Nieuwe proces voor afdrukken in 3D Decellularized Matrices
7 januari 2019
Dit protocol beschrijft de productie van polycaprolactone (PCL) gloeidraad met ingesloten polylactic acid (PLA) microsferen waarin decellularized matrices (DM) voor afdrukken in 3D van structurele weefsel engineering constructies.
Deze methode maakt het mogelijk om zowel structurele kunststoffen als biologische componenten voor weefselgemande steigers te co-printen. Deze steigers kunnen de inheemse weefselomgeving nauwkeuriger repliceren, wat gunstig kan zijn voor gekweekte cellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mechanisch geluidsstructuren kan afdrukken zonder het biologische materiaal dat in de steigers is ingekapseld te beschadigen in een alles-in-één techniek voor weefseltechniek.
Produceer microsferen met de gewenste matrix ingekapseld. Deze microsferen werden gemaakt met gedecellulariseerd kraakbeen uit varkensachterpoten. Ze variëren in grootte.
Werk met een zeefmachine om microsferen van geüniformeerde grootte te verkrijgen. Zorg ervoor dat de drie zeefbakken voor gebruik grondig zijn gereinigd en gedroogd. Monteer de zeefshaker met de grotere mesh tray erop en de kleinere mesh tray in het midden.
Leg de zeefpan op de bodem. Plaats droge microsferen in de bovenste lade. Plaats vervolgens het deksel op de lade.
Grof zeef gedurende acht tot tien minuten. Dan fijne zeef voor acht tot tien minuten. Tijdens het wachten, schik wegen papier voor de gezeefde bollen.
Wanneer het zeven is voltooid, verwijder voorzichtig een zeeflade. Plaats de lade ondersteboven op het weegpapier. Tik voorzichtig op de zijkanten om ervoor te zorgen dat de meeste bollen eruit vallen.
Met alle zeefplaten geleegd op weegpapier, gooi de oversized en ondermaatse bollen. De resterende bollen hebben de juiste grootte voor gebruik in volgende stappen. Plaats deze bollen in een gelabelde centrifugebuis.
Bewaar de buis in een 20 graden Celsius vriezer tot het nodig is. Weeg het materiaal dat nodig is om het filamentmateriaal te maken. Maak een gewichtsverhouding van één tot vier van microsferen tot polycaprolactonepoeder met ten minste 25 gram microsferen.
Breng het poedermengsel over op een miniatuur rolmixer. Meng het poeder op 20 rotaties per minuut gedurende vijf minuten. Na vijf minuten, stop de rotatie en draai de container.
Meng vervolgens bij 20 rpm voor een extra vijf minuten. Om verder te gaan, neem het mengsel naar een extruder en spooler setup. Stel de extruder zo in dat de uitlaat ongeveer 60 centimeter verwijderd is van de inlaat van een spoeler.
Zorg er dan voor dat er geen isolerende jas is. Plaats een desktop ventilator ongeveer halverwege tussen de extruder en spooler om het extrudaat te koelen. Zet een andere ventilator in de buurt van de verwarming jas om het te koelen met omgevingslucht.
Zorg er vervolgens voor dat het juiste mondstuk aan de extruder wordt bevestigd en stel de temperatuur van het verwarmingselement in. Start de koelventilatoren en laat het instrument een stabiele toestand bereiken. Na 20 tot 30 minuten, krijgen de microsfeer PCL mengsel en vul de extruder hopper.
Zet de spooler en de extruder vijzel aan om filamentextrusie te starten. Gebruik tangen en trek handmatig aan de initiële geëxtrudeerde gloeidraad. Voer de gloeidraad aan de filamentspoeler.
Terwijl het wordt geëxtrudeerd, observeer de gloeidraad om de samenstelling ervan te identificeren. Na enige tijd zal de gloeidraadsamenstelling uniform lijken, wat gewenst is. Wikkel tape rond de gloeidraad om het begin van het uniforme gebied te markeren.
Buiten de spooler rollen, monitor de diameter van de gloeidraad. Gebruik remklauwen om te testen of de diameter dicht bij de gewenste 1,75 mm ligt. Pas de spooler en extruder snelheden en temperaturen indien nodig aan.
Om de diameter van de gloeidraad aan te passen, wijzigt u eerst de spooler- en extrudersnelheden. U ook de extrudertemperatuur wijzigen, hoewel dit meestal niet nodig is. Blijf de hopper bijvullen en extruderen totdat al het poeder wordt gebruikt.
Wanneer de hopper bijna leeg is, voeg pcl-poeder toe aan de hopper om het microsfeermengsel weg te spoelen. Controleer het extrudaat terwijl u het PCL-poeder toevoegt. In eerste instantie zullen microsferen nog steeds zichtbaar zijn in het extrudaat.
Uiteindelijk wanneer er geen microsferen meer zichtbaar zijn, stop met het toevoegen van de PCL. Scheid en label de gloeidraad met microsferen in de gewenste concentratie. Wanneer er minimaal poeder in de hopper zit, stop dan met extruderen en zet de apparatuur uit.
De gloeidraad kan worden gebruikt in een standaard gesmolten depositie modellering printer. Laad de gloeidraad in de printer die is uitgerust met sproeiers van de gewenste diameter. Met het geladen model stelt u de temperatuur en lineaire snelheid voor het afdrukken in en begint u met het deponeren van de gloeidraad.
De aangepaste gloeidraad wordt laag voor laag afgezet. Besteed speciale aandacht aan de eerste laag en pas de instellingen aan als dat nodig is. Deze twee 3D-geprinte steigers zijn moeilijk te onderscheiden op deze schaal.
Men heeft filament met polycapralactone, PCL alleen. De andere heeft PCL filament met ingebedde microsferen van polymelkzuur en gedecelluariseerde matrices. Bekeken met behulp van scanning elektronenmicroscopie, de PCL-only steiger lijkt meestal glad.
Voor de andere gloeidraad daarentegen zijn microsferen die in de PCL zijn ingebed in het hele monster zichtbaar. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat over of ondermaatse microsferen de stroomdynamiek van het materiaal in de extruder kunnen beïnvloeden. Om deze reden, zorg ervoor dat uw microsferen goed voor te bereiden voorafgaand aan het gebruik.
Om afval te minimaliseren, is het raadzaam om één grote batch filament te maken die nodig is voor alle experimenten in plaats van vaker kleinere batches te maken. Expertise in filament productie zal komen na verloop van tijd. Steigers geproduceerd volgens deze procedure kunnen verder worden beoordeeld in vitro en in vivo om aanvullende vragen over verbeterde inductie en mechanische sterkte in vergelijking met andere bio-bedrukte steigers te beantwoorden.
Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van weefseltechniek om contragene inductie van gedecelluariseerde varkensmatrix binnen de 3D-steigers te onderzoeken. Vergeet niet dat het werken met kleine deeltjes ademhalingsrisico's kan opleveren. Het dragen van een klein roetmasker tijdens deze procedure wordt aangemoedigd.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het co-printen van structurele synthetische en biologische componenten om tissue-engineered scaffolds te creëren. Deze scaffolds kunnen de natuurlijke weefselomgeving nauwkeuriger repliceren, wat gunstig is voor gecultiveerde cellen.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Weefseltechnologie
- 3D-printen
- Biomaterialen
Achtergrond
- Gedecellulariseerde matrices (DM) worden gebruikt om de functionaliteit van scaffolds te verbeteren.
- Polycaprolacton (PCL) en polymelkzuur (PLA) zijn belangrijke materialen bij de productie van scaffolds.
- Microsferen kunnen biologische materialen inkapselen zonder deze te beschadigen.
- Deze techniek maakt de integratie van mechanische en biologische eigenschappen in scaffolds mogelijk.
Doel van de studie
- Om mechanisch stabiele tissue-engineered scaffolds te produceren.
- Om gedecellulariseerde matrices in microsferen te inkapselen voor een verbeterde celkweek.
- Om een methode te ontwikkelen die structurele en biologische componenten combineert in één printproces.
Gebruikte methoden
- Productie van PCL-filament met ingebedde PLA-microsferen.
