Name: In Vivo Gerichte expressie van Optogenetic eiwitten met behulp van Silk/AAV Films (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Leer gerichte expressie van optogenetische eiwitten in de hersenen met behulp van zijde/AAV-films. Deze methode vereenvoudigt virale vectordelivering en ondersteunt onderzoek naar neurale mechanismen in de systemneurowetenschap.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedank J. Vazquez voor illustraties, D. Kaplan en C. Preda voor reagentia en behulpzame begeleiding, en de laboratoria van B. Sabatini en C. Harvey voor in vivo imaging. Microscopie werd mogelijk gemaakt door M. Ocana en de neurobiologie Imaging Center, gedeeltelijk ondersteund door de neurale Imaging Center als onderdeel van een National Institute of Neurological Disorders en Stroke (NINDS) P30 Core Center verlenen (NS072030). Dit werk werd gesteund door de GVR Khodadad Family foundation, de Nancy Lurie merken foundation, en NIH grants, NINDS R21NS093498, U01NS108177 en NINDS R35NS097284 te W.G.R, en door een NIH postdoctoral fellowship F32NS101889 te C.H.C.

Alle experimenten met dieren werden verricht overeenkomstig de protocollen die zijn goedgekeurd door de Harvard Permanent Comité voor Animal Care volgende richtlijnen in de ons NIH- gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren beschreven. Volwassen C57BL/6 muizen van beide geslachten (6-15 weken oud) werden gebruikt voor alle experimenten.
1. Verkrijg waterige zijde Fibroin
<ol><li>Bereiden of koop waterige zijde fibroin (5-7,5% w/v).</li>
</ol>2. Meng waterige zijde met AAV expressievectoren
<ol><li>Kies een AAV expressie vector om te rijden het optogenetic eiwit of fluorescerende indicator van keuze. Opmerking: Om te minimaliseren van de hoeveelheid zijde/AAV die moet worden toegepast op implantaten tijdens het rijden nog steeds robuust expressie, voorraad-titer AAV (stock titers meestal verkregen vector kernen rond ~ 1013 gc/mL zijn) wordt aanbevolen.</li>
	<li>Onmiddellijk voorafgaand aan de coating implantaten, ontdooien van een aliquoot deel van AAV en combineren met 5-7,5% waterige zijde fibroin (dit mengsel zal worden verwezen als zijde/AAV). In een buis van 200 µL-PCR, meng waterige fibroin en AAV in een 1:1 verhouding (voor Cranio windows gebruik 1:4) onmiddellijk voorafgaand aan de toepassing. Zachtjes Pipetteer de oplossing in en uit meerdere keren de fibroin en de AAV grondig door elkaar.</li>
	<li>Houd zijde/AAV mengsel op ijs voorafgaand aan gebruik.</li>
</ol>3. voorbereiden apparatuur fabricage en opslag van zijde/AAV-gecoate apparaten
<ol><li>Het aanschaffen van apparatuur voor de coating optische vezels en verloop-Index (grijns) lenzen (figuren 1, 2).<ol>
<li>Construeer een stabiele verlengstuk houder. Voor de keramische ferrules, boorgaten 1.25 mm in een blok van ¼" blad acryl. Tik op de gaten als u wilt invoegen van stelschroeven vanaf de zijkant naar ferrules op zijn plaats houden. Opmerking: Elke klem kan worden gebruikt voor dit doel.</li>
		<li>Plaats een manipulator sub millimeter nauwkeurig verplaatsen van de optische vezels (stereotaxic toestellen of andere precisie-micromanipulator).</li>
		<li>Een stabiele houder om de positie van de microinjector te monteren.</li>
		<li>Gebruik een stereoscoop te visualiseren van optische vezels en zijde druppels.</li>
		<li>Plaats een lichtbron om te verlichten van de optische vezels.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiden van apparatuur voor de coating van de craniale windows (Figuur 3).<ol>
<li>Kies een pipet P10.</li>
		<li>Het verkrijgen van een container met deksel. Opmerking: op elk soort recipiënt met een siliconen bodem wordt voorgesteld — de zachte bodem vergemakkelijkt craniale windows opheft.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiden van apparatuur voor de opslag van afgewerkte implantaten (Figuur 4).<ol>
<li>Het verkrijgen van een vacuuemcel voor kleine (1-5 L).</li>
		<li>Zorg ervoor dat er ruimte voor het opslaan van implantaten in een koelkast 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. toepassing zijde/AAV Film op apparaten
<ol><li>Coating van optische vezels naar station focal expressie op het puntje van de vezel
	<ol>
<li>Bereiden chronische vezel implantaten als eerder beschreven4.</li>
		<li>Vóór gebruik spoelen implantaten met ethanol, dan met ultrazuiver water om ervoor te zorgen dat de optische vezels zijn schoon. Opmerking: Silk films houden betrouwbaarder om glazen oppervlakken schoon te maken.</li>
		<li>Een apparaat te houden van de vezel ferrules voor te bereiden. Voor typische 1.25 mm diameter ferrules, gebruik een blok ¼ inch heldere acryl, met ~1.3 mm gaten en tikte stelschroeven vanaf de zijkant naar gat implantaten stevig op zijn plaats (figuur 1A) in te voeren.</li>
		<li>Mount het verlengstuk houder in een stereotaxic apparaat (of een oplossing van de manipulatie met submillimeter precisie) met een microinjector uitgerust. Plaats de houder verlengstuk boven de microinjector en breng de zijde/AAV-mengsel van onderen. Opmerking: Dit is omdat toepassingen van grote volumes van bovenaf resulteerde in zijde/AAV dat niet beperkt is tot aan de vingertop. Echter kunt de toepassing van vele kleine sequentiële volumes van boven of onder produceren AAV/zijde deposito's die zijn beperkt tot de tip (hoewel we liever toe te passen uit de onderstaande lijst).</li>
		<li>Trek een pipet standaard intracraniële injectie van borosilicaatglas capillaire.<ol>
<li>Om het gemakkelijker te</li>
			<li>De tip van een injectie met een schone platte tip van de gewenste diameter produceren, één pipet Houd in elke hand en gebruiken het dikkere deel van de conus op één pipet te scoren de andere pipet op de locatie van de gewenste pauze.</li>
			<li>Wrijf zachtjes heen en weer in een zaagmachines beweging (de glas-op-glas scoren methode).</li>
			<li>Na het scoren van de pipet, zachte druk van toepassing op het puntje van de scoorde pipet met het lichaam van de andere pipet om een clean break.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Plaats een stereoscoop geven een duidelijk beeld van de optische vezel gezichten. Opmerking: Vergroting moet voldoende nauwkeurig de positie van de Pipet van de injectie boven het gezicht van optische vezels.</li>
		<li>Vezel implantaten invoegen houder met de hersenen-zijde van de optische vezel naar beneden.</li>
		<li>De injectie pipet met zijde/AAV oplossing, wat standaard intracraniële injectie5laden. Het laden van het bedrag dat vereist is voor het aantal implantaten worden aangebracht, plus ~ 30% extra voor verliezen als gevolg van pipetten verstopping. Bijvoorbeeld als 10 implantaten worden aangebracht, dan laden met 100 nL-deposito's en ~1.3 µL trekken. Opmerking: Silk/AAV kan aan het uiteinde van de pipet tussen Ejecties, die de pipet verstoppen kunnen droog. Grote diameter pipetten (50-100 µm) zijn minder waarschijnlijk te verstoppen. Klompen kunnen worden verdreven door zachte borstelen beneden het uiteinde van de pipet met een natte papieren doekje of alcohol doekje.</li>
		<li>Manoeuvreren de injectie pipet totdat het is aan te raken of bijna aanraken van het midden van het oppervlak van de optische vezel. Uitwerpen van 10-20 nL van zijde/AAV oplossing. Intrekken van de pipet. Opmerking: De snelheid van levering is niet kritisch, maar typisch tarieven zijn 5-20 nL/s.</li>
		<li>Observeren van de bolus van zijde/AAV op de vlakke ondergrond die wordt weergegeven als een vloeibare koepel die naar een platte film binnen ~ 1 min droogt (figuur 1B).</li>
		<li>Herhaal stappen 4.1.9-4.1.10 totdat de gewenste hoeveelheid zijde/AAV is gestort (20-200 nL voor de meeste toepassingen). Bij de voorbereiding van meerdere implantaten, zijde/AAV toepassen op één implantaat en verplaats vervolgens op jas andere implantaten voordat hij terugkeerde naar de eerste.</li>
		<li>Voorzien in 1 uur drogen alvorens implantaten.</li>
		<li>Vacuüm desiccate overnachting in ~ 125 Torr (-25 in. Hg), 4 ° C. Doe dit door het plaatsen van de hele verlengstuk houder in een vacuuemcel.</li>
		<li>Evalueren van de vorm en positie van de resulterende zijde film onder een high-power Microscoop. Zorgen ervoor dat de films zijn beperkt tot het uiteinde van de optische vezel oppervlak, worden relatief dunne (> 100 µm), en symmetrisch (Figuur 1 c). Opmerking: Grote of asymmetrische zijde/AAV films kunnen verjagen uit de vezel tijdens implantatie (Figuur 1 d). De meest voorkomende oorzaak van problemen komt voort uit de toepassing van enkele grote hoeveelheden in plaats van de sequentiële toepassing van vele kleine volumes.</li>
	</ol></li>
	<li>Coating tapered optische vezels op station expressie langs de as van de vezel
	<ol>
<li>Verkrijgen van taps toelopende optische vezel implantaten en het uitvoeren van de stappen 4.1.2-4.1.8, behalve dat de taps toelopende vezel lateraal ligt zodanig dat het loodrecht op de injector (figuur 2A). Plaats de injector boven de taps toelopende vezel. Opmerking: Vloeibare druppeltjes op tapse vezels poses laden uitdagingen, toegevoegd omdat oppervlaktespanning neiging tot druppels Spring terug op de injectie pipet of migreren van de taps toelopende vezel. Kleinere injectie pipetten (30-50 µm diameter) helpen om dit probleem te verhelpen maar verhogen het risico dat de injectie pipet zal verstoppen. Als gevolg van oppervlaktespanning, druppels de neiging vast te houden aan het gebied van grootste oppervlak, zodat de optimale injectie Pipetteer grootte is afhankelijk van de grootte van de taps toelopende vezel en iemands tolerantie voor de occasionele klomp.</li>
		<li>Plaats de pipet zijde/AAV injectie tegen de zijkant van de optische vezel aan het begin van de conus. Zorg ervoor dat de injectie Pipet is het aanraken van de optische vezel.</li>
		<li>Uitwerpen van 20 nL van zijde/AAV de coatingproces te starten. Ervoor zorgen dat de druppel houdt zich aan de optische vezel en op het raakvlak van de vezel/pipet blijft. De druppel aan het einde van het uiteinde van de vezel zachtjes pit zoals de zijde/AAV droogt (~ 45 s). Houd de injecterende pipet in contact met de drogen druppel om te voorkomen dat verstopping van het uiteinde van de pipet. Opmerking: Elke storting moet jas ongeveer 400 µm van de taps toelopende vezel (figuur 2B).</li>
		<li>Wanneer de eerste bolus is bijna volledig opgedroogd, uitwerpen nog eens 20 nL en blijven de druppel langs de conus wicking. Opmerking: De vloeibare zijde zal voldoen aan de gedroogde zijde, verankerende één uiteinde van de druppel als de pipet langs de conus beweegt.</li>
		<li>Herhaal stap 4.2.4 door kleine hoeveelheden zijde/AAV uitwerpen, en geleidelijk aan de oplossing van de kant van de conus. 5-6 ejecties volstaan om te doorkruisen van het oppervlak van een 2.5 mm conus.</li>
		<li>Als u wilt rijden meer uniforme expressie rond alle zijden van de vezel, draaien de vezel en herhaal stappen 4.2.2-4.2.5 totdat de gewenste hoeveelheid zijde/AAV is nedergelegd.</li>
		<li>Als een hangende onderdeel van gedroogde zijde/AAV verder reikt dan de tip van de vezel, zorgvuldig het onderdeel knippen met een schaar of gebruik de pipet uitwerpen om te buigen van het strand terug en het voldoen aan de conus van de vezel.</li>
		<li>Voorzien in 1 uur drogen alvorens implantaten.</li>
		<li>Vacuüm desiccate overnachting in 4 ° C. De gehele verlengstuk houder kan worden geplaatst in een vacuuemcel.</li>
		<li>Evalueren van de vorm en positie van de resulterende zijde film onder een high-power Microscoop. Opmerking: Films hoeft niet volledig uniforme maar moeten geen bultjes die meer dan 100 µm voorbij de oppervlakte van de vezel tot een minimum beperken van schade aan het omliggende weefsel tijdens implantatie (Figuur 3 c) uit te breiden. Om te minimaliseren van de grootte van de film, is het essentieel dat elke druppel volledig droog is voordat daaropvolgende deposito's zijn gemaakt.</li>
	</ol></li>
	<li>Coating grijns lens implantaten
	<ol>
<li>GRIJNS lenzen6,7 te verkrijgen en herhaalt u stappen 4.1.2-4.1.8. De injector kan boven worden gemonteerd.</li>
		<li>Zijde/AAV storten in een enkele uitwerpen (1 µL voor een 1,0 mm diameter lens). Opmerking: Dit zal een koepel van vloeistof die voldoet aan het gezicht van de lens, en droogt om te produceren een uniforme film (100-200 µm dik) opleveren. Echter, in het geval dat een enkele grote uitwerpen ongelijk droogt en produceert een film die is dikker in de buurt van de randen van het objectief grijns, probeer te storten meerdere kleinere druppels (100-200 nL) in het midden van het oppervlak van de lens (waardoor elke druppel drogen voordat het storten de volgende) om ervoor te zorgen dat de film expressie in het midden van het gezichtsveld rijden zal.</li>
		<li>Voorzien in 1 uur drogen alvorens implantaten.</li>
		<li>Evalueren van de vorm en positie van de resulterende zijde film onder een high-power Microscoop om ervoor te zorgen dat de film de oppervlakte van de lens beslaat.</li>
	</ol></li>
	<li>Cranial loodramen coating
	<ol>
<li>Bereiden van glas craniale windows door daaraan vastzittende twee 3 mm diameter ronde coverslips (nr. 1 dikte) naar een 5 mm diameter venster met optische lijm (voor meer informatie, zie Goldey et al. 20148).</li>
		<li>Meng zijde: virus in een verhouding van 1:4 tot vermindering van het totale bedrag van zijde in de film. Buitensporig veel zijde lossen niet op onder craniale windows na implantatie. Titratie experimenten mogelijk moet bepalen de verhouding en het volume waarmee het profiel van de gewenste expressie.</li>
		<li>Hand Pipetteer een druppel 5 µL op het oppervlak van de 3 mm (hersenen gerichte) dekglaasje aan. De druppel moet verspreid ter dekking van het hele glasoppervlak (Figuur 3).</li>
		<li>Mogelijk 2-3 uur drogen voordat u windows.</li>
	</ol></li>
</ol>5. opslaan van zijde/AAV-gecoate implantaten
<ol><li>Zijde/AAV-gecoate optische vezels in een gekoelde vacuüm exsiccator (~ 125 Torr, 4 ° C) worden opgeslagen vóór gebruik (figuur 4A).</li>
	<li>Bewaar niet craniale windows en grijns lenzen onder vacuüm, zoals grote zijde films opgeslagen onder vacuüm niet volledig los na implantatie. Cranial windows en grijns lenzen implantaat onmiddellijk na het drogen, of binnen een dag na bereiding als opgeslagen bij atmosferische druk en 4 ° C.</li>
</ol>6. het implanteren van de apparaten
<ol><li>Dieren voorbereiden door implantaatchirurgie als eerder beschreven4.<ol>
<li>Kort, anesthetize van muizen met een intraperitoneale injectie van ketamine/xylazine (100/10 mg/kg) en controleert u de diepte van de verdoving met behulp van een zachte teen-snuifje. Scheren van de schedel op het gebied van het implantaat en het reinigen van de hoofdhuid met jodium en alcohol.</li>
		<li>Dieren in een stereotaxic apparaat koppelen en aan te vullen anesthesie met behulp van een mengsel van zuurstof en Isofluraan (1-2%). Maak een incisie in de hoofdhuid over het gebied van belang, en het uitvoeren van een craniotomy die groot genoeg is voor het implantaat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Implantaat optische vezels9 en microendoscope lenzen10 volgens eerder gepubliceerde procedures. Handvat implantaten met zorg, zoals de zijde/AAV storting kan worden geklopt door een onvolmaakte craniotomy of door het implantaat vangen aan de rand van de schedel. Lagere het implantaat in de hersenen langzaam (~ 2 mm/min).</li>
	<li>Implantaat craniale windows zoals eerder8beschrijven. Raak de gecoate kant van het venster en te voorkomen dat het venster met vloeistof spoelen als het uitvoeren van de maagsonde, zoals dit het virus wegspoelen kan. Om te bereiken maximale expressie, een durotomy uit te voeren.</li>
</ol>7. de expressie wordt geëvalueerd en probleemoplossing
<ol><li>Om te beoordelen uiting van viraal uitgedrukt eiwitten, mogelijk ~ 2-3 weken voor het virus te rijden van expressie, dan intracardial perfusie met 4% paraformaldehyde uitvoeren in fosfaat gebufferde zoutoplossing11 en proces hersenweefsel voor tl microscopie12.</li>
	<li>De expressie wordt geëvalueerd met behulp van fluorescentie microscopie om het imago van het expressiepatroon van optogenetic fluorophore-gelabelde proteïnen.</li>
	<li>Als het niveau van meningsuiting onvoldoende is, verhogen de hoeveelheid virus in coatings ofwel het verhogen van het totale volume van de zijde/AAV-coating, of bij voorkeur met een hogere titer-virus.</li>
</ol>

<ol><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li>
<li>Tervo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Designer+AAV+Variant+Permits+Efficient+Retrograde+Access+to+Projection+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li>
<li>Jackman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk+Fibroin+Films+Facilitate+Single-Step+Targeted+Expression+of+Optogenetic+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Silk Fibroin Films Facilitate Single-Step Targeted Expression of Optogenetic Proteins.</a> Cell Reports. 22 (12), 3351-3361 (2018).</li>
<li>Ung, K., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber-optic+implantation+for+chronic+optogenetic+stimulation+of+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), e50004(2012).</li>
<li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+injection+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intracranial injection of adeno-associated viral vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li>
<li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li>
<li>Sparta, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2011).</li>
<li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cortical%2C+subcortical+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
<li>Park, J. J., Cunningham, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin+sectioning+of+slice+preparations+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Thin sectioning of slice preparations for immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. (3), 194(2007).</li>
<li>Cao, Y., Wang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradation+of+silk+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biodegradation of silk biomaterials.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (4), 1514-1524 (2009).</li>
<li>Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+high-frequency+optical+control+of+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission.</a> Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).</li>
<li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nature Neuroscience. 13 (5), 584-591 (2010).</li>
<li>Hines, D. J., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+controlled+release+from+silk+fibroin+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of controlled release from silk fibroin films.</a> Biomacromolecules. 12 (3), 804-812 (2011).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+silk+material+structure+by+temperature-controlled+water+vapor+annealing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Regulation of silk material structure by temperature-controlled water vapor annealing.</a> Biomacromolecules. 12 (5), 1686-1696 (2011).</li>
<li>Rockwood, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+fabrication+from+Bombyx+mori+silk+fibroin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).</li>
<li>Yucel, T., Cebe, P., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vortex-induced+injectable+silk+fibroin+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels.</a> Biophysical Journal. 97 (7), 2044-2050 (2009).</li>
<li>Wang, X., Kluge, J. A., Leisk, G. G., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonication-induced+gelation+of+silk+fibroin+for+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Sonication-induced gelation of silk fibroin for cell encapsulation.</a> Biomaterials. 29 (8), 1054-1064 (2008).</li>
<li>Lee, J., Park, S. H., Seo, I. H., Lee, K. J., Ryu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+repeatable+fabrication+of+high+A%2FR+silk+fibroin+microneedles+using+thermally-drawn+micromolds%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Rapid and repeatable fabrication of high A/R silk fibroin microneedles using thermally-drawn micromolds.</a> European Journal of Biopharmaceutics. 94, 11-19 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het gebruik van zijde/AAV te richten op de expressie van optogentic eiwitten overwint beperkingen van benaderingen die momenteel in gebruik. Hoewel vele studies succesvol AAV injecties gebruiken uitspreken optogenetic eiwitten, is het uitdagend expressie naar het uiteinde van de optische vezels, regio's rond de lengte van taps toelopende vezels, en de regio bekijken van een grijns lens worden uitgelijnd. Vanwege de afwijking tussen optische componenten en optogenetic expressie, stereotaxic injecties kunnen onbetrouwbaar ...

De afgelopen tien jaar heeft geproduceerd een explosie van gemanipuleerde lichtgevoelige eiwitten voor monitoring en manipuleren van neurale activiteit1. Virussen bieden ongeëvenaarