Name: Nieuwe proces voor afdrukken in 3D Decellularized Matrices (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Leer een 3D-printmethode voor weefselengineering waarbij synthetische en biologische componenten tegelijk worden geprint. Deze techniek gebruikt polycaprolactone met geëncapsuleerde decellulariseerde matrix voor verbeterde celcultuur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project werd gedeeltelijk gefinancierd door een subsidie van de pediatrische orthopedische maatschappij van Noord-Amerika (POSNA) en de National Institutes of Health verlenen NIBIB R21EB025378-01 (verkennend Bioengineering onderzoeksbeurs).

1. verkrijgen en voorbewerken microsferen
<ol><li>Microbolletjes van de producten met de gewenste matrix ingekapseld (PLA-DM)2. Opmerking: Het is noodzakelijk dat de microsferen van uniforme grootte zijn. Om deze reden is het van essentieel belang de microsferen vóór gebruik zeven. Hoewel matrix decellularization en inkapseling hebben al gedetailleerd in eerdere publicaties2, volgt een korte samenvatting van het proces.<ol>
<li>Ten eerste oogst kraakbeen stekkers van varkens hind ledematen. Decellularize van het kraakbeen in een reeks wasbeurten met 0,05% trypsine/0,5 mm tetrasodium ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA), Dulbecco gewijzigd van Eagle's medium (DMEM), en 1,5% Perazijnzuur zuur en 2,0% Triton X-100 voor 4 uur met gedestilleerd water wast vóór en na elke stap2.</li>
		<li>Afvoer van de decellularized matrix, bevriezen, lyophilize, slijpen en ontbinden in pepsine-oplossing. Meng de pepsine-oplossing met PLA die is ontbonden in dichloormethaan na ontbinding.</li>
		<li>Voeg het mengsel ontkleuring in een 3% polyvinyl alcohol in water oplossing. Centrifugeer het resulterende microsferen, spoelen, afvoer en lyophilize weer. Opmerking: Zie de eerder gepubliceerde protocol2voor alle bijzonderheden op het proces.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zeef de microsferen.<ol>
<li>Zorgen dat alle zeef platen grondig gereinigde en droge voorafgaand aan gebruik. Indien nodig, schone zeef met behulp van ultrasone reiniger om ervoor te zorgen dat alle gebieden worden verwijderd uit de zeef.</li>
		<li>Monteer de zeef shaker met de 106 µm zeef lade aan de bovenkant, de 53 µm lade na dat, en de zeef onderaan de pan.</li>
		<li>Droge microsferen plaats in het Dienblad van de bovenste zeef en plaats de deksel op de bovenste lade. Inschakelen grof conventioneel-het zeven voor 8 tot 10 min. herhalen op boete voor 8 à 10 min. Opmerking: De zeef tijden wellicht worden verhoogd of verlaagd afhankelijk van de partij.</li>
		<li>Verwijder de zeef platen één voor één voorzichtig en leg ze ondersteboven op een papier van de grote wegen. Tik op de zijkanten voorzichtig om ervoor te zorgen dat de meeste van de bollen zijn gedaald uit de zeef en op het papier.</li>
		<li>Negeren van de extra grote bollen (> 106 µm) en ondermaatse bollen (< 53 µm). Voeg bollen die zich in de groottewaaier van 53 tot en met 106 µm aan een gelabelde centrifugebuis met het type en de batch nummer dan plaats in een vriezer van-20 ° C tot verder gebruik.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. microsfeer kwaliteitscontrole evaluaties
Opmerking: Zie Figuur 1.
<ol><li>Uitvoeren van macroscopische/visuele beoordeling om te controleren of de microsferen uniforme en sferisch, met geen aggregaten aanwezig.</li>
	<li>Beoordelen de microsferen met behulp van een scanning electron opname (SEM).<ol>
<li>Hiervoor plaats microsferen op een SEM chuck en sputter jas met goud-palladium in argon sfeer met behulp van een sputter coater met een dikte van 4 nm.</li>
		<li>Observeren van oppervlaktekenmerken, morfologie en diameters van de microsferen met behulp van een 10 kV om spanning en een 10 mm afstand te versnellen om ervoor te zorgen dat de productie en zeven van de microsferen was succesvol.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. de gloeidraad creatie voor afdrukken in 3D
<ol><li>Meten en registreren van de massa van de microsferen verkregen uit stap 2 en 3; ten minste 25 g nodig is.</li>
	<li>Polycaprolactone (PCL) poeder toevoegen aan de microsferen voor een 1:4-gewichtsverhouding van microsferen aan PCL.</li>
	<li>Meng het mengsel van de poeder op een miniatuur rollende mixer bij 20 omwentelingen per minuut gedurende 5 min. dan flip de container en meng bij 20 omwentelingen per minuut gedurende een extra 5 minuten (Zie Figuur 2).</li>
	<li>Vele verkrijgbare extruders (Zie de Tabel van materialen) hebben isolerende jassen omdat hun beoogde werking temperaturen voor traditionele fused deposition modeling (FDM) filamenten zijn. Wijzigen van de extruder (indien nodig) door het verwijderen van het isolatiemateriaal en gebruik het in combinatie met bureauventilatoren (die blazen de lucht op de extruder en geëxtrudeerde gloeidraad) tot het gebruik van de extruder bij lagere temperaturen. Opmerking: Bureauventilatoren die de lucht blazen voor het koelen van de extruder en de gloeidraad zijn handig voor deze procedure.</li>
	<li>Setup de installatie van de apparatuur voor extrusie. Zie Figuur 3.<ol>
<li>Setup de extruder zodat de uitlaat ~ 60 cm vanaf de inlaat naar de spooler, met een directe pad van de extrusie uitlaat naar de inlaat van de spooler is. Opmerking: De spooler kan eventueel worden verhoogd 3-4 duim van de Bank als wordt geconstateerd dat de gloeidraad is hangend aan het punt van het aanraken van de benchtop.</li>
		<li>Plaats een bureaublad fan ~ 15 cm vanaf de verwarming jas en het richten van de jas van de verwarming te bieden koeling met de buitenlucht in de gehele productie van de gloeidraad. Plaats een tweede koelventilator ongeveer halverwege tussen de extruder en de spooler en het richten van de extrudate om te helpen in de koeling van de gloeidraad met de buitenlucht.</li>
		<li>Pas de positionering zo nodig gedurende het hele proces.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Instellen van de gemodificeerde extruder verwarmingselement tot 52 ° C, zet op het bureaublad koelventilatoren, en laat het instrument om te komen tot evenwicht voor 20 tot 30 min., zorg ervoor dat de juiste mondstuk aan de extruder is gekoppeld.</li>
	<li>Net voordat u begint, door de extruder hopper te vullen met het mengsel van de microsfeer/PCL uit stap 3.3. Inschakelen van de spooler en de extruder auger, tot inleiding van de extrusie van de gloeidraad.</li>
