snelle generatie voor kwalitatief hoogwaardige SSR data in de genetische analyse.

Een snel zilver kleuring Protocol inschakelen eenvoudig en efficiënte detectie van SSR markeringen met behulp van een niet-denaturering Polyacrylamide-Gel

Hier presenteren we een gevoelige, snelle en discriminerende post-gel kleuring methode om image-ASE Tagged met RNA mango aptameren I, II, III, of IV, met behulp van een native of denaturerende Polyacrylamide gel elektroforese (pagina) gels. Na het runnen van standaard pagina gels, mango-gecodeerde RNA kan gemakkelijk worden gekleurd met TOT1-Biotine en vervolgens geanalyseerd met behulp van de meest beschikbare fluorescentie lezers.

Fluorescerende visualisatie van mango-Tagged RNA in Polyacrylamide gels via een Poststaining methode

Dit rapport beschrijft technieken om gesulfateerde glycosaminoglycanen (GAG's) uit biologische monsters te isoleren en te zuiveren en een polyacrylamidegel-elektroforesebenadering om hun grootte te benaderen. GAG's dragen bij aan de weefselstructuur en beïnvloeden signaleringsprocessen via elektrostatische interactie met eiwitten. GAG-polymeerlengte draagt bij aan hun bindingsaffiniteit voor verwante liganden.

Detectie van glycosaminoglycanen door polyacrylamide gel-elektroforese en zilverkleuring

Leer een nieuwe fluorescerende zilverkleuring voor eiwitten in polyacrylamidegels met een fluorogene zilverprobe. Deze methode biedt hogere gevoeligheid en eenvoudiger protocol dan traditionele zilvernitraatkleuring.

Fluorescerende zilveren kleuring van eiwitten in Polyacrylamide Gels

Meer video's verkennen