In Vivo Gerichte expressie van Optogenetic eiwitten met behulp van Silk/AAV Films

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van systeemneurowetenschappen. Zoals hoe de activiteit van neuronale ensembles sensorische en cognitieve verwerking in de hersenen ondersteunt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het vergemakkelijkt de nauwkeurige targeting van optogenetische eiwitten zoals Chan rhodopsin en GCaMP naar hersengebieden van belang, zonder dat een aparte virus injectie procedure.

Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang, omdat de afzetting van zijde en virus aan kleine optische implantaten enige oefening kan vertwijden om reproduceerbare resultaten te bereiken. Meng eerst ontdooide AAV en vijf tot zeven punt vijf procent waterige zijdefibroin in een één-op-één verhouding in een 200 microliter PCR-buis. Voorzichtig pipette de oplossing in en uit meerdere malen om grondig mengen van de AAV en fibroine.

Om de zijde / AAV te deponeren, laad een injectie pipet met de hoeveelheid oplossing die nodig is voor het aantal vezel implantaten worden gemaakt, plus ongeveer 30 procent extra om verliezen als gevolg van pipet verstopping tegemoet te komen. Monteer vervolgens een ferrulehouder in een stereotaxic-apparaat dat is uitgerust met een microinjector. Plaats de ferrulehouder boven de microinjector en breng het zijde/AAV mengsel van onderen aan.

Manoeuvreer de injectiepipet totdat het raakt of bijna het raken van het centrum van de optische vezel oppervlak, en uitwerpen 10 tot 20 nanoliter van zijde / AAV oplossing. Trek vervolgens de pipet terug. Bekijk vervolgens de bolus van zijde/AAV op het vlakke oppervlak dat verschijnt als een vloeibare koepel die binnen ongeveer een minuut opdroogt tot een platte film.

Herhaal de vorige stappen totdat de gewenste hoeveelheid zijde/AAV is gedeponeerd. Breng bij het bereiden van meerdere implantaten de zijde/AAV-oplossing aan op één implantaat en ga vervolgens verder met het coaten van andere implantaten, voordat u terugkeert naar het eerste. Na een uur drogen plaatst u de gehele ferrulehouder in een vacuümkamer en vacuüm droogt u 's nachts uit bij ongeveer 125 torr en vier graden Celsius.

Evalueer de volgende dag de vorm en positie van de resulterende zijdefilm onder een krachtige microscoop. Zorg ervoor dat films zijn beperkt tot het puntje van de optische vezel oppervlak, relatief dun, en symmetrisch. Voor het coaten van taps toelopende optische vezels, plaats de zijde / AAV injectie pipet tegen de zijkant van de optische vezel aan het begin van de taper, ervoor te zorgen dat de pipet is het aanraken van de optische vezel.

Uitwerp 20 nanoliter van zijde / AAV om het coatingproces te starten, ervoor te zorgen dat de druppel zich aan de optische vezel houdt en op de interface van de vezel en pipet blijft. Wick de druppel voorzichtig naar het einde van de vezelpunt als de zijde / AAV droogt, en houd de injectie pipet in contact met de drogende druppel om te voorkomen dat verstopping van de pipet tip. Wanneer de eerste bolus bijna volledig is gedroogd, ject dan nog eens 20 nanoliter en blijven wicking de druppel langs de taper.

Herhaal de vorige stap door het uitwerpen van kleine hoeveelheden zijde / AAV, en geleidelijk drogen van de oplossing aan de zijkant van de taper. Evalueer na het drogen de vorm en positie van de resulterende zijdefilm onder een krachtige microscoop. Voor het coaten van GRIN lensimplantaten, deponeren zijde / AAV in een enkele injectie op een GRIN lens implantaat.

Evalueer na het drogen de vorm en positie van de resulterende zijdefilm onder een krachtige microscoop om ervoor te zorgen dat de film het oppervlak van de lens bedekt. Voor het coaten van glazen schedelramen, handpipet een vijf-microliter druppel van zijde / AAV op het oppervlak van een drie millimeter ronde afdek slip, zodat de druppel verspreidt zich naar het gehele glasoppervlak te dekken. Bewaar na het drogen de met zijde/AAV gecoate optische vezels in een afgekoelde vacuümdesiccator op 125 torr en vier graden Celsius voordat u de apparaten implanteert.

Fluorescentie beelden van fluorofofoor-tagged optogenetische eiwitten op voorwaarde dat een maat voor de omvang van de expressie van de zijde / AAV films, en typische optische vezels kunnen gemakkelijk geschikt voor 200 nanoliters van zijde / AAV. Met de praktijk, kunnen onderzoekers bereiken zeer betrouwbare expressie rond het puntje van geïmplanteerde vezels. Twee mogelijke problemen met gecoate craniale ramen zijn onvoldoende expressie, en zijde films die niet op te lossen, en verduisteren het gezichtsveld.

Om de expressie te verhogen, kan een dwangctomie worden uitgevoerd voordat het venster wordt geïmplanteerd en/of de hoeveelheid virus in de film wordt verhoogd. De beste uitdrukking werd bereikt met behulp van een een tot vier mengsel van zijde en stock-titer AAV, respectievelijk. De hoeveelheid zijde in gecoate ramen is 10 tot 100 keer meer dan op vezelimplantaten, en de film is minder ingebed in weefsel, en mag dus niet worden blootgesteld aan dezelfde niveaus van proteolytische activiteit die zijdefilms kan oplossen.

Echter, de aanwezigheid van een zijde is essentieel voor het bereiken van uw expressie onder ramen, waarschijnlijk omdat een film gemaakt van virus alleen wordt weggespoeld door interstitiële vloeistof tijdens de operatie. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te bereiden en op te slaan zijde-gecoate implantaten op de manier die we beschrijven. Onjuiste opslag kan de eigenschappen van zijdefilms veranderen of de werkzaamheid van virale expressievectoren verminderen.

Deze techniek kan van groot nut zijn voor onderzoekers op het gebied van systeemneurowetenschappen om te onderzoeken hoe neurale activiteit zintuiglijke en cognitieve verwerking in de hersenen van zoogdieren zoals muizen, ratten, of zelfs niet-menselijke primaten drijft. Vergeet niet dat het werken met virale expressie vectoren kan gevaarlijk zijn en persoonlijke beschermingsmiddelen, zoals handschoenen, bril, en lab jassen, moet altijd worden gedragen tijdens het werken met Adeno-geassocieerde virus.