	<li>Wanneer de eerste gloeidraad warm geperst is, handmatig Trek de extrudate uit het stopcontact extrusie met een tang en voeden het naar de spooler van de gloeidraad.</li>
	<li>De gewenste gloeidraad duurt enige tijd te komen uit de spooler. Met behulp van afzonderlijke spoelen of tape, duidelijk markeren wanneer de samenstelling van de gloeidraad wordt visueel weergegeven uniform.</li>
	<li>Het proces volgen en parameters te wijzigen als dit nodig is. Aanpassen van de extruder temperatuur, de extrusie auger snelheid, en de snelheid van de spooler te verkrijgen van een gloeidraad van 1,75 mm diameter, zoals gemeten door de remklauwen. Pas de fans zo nodig om af te koelen van de gloeidraad correct om te voorkomen dat niet-cirkelvormige gloeidraad dwarsdoorsneden. Meng en vullen van de trechter als dit nodig is. Opmerking: Aandacht vereist is tijdens dit proces te verkrijgen van voldoende gloeidraad voor latere 3D printen. De bovenstaande parameters verandert afhankelijk van de omgevingsomstandigheden, de vulhoogte en de uniformiteit van het mengsel in de hopper en de thermodynamica en stroom dynamiek van de specifieke batches van PCL en microsferen.</li>
	<li>Blijven diepte tot al het poeder is gebruikt en de hopper bijna leeg is. PCL-poeder (zonder microbolletjes) toevoegen aan de bak te spoelen van de microsfeer mengsel dat momenteel in de extruder. Blijven PCL-poeder toe te voegen aan de hopper, zolang geen meer microsferen niet zichtbaar in de extrudate zijn.</li>
	<li>Zorg om te etiketteren en aparte de gloeidraad waarin de microsferen in de gewenste concentratie, als nadat de gloeidraad wordt gekoeld het is moeilijker om te onderscheiden van de uniforme gloeidraad van niet-uniforme gloeidraad.</li>
	<li>Blijven diepte totdat er minimale poeder links in de hopper is en uitschakelen van de spooler, extruder auger extruder verwarmingselement en fans.</li>
</ol>4. printen met de gloeidraad
<ol><li>Ontwerp een geometrie van de gewenste vorm en vorm met behulp van een computer aided ontwerpsoftware. Vervolgens snijd van het model en dicteren de toolpath met behulp van segmenteringshulplijnen software die compatibel is met de 3D drukmachine wordt gebruikt.</li>
	<li>Laden van de gloeidraad vanaf stap 3 op elke standaard FDM printer, uitgerust met standaard sproeiers van de gewenste diameter (doorgaans 0,4 mm). Beginnen de lettertjes (doorgaans op 65-70 ° C en 300 mm/min lineaire snelheid) zoals de aangepaste gloeidraad gedeponeerd laag-voor-laag door de machine is.</li>
	<li>Zorg ervoor dat bijzondere aandacht besteden aan de eerste laag en pas instellingen zoals die nodig zijn om een goede kwaliteit print. Opmerking: Aanpassingen kunnen worden aangebracht in de afdruksnelheid, print temperatuur platform temperatuur, extrusie vermenigvuldiger en andere parameters. Verwijzen naar de printer en de probleemoplossing van het snijden van de fabrikant voor verdere ondersteuning.</li>
</ol>5. kwaliteitscontrole beoordeling
<ol><li>Plaats de afgedrukte constructies op SEM Opspansystemen en sputter jas met goud-palladium in argon sfeer met behulp van een sputter coater met een dikte van 4 nm.</li>
	<li>Observeren onder de microscoop met behulp van een 10 kV versnellen van spanning en een 10 mm afstand te controleren van oppervlaktekenmerken en voor de aanwezigheid of afwezigheid van microsferen indien van toepassing.</li>
</ol>6. functionele testen van de afgedrukte constructies
Opmerking: Alkalisch fosfatase (ALP) kan worden gebruikt als een surrogaat voor decellularized matrix om te bepalen als encapsulated eiwitten biologisch actieve na het productieproces van de gloeidraad zijn. ALP wordt gebruikt omdat het een reactie van een substraat, p-nitrofenyl fosfaat, veranderen van kleurloos naar gele bijproducten, p-nitrofenol en anorganisch fosfaat, katalyseert, maar alleen als ALP in de functionele bevleesdheid.
<ol><li>Afdrukken van een geometrie (n = 3) die heeft een einde massa van ten minste 400 mg met de ALP microsfeer gloeidraad (PLA-ALP/PCL) met behulp van identieke print parameters als de PLA-DM/PCL-steigers. Ook afdrukken PCL-enige (PCL(-)) steigers van de dezelfde geometrie als de PLA-ALP/PCL-steigers. Dompelen hen in 1 mL Tris-HCl buffer en incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C en 110 rpm rotatie toe enzym diffusie.</li>
	<li>Voeg 1 mL 1 mg/mL p-nitrofenyl fosfaat, Dinatrium-hexahydraat in Tris-HCl. Incubate bij 37 ° C, 110 rpm voor een extra 10 h. Lees het supernatant absorptie bij 415 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Hutchmaker, D., Teoh, S., Zein, I., Ng, K. W., Schantz, J. -T., Leahy, J. C. <a target="_blank" href="https://www.astm.org/DIGITAL_LIBRARY/STP/PAGES/STP15307S.htm">Design and Fabrication of a 3D Scaffold for Tissue Engineering Bone.</a> Synthetic Bioabsorbable Polymers and Implants. 15 (2), 845-847 (1988).</li>
<li>Ghosh, P., Gruber, S. M. S., Lin, C. -Y., Whitlock, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29394158">Microspheres containing decellularized cartilage induce chondrogenesis and remain functional after incorporation within a poly(caprolactone) filament useful for fabricating a 3D scaffold.</a> Biofabrication. , (2018).</li>
<li>Partington, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+changes+caused+by+decellularization+may+compromise+mechanical+integrity+of+tracheal+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).</li>
<li>Hutmacher, D. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11071603">Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage.</a> Biomaterials. 21 (24), 2529-2543 (2000).</li>
<li>Kang, H., Hollister, S. J., La Marca, F., Park, P., Lin, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+biodegradable+lumbar+interbody+fusion+cage+design+and+fabrication+using+integrated+global-local+topology+optimization+with+laser+sintering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanical+engineering%22%5BJournal%5D)">Porous biodegradable lumbar interbody fusion cage design and fabrication using integrated global-local topology optimization with laser sintering.</a> Journal of biomechanical engineering. 135 (10), 101013-101018 (2013).</li>
<li>Kang, H., Lin, C. Y., Hollister, S. J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00158-010-0508-8">Topology optimization of three dimensional tissue engineering scaffold architectures for prescribed bulk modulus and diffusivity.</a> Structural and Multidisciplinary Optimization. 42 (4), 633-644 (2010).</li>
<li>Lin, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+bone+engineering+using+ex+vivo.+gene+therapy+and+topology-optimized%2C+biodegradable+polymer+composite+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Functional bone engineering using ex vivo. gene therapy and topology-optimized, biodegradable polymer composite scaffolds.</a> Tissue Engineering. 11 (9-10), 1589-1598 (2005).</li>
<li>Lin, C. -Y., Hsiao, C. -C., Chen, P. -Q., Hollister, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interbody+Fusion+Cage+Design+Using+Integrated+Global+Layout+and+Local+Microstructure+Topology+Optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Interbody Fusion Cage Design Using Integrated Global Layout and Local Microstructure Topology Optimization.</a> Spine. 29 (16), 1747-1754 (2004).</li>
<li>Zopf, D., Hollister, S., Nelson, M., Ohye, R., Green, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioresorbable+Airway+Splint+Created+with+a+Three-Dimensional+Printer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bioresorbable Airway Splint Created with a Three-Dimensional Printer.</a> New England Journal of Medicine. 368 (21), 2043-2045 (2013).</li>
<li>Pati, F., Song, T. H., Rijal, G., Jang, J., Kim, S. W., Cho, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ornamenting+3D+printed+scaffolds+with+cell-laid+extracellular+matrix+for+bone+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Ornamenting 3D printed scaffolds with cell-laid extracellular matrix for bone tissue regeneration.</a> Biomaterials. 37, 230-241 (2015).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+interface+microstructure+on+interfacial+shear+strength+for+osteochondral+scaffolds+based+on+biomimetic+design+and+3D+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering+C%22%5BJournal%5D)">The effect of interface microstructure on interfacial shear strength for osteochondral scaffolds based on biomimetic design and 3D printing.</a> Materials Science and Engineering C. 46, 10-15 (2015).</li>
<li>Williams, J. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15763261">tissue engineering using polycaprolactone scaffolds fabricated via. selective laser sintering.</a> Biomaterials. 26 (23), 4817-4827 (2005).</li>
<li>Monibi, F. A., Cook, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-Derived+Extracellular+Matrix+Bioscaffolds%3A+Emerging+Applications+in+Cartilage+and+Meniscus+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioscaffolds: Emerging Applications in Cartilage and Meniscus Repair.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2017).</li>
<li>Wiles, K., Fishman, J., Coppi, P., Birchall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Host+Immune+Response+to+Tissue-Engineered+Organs%3A+Current+Problems+and+Future+Directions%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Host Immune Response to Tissue-Engineered Organs: Current Problems and Future Directions.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 22 (3), (2016).</li>
<li>Sutherland, A. J., Detamore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+Microsphere-Based+Scaffolds+Containing+Decellularized+Cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Bioactive Microsphere-Based Scaffolds Containing Decellularized Cartilage.</a> Macromolecular Bioscience. , (2015).</li>
<li>Whitlock, P. W., Smith, T. L., Poehling, G. G., Shilt, J. S., Van Dyke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+naturally+derived%2C+cytocompatible%2C+and+architecturally+optimized+scaffold+for+tendon+and+ligament+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A naturally derived, cytocompatible, and architecturally optimized scaffold for tendon and ligament regeneration.</a> Biomaterials. , (2007).</li>
<li>Whitlock, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cyclic+strain+on+tensile+properties+of+a+naturally+derived%2C+decellularized+tendon+scaffold+seeded+with+allogeneic+tenocytes+and+associated+messenger+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+surgical+orthopaedic+advances%22%5BJournal%5D)">Effect of cyclic strain on tensile properties of a naturally derived, decellularized tendon scaffold seeded with allogeneic tenocytes and associated messenger RNA expression.</a> Journal of surgical orthopaedic advances. 22 (3), 224-232 (2013).</li>
<li>Whitlock, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+process+for+optimizing+musculoskeletal+allograft+tissue+to+improve+safety%2C+ultrastructural+properties%2C+and+cell+infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Joint+Surgery+-+Series+A%22%5BJournal%5D)">A novel process for optimizing musculoskeletal allograft tissue to improve safety, ultrastructural properties, and cell infiltration.</a> Journal of Bone and Joint Surgery - Series A. 94 (16), 1458-1467 (2012).</li>
<li>Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Herman, I. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21362080">Dynamic Reciprocity in the Wound Microenvironment.</a> Wound Repair Regeneration. 19 (2), 134-148 (2012).</li>
<li>Benders, K. E. M., van Weeren, P. R., Badylak, S. F., Saris, D. B. F., Dhert, W. J. A., Malda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+scaffolds+for+cartilage+and+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration.</a> Trends in Biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).</li>
<li>Crapo, P., Gilbert, T., Badylak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
<li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+kidneys+as+a+source+of+ECM+scaffold+for+kidney+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering+C%22%5BJournal%5D)">Porcine kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration.</a> Materials Science and Engineering C. 56, 451-456 (2015).</li>
<li>Dean, R. L. <a target="_blank" href="https://iubmb.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/bmb.2002.494030060138">Kinetic studies with alkaline phosphatase in the presence and absence of inhibitors and divalent cations.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (6), 401-407 (2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Beide matrices decellularized en 3D gedrukte PCL-steigers, onafhankelijk is gebleken dat hechting en proliferatie van cellen, het valideren van hun gebruik voor osteochondrale herstellen10,11,12. Het gebruik van decellularized matrix in engineering benaderingen voor weefselherstel een onderwerp geweest van veel belang en het succes in het recente verleden2,3,<...

Huidige weefsel engineering technieken voor klinische toepassingen zoals bot, kraakbeen, pezen en gewrichtsbanden wederopbouw auto- en allografts gebruiken voor het herstellen van beschadigd weefsel. Elk van deze technieken wordt uitgevoerd routinematig als een "gouden standaard" in de klinische praktijk door eerst het oogsten van de donorweefsel van de patiënt of een dode foetussen match, en dan het plaatsen van de donorweefsel in het defect site2. Deze strategieën zijn echter beperkt door de donor site morbiditeit, donor site schaarste voor grote gebreken, risico van infectie, en moeite met het vinden van protheses die overeenkomen met de gewenste geometrie. Bovendien, hebben studies aangetoond dat allografts gebruikt voor wederopbouw mechanische en biologische eigenschappen wanneer vergeleken met inheemse weefsel3hebben verminderd. Met deze overwegingen in het achterhoofd, hebben onlangs weefsel ingenieurs aan drie dimensionale (3D) bioprinting voor de productie van aangepaste, complexe geometrieën die biologisch actief zijn en ontworpen voor defect grootte en vorm terwijl het verstrekken van voldoende gedraaid mechanische eigenschappen tot biologische remodelleren voltooid is.
Ideaal, een 3D-gedrukte schavot zou bestaan uit een polymere backbone die de vereiste mechanische stabiliteit van inheemse weefsel behouden kan terwijl de opgenomen biologics biochemische signalen bieden naar de omringende cellen, wat leidt tot hun migratie, proliferatie, differentiatie en weefsel productie2,5. Helaas, meeste constructies die de biologische bestanddelen zijn gemaakt met gels of polymeren die te zwak zijn om te weerstaan in vivo krachten ervaren door de gerichte weefsels voor auto/allograft wederopbouw. Andere polymeren zoals polylactic acid (PLA) zijn bioresorbable, 3D afdrukbare en structureel klinken, maar bij temperaturen op of boven 210 ° C - maken het onmogelijk voor biologics mede gedrukte worden tijdens fabricage worden afgedrukt. Polycaprolactone (PCL) is een ander FDA-uitgeschakeld, bioresorbable polymeer dat afgedrukt op een lagere temperatuur (65 ° C), die wordt steeds populairder worden kan in het fabriceren van patiënt-specifieke implantaten met complexe morphologies5,6 3D ,7,8,9. Echter maken de meeste bioprinters met behulp van pneumatische technologie onmogelijk afdrukken PCL bij lagere temperaturen waar biologische activiteit ongedeerd blijven kunnen. Tot op heden heeft nog niet de integratie van deze polymeren met een auto/allografts in een roman afdrukbare biomaterial worden bereikt. Bij gebrek aan dergelijk materiaal is een benadering waar weefsel ontworpen weefsel wederopbouw onwaarschijnlijk. Wij hebben daarom wilde combineren van PLA, PCL, en decellularized allograft matrices (DM) gebruik maken van de voordelen van elk materiaal voor de vervaardiging van een levensvatbare construct staat op de wederopbouw van complexe weefsels. Dit proces zou zorgen voor de eerste mechanische stevigheid nodig zijn om in vivo krachten en de thermische stabiliteit voor additive manufacturing in een constructie die induceert de vorming van het gewenste weefsel te verzetten.
In een recente poging om het adres van de bovengenoemde horden, bleek we dat het haalbaar is om in te kapselen de extracellulaire matrix decellularized kraakbeen binnen een thermisch beschermende barrière van PLA, die kan worden geëxtrudeerd binnen PCL-filamenten, behoud van het vermogen van DM te beïnvloeden van omliggende host cellen2. Dit heeft inspireerde ons om klinisch effectieve benaderingen voor de wederopbouw van het weefsel. In de huidige studie, wij gebruiken het platformtechnologie om te bouwen van steigers van de all-in-one die PLA, DM en PCL (PLA-DM/PCL) bevatten.
Ons doel is het verbeteren van de doeltreffendheid en het nut van allografts nauwkeuriger recapituleren inheemse weefsel, uiteindelijk om ze te gebruiken in diverse toepassingen met de voorgestelde nieuwe biofabrication techniek.

<table><tbody><tr><td>Zefmachine</td><td>Haver &amp; Boecker Tyler</td><td>Ro-Tap RX 29-E Pure</td><td></td></tr><tr><td>Zeef 90 um</td><td>Fisherbrand</td><td>170328156</td><td>Nr. 170</td></tr><tr><td>Zeef 53 um</td><td>Fisherbrand</td><td>162513588</td><td>Nr. 270</td></tr><tr><td>Zeef 106 um</td><td>Fisherbrand</td><td>162018121</td><td>Nr. 140</td></tr><tr><td>Sputter coater</td><td>Leica</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Scanning Electron Microscope</td><td>Hitachi, USA</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Filabot EX2</td><td>Filabot.com</td><td>FB00061</td><td></td></tr><tr><td>Filabot Spooler</td><td>Filabot.com</td><td>FB00073</td><td></td></tr><tr><td>CAPA 6506</td><td>Perstorp</td><td>24980-41-4</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing, PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>6" Ventilator</td><td>Comfort Zone, Amazon</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasoon waterbad</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-08895-13</td><td></td></tr><tr><td>Dreamer</td><td>FlashForge</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Trommelmixer</td><td>Op maat gemaakt</td><td>n/a</td><td>Vergelijkbaar stuk apparatuur: https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&amp;persist=true&amp;ip= no&amp;gclid=CjwKCAjw- dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 dTjsraEsBGfhMEH7ytx LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ ixoC9GwQAvD_BwE</td></tr><tr><td>Microschaal</td><td>Mettler Toledo, Fisher Scientific</td><td>01-913-851</td><td></td></tr><tr><td>Simplify3D</td><td>Simplify3D</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>SolidWorks</td><td>SolidWorks</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Microsferen</td><td>Geproduceerd in eigen beheer, zie tegelijkertijd ingediende JoVE-aanvraag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p-nitrofenylfosfaat, dinatriumzout, hexahydraat</td><td>Millipore</td><td>4876-5GM</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatase, alkalisch</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>10 713 023 001</td><td></td></tr><tr><td>Absorptiemeter</td><td>Tecan</td><td>Sunrise</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl-buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6455-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Verwarmde schudder</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Excella E24</td><td></td></tr></tbody></table>

nieuwe proces voor afdrukken in 3d decellularized matrices

Novel Process for 3D Printing Decellularized Matrices

3D bioprinting beoogt te creëren van aangepaste steigers die biologisch actief zijn en geschikt voor de gewenste grootte en geometrie. Een kunststof ruggengraat kan zorgen voor mechanische stabiliteit vergelijkbaar met eigen weefsel terwijl biologische agenten compositorische signalen naar voorlopercellen bieden, leidt tot hun migratie, proliferatie en differentiatie te reconstrueren van het oorspronkelijke weefsel / organen1,2. Helaas, veel 3D compatibel is met afdrukken, bioresorbable polymeren (zoals polylactic acid, PLA) worden afgedrukt bij een temperatuur van 210 ° C of hoger - temperaturen die schadelijk zijn voor biologics. Aan de andere kant, is polycaprolactone (PCL), een ander type van polyester, een bioresorbable, een 3D-printbaar materiaal dat een zachter afdrukken temperatuur van 65 ° C. heeft Daarom was het veronderstelde dat decellularized extracellulaire matrix (DM) deel uitmaakt van een thermisch barrièrebescherming PLA binnen PCL gloeidraad kan worden afgedrukt en blijven in haar functionele bevleesdheid. In dit werk was osteochondrale reparatie de toepassing waarvoor de hypothese werd getest. Als zodanig was varkens kraakbeen decellularized en ingekapseld in polylactic acid (PLA) microsferen, die vervolgens werden geëxtrudeerd met polycaprolactone (PCL) in gloeidraad voor de productie van 3D constructies via fused deposition modeling. De constructies met of zonder de microsferen (PLA-DM/PCL- en PCL(-), respectievelijk) werden geëvalueerd voor verschillen in oppervlaktekenmerken.

Na zeven, moet de microsferen worden weergegeven uniform en vrij zijn van aggregaten. Onder SEM, de gezeefde microsferen wellicht kleine poriën op hun oppervlak, maar anders zal zijn bolvormig en glad, zoals afgebeeld in Figuur 1. Alle geëxtrudeerde filamenten moet uniform diameter en een cirkelvormige dwarsdoorsnede. Een gloeidraad waarin microbolletjes (PLA-DM/PCL) zal hebben een iets meer matte afwerking terwijl een PCL-alleen (PCL(-)) gloeidraad zou kijke...

Dit protocol beschrijft de productie van polycaprolactone (PCL) gloeidraad met ingesloten polylactic acid (PLA) microsferen waarin decellularized matrices (DM) voor afdrukken in 3D van structurele weefsel engineering constructies.

Nieuwe proces voor afdrukken in 3D Decellularized Matrices

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can ...

Deze methode maakt het mogelijk om zowel structurele kunststoffen als biologische componenten voor weefselgemande steigers te co-printen. Deze steigers kunnen de inheemse weefselomgeving nauwkeuriger repliceren, wat gunstig kan zijn voor gekweekte cellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mechanisch geluidsstructuren kan afdrukken zonder het biologische materiaal dat in de steigers is ingekapseld te beschadigen in een alles-in-één techniek voor weefseltechniek.Produceer microsferen met de gewenste matrix ingekapseld. Deze microsferen werden gemaakt met gedecellulariseerd kraakbeen uit varkensachterpoten. Ze variëren in grootte.Werk met een zeefmachine om microsferen van geüniformeerde grootte te verkrijgen. Zorg ervoor dat de drie zeefbakken voor gebruik grondig zijn gereinigd en gedroogd. Monteer de zeefshaker met de grotere mesh tray erop en de kleinere mesh tray in het midden.Leg de zeefpan op de bodem. Plaats droge microsferen in de bovenste lade. Plaats vervolgens het deksel op de lade.Grof zeef gedurende acht tot tien minuten. Dan fijne zeef voor acht tot tien minuten. Tijdens het wachten, schik wegen papier voor de gezeefde bollen.Wanneer het zeven is voltooid, verwijder voorzichtig een zeeflade. Plaats de lade ondersteboven op het weegpapier. Tik voorzichtig op de zijkanten om ervoor te zorgen dat de meeste bollen eruit vallen.Met alle zeefplaten geleegd op weegpapier, gooi de oversized en ondermaatse bollen. De resterende bollen hebben de juiste grootte voor gebruik in volgende stappen. Plaats deze bollen in een gelabelde centrifugebuis.Bewaar de buis in een 20 graden Celsius vriezer tot het nodig is. Weeg het materiaal dat nodig is om het filamentmateriaal te maken. Maak een gewichtsverhouding van één tot vier van microsferen tot polycaprolactonepoeder met ten minste 25 gram microsferen.Breng het poedermengsel over op een miniatuur rolmixer. Meng het poeder op 20 rotaties per minuut gedurende vijf minuten. Na vijf minuten, stop de rotatie en draai de container.Meng vervolgens bij 20 rpm voor een extra vijf minuten. Om verder te gaan, neem het mengsel naar een extruder en spooler setup. Stel de extruder zo in dat de uitlaat ongeveer 60 centimeter verwijderd is van de inlaat van een spoeler.Zorg er dan voor dat er geen isolerende jas is. Plaats een desktop ventilator ongeveer halverwege tussen de extruder en spooler om het extrudaat te koelen. Zet een andere ventilator in de buurt van de verwarming jas om het te koelen met omgevingslucht.Zorg er vervolgens voor dat het juiste mondstuk aan de extruder wordt bevestigd en stel de temperatuur van het verwarmingselement in. Start de koelventilatoren en laat het instrument een stabiele toestand bereiken. Na 20 tot 30 minuten, krijgen de microsfeer PCL mengsel en vul de extruder hopper.Zet de spooler en de extruder vijzel aan om filamentextrusie te starten. Gebruik tangen en trek handmatig aan de initiële geëxtrudeerde gloeidraad. Voer de gloeidraad aan de filamentspoeler.Terwijl het wordt geëxtrudeerd, observeer de gloeidraad om de samenstelling ervan te identificeren. Na enige tijd zal de gloeidraadsamenstelling uniform lijken, wat gewenst is. Wikkel tape rond de gloeidraad om het begin van het uniforme gebied te markeren.Buiten de spooler rollen, monitor de diameter van de gloeidraad. Gebruik remklauwen om te testen of de diameter dicht bij de gewenste 1,75 mm ligt. Pas de spooler en extruder snelheden en temperaturen indien nodig aan.Om de diameter van de gloeidraad aan te passen, wijzigt u eerst de spooler- en extrudersnelheden. U ook de extrudertemperatuur wijzigen, hoewel dit meestal niet nodig is. Blijf de hopper bijvullen en extruderen totdat al het poeder wordt gebruikt.Wanneer de hopper bijna leeg is, voeg pcl-poeder toe aan de hopper om het microsfeermengsel weg te spoelen. Controleer het extrudaat terwijl u het PCL-poeder toevoegt. In eerste instantie zullen microsferen nog steeds zichtbaar zijn in het extrudaat.Uiteindelijk wanneer er geen microsferen meer zichtbaar zijn, stop met het toevoegen van de PCL. Scheid en label de gloeidraad met microsferen in de gewenste concentratie. Wanneer er minimaal poeder in de hopper zit, stop dan met extruderen en zet de apparatuur uit.De gloeidraad kan worden gebruikt in een standaard gesmolten depositie modellering printer. Laad de gloeidraad in de printer die is uitgerust met sproeiers van de gewenste diameter. Met het geladen model stelt u de temperatuur en lineaire snelheid voor het afdrukken in en begint u met het deponeren van de gloeidraad.De aangepaste gloeidraad wordt laag voor laag afgezet. Besteed speciale aandacht aan de eerste laag en pas de instellingen aan als dat nodig is. Deze twee 3D-geprinte steigers zijn moeilijk te onderscheiden op deze schaal.Men heeft filament met polycapralactone, PCL alleen. De andere heeft PCL filament met ingebedde microsferen van polymelkzuur en gedecelluariseerde matrices. Bekeken met behulp van scanning elektronenmicroscopie, de PCL-only steiger lijkt meestal glad.Voor de andere gloeidraad daarentegen zijn microsferen die in de PCL zijn ingebed in het hele monster zichtbaar. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat over of ondermaatse microsferen de stroomdynamiek van het materiaal in de extruder kunnen beïnvloeden. Om deze reden, zorg ervoor dat uw microsferen goed voor te bereiden voorafgaand aan het gebruik.Om afval te minimaliseren, is het raadzaam om één grote batch filament te maken die nodig is voor alle experimenten in plaats van vaker kleinere batches te maken. Expertise in filament productie zal komen na verloop van tijd. Steigers geproduceerd volgens deze procedure kunnen verder worden beoordeeld in vitro en in vivo om aanvullende vragen over verbeterde inductie en mechanische sterkte in vergelijking met andere bio-bedrukte steigers te beantwoorden.Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van weefseltechniek om contragene inductie van gedecelluariseerde varkensmatrix binnen de 3D-steigers te onderzoeken. Vergeet niet dat het werken met kleine deeltjes ademhalingsrisico's kan opleveren. Het dragen van een klein roetmasker tijdens deze procedure wordt aangemoedigd.

novel-process-for-3d-printing-decellularized-matrices

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Het weefsel-specifieke extracellulaire matrix (ECM) is een sleutelmediator van celfunctie. Dit artikel beschrijft werkwijzen voor het synthetiseren van zuiver ECM afgeleide schuimen en microdragers die stabiel in cultuur zonder de noodzaak voor chemische verknoping voor toepassingen in geavanceerde 3D in vitro celkweekmodellen of pro-regeneratieve bioscaffolds.

Fabricage van extracellulaire matrix-afgeleide schuimen en microdragers Weefsel-specifieke Cell Cultuur en Delivery Platforms

Dit protocol beschrijft de complete decellularization van menselijke myocard met behoud van de componenten van de extracellulaire matrix. Verdere verwerking van de resultaten van de extracellulaire matrix in de productie van deeltjes en een cytoprotective zelfassemblerende hydrogel.

Verwerking van menselijke cardiale weefsels richting de extracellulaire Matrix zelf monteren Hydrogel voor In Vitro en In Vivo toepassingen

Decellularized kraakbeen afkomstige steigers kunnen worden gebruikt als een steiger aan gids kraakbeen reparatie en als een middel om te regenereren osteochondraal weefsel. Deze paper beschrijft het proces van de decellularization in detail en biedt suggesties voor deze steigers in in vitro-instellingen.

Fabricage van Decellularized kraakbeen afkomstige Matrix steigers

Het doel van dit protocol is productie van hele extracellulaire matrix vezels die voor reparatie van de wond wordt gericht die geschikt voor preklinische evaluatie als onderdeel van een regeneratieve steiger implantaat zijn. Deze vezels worden geproduceerd door de cultuur van fibroblasten op holle vezel membranen en geëxtraheerd door ontbinding van de membranen.

Productie van extracellulaire Matrix vezels via cultuur van de cel van de membraan van opofferende holle vezel

Decellularized extracellulaire matrix (dECM) kan geschikte micro-omgevings aanwijzingen bieden om de inherente functies van doelweefsels in een Engineered constructie te recapituleren. Dit artikel verheldeert de protocollen voor de decellularisatie van pancreas weefsel, evaluatie van decm bioink van de alvleesklier weefsel, en generatie van 3D-alvleesklier weefsel constructies met behulp van een bioprinten techniek.

Pancreatic weefsel-afgeleide extracellulaire matrix Bioink voor het afdrukken van 3D Cell-beladen alvleesklier weefsel constructies

Dit protocol benadrukt een methode om snel de biocompatibiliteit van een kristallijne nanocellulose (CNC) / agarose composiet hydrogel biomateriaal inkt met muis beenmerg-afgeleide mestcellen te beoordelen in termen van cel levensvatbaarheid en fenotypische expressie van de celoppervlak receptoren, Kit (CD117) en hoge affiniteit IgE receptor (FcεRI).

Fabricage van een kristallijne nanocellulose ingebedde agarose biomateriaal inkt voor beenmerg-afgeleide mestcelkweek

In dit werk werd een decellularisatieprotocol geoptimaliseerd om gedecellulariseerde matrices van foetale skeletspieren van muizen te verkrijgen. C2C12-myoblasten kunnen deze matrices koloniseren, prolifereren en differentiëren. Dit in vitro model kan worden gebruikt om celgedrag te bestuderen in de context van skeletspierziekten zoals spierdystrofieën.

Voorbereiding van 3D gedecellulariseerde matrices van foetale muis skeletspieren voor celkweek

Het protocol verduidelijkt twee verschillende decellularisatiemethodologieën die worden toegepast op inheemse longweefsels van runderen, en geeft een uitgebreid overzicht van hun respectieve karakteriseringen.

Ontwikkeling en karakterisering van gedecellulariseerde extracellulaire matrixhydrogels voor de longen

De gedecellulariseerde miltmatrix (DSM) bevat veelbelovende toepassingen op het gebied van leverweefselmanipulatie. Dit protocol schetst de procedure voor het bereiden van DSM bij ratten, waaronder het oogsten van milten van ratten, het decellulariseren ervan door middel van perfusie en het evalueren van de resulterende DSM om de kenmerken ervan te bevestigen.

Fabricage van gedecellulariseerde miltmatrix afgeleid van ratten

Dit protocol beschrijft de fabricage van 3D-botconstructies met behulp van menselijke osteocyten die zijn ingebed in methacrylgelatine (GelMA) hydrogels, aangevuld met gedecellulariseerde extracellulaire matrix. De methode is goedkoop, schaalbaar en compatibel met basislaboratoriumapparatuur, en biedt een translationeel platform voor het bestuderen van processen van musculoskeletale ziekten.

Een 3D-botkweekplatform met menselijke osteocyten en gedecellulariseerde extracellulaire matrix voor het modelleren van musculoskeletale aandoeningen

Leer een 3D-printmethode voor weefselengineering waarbij synthetische en biologische componenten tegelijk worden geprint. Deze techniek gebruikt polycaprolactone met geëncapsuleerde decellulariseerde matrix voor verbeterde celcultuur.

Nieuwe proces voor afdrukken in 3D Decellularized Matrices

Meer video's verkennen