- Gebruik van gedecellulariseerd kraakbeen uit varkensachterpoten.
- 3D-printtechnieken voor de fabricage van scaffolds.
- Karakterisering van de grootte en eigenschappen van de microsferen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvol scaffolds gecreëerd die de structurele integriteit behouden.
- Aangetoond dat biologische materialen effectief ingekapseld kunnen worden.
- Verbeterde celkweekcondities binnen de scaffolds aangetoond.
- De methode voor het produceren van complexe tissue-engineered constructen gevalideerd.
Conclusies
- Deze methode vergroot het potentieel voor het creëren van functionele weefselsteigers.
- Co-printtechnieken kunnen de kloof overbruggen tussen synthetische en biologische materialen.
- Toekomstige toepassingen kunnen regeneratieve geneeskunde en weefselherstel omvatten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
De integratie van gedecellulariseerde matrices binnen 3D-geprinte scaffolds maakt de creatie mogelijk van weefseltechnologische constructen die mechanische integriteit combineren met biologische functionaliteit. Deze aanpak pakt een kritieke uitdaging in vroege ontdekking en preklinisch onderzoek aan door bioactiviteit tijdens de fabricage te behouden, wat bijdraagt aan de voorspellende betrouwbaarheid van weefselmodellering. Deze methode positioneert bioprinting als een platform voor de ontwikkeling van ziekterelevante systemen en de bevordering van translationeel biomateriaalonderzoek.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt het onderzoeken van cel-matrixinteracties in een gecontroleerde 3D-omgeving mogelijk.
- Ondersteunt functionele validatie van biomateriaalprikkels voor het gedrag van progenitorcellen.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door de activiteit van biologische agentia tijdens de fabricage van het scaffold te behouden.
- VerbetertHet voorspellend vertrouwen in hypothesen over tissue engineering.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt gestandaardiseerde, reproduceerbare 3D-scaffolds voor daaropvolgende celgebaseerde assays.
- Maakt kwantitatieve vergelijking van oppervlaktekenmerken van de scaffold en celresponsen mogelijk.
- Ondersteunt de schaalbaarheid van assays en het hergebruik van het platform voor screening van verbindingen of biomaterialen.
- Bereidt gevalideerde biologische systemen voor voor een betrouwbare evaluatie van regeneratieve signalen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt de samenstelling van het steunmateriaal af op weefselomgevingen die relevant zijn voor de ziekte voor translationele studies.
- Maakt continuïteit mogelijk van de ontdekking tot de preklinische validatie van strategieën voor weefselherstel.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere voortgang door de biologische functie in constructen te behouden.
- Faciliteert in vitro en in vivo beoordeling van de prestaties van het steunmateriaal.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode slaat een brug tussen vroege ontdekking, assay-ontwikkeling en preklinisch onderzoek door de fabricage van biologisch actieve, mechanisch robuuste 3D-scaffolds mogelijk te maken.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothese-testen over cel-matrixinteracties en biologische risicoreductie.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve scaffold-outputs voor assay-gereidheid.
- Analytiek: Biedt meetbare oppervlaktekenmerken en samenstelling voor vergelijkende analyse.
- Translationeel onderzoek: Handhaaft functionele biomateriaal-signalen voor afstemming op preklinische modellen.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Vestigt een herbruikbare workflow voor diverse toepassingen binnen de weefseltechnologie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en de validatie van targets in tissue engineering.
- Operationele waarde: Standaardiseert de productie van scaffolds met reproduceerbare en schaalbare resultaten.
- Strategische waarde: Vermindert biologische risico's in een laat stadium en ondersteunt efficiënte go/no-go-beslissingen.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van programma's voor regeneratieve geneeskunde mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de verwerking van biomaterialen en instrumentatie voor 3D-printen.
- Vereist een analytische infrastructuur voor scaffold-karakterisering en kwaliteitscontrole.
- Maakt standaardisatie tussen teams van de bereiding van microsferen en extrusieparameters noodzakelijk.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende weefseltypen of biologische agentia.
- Correcte behandeling van particulaten en het opschalen van batches zijn essentieel voor reproduceerbaarheid en veiligheid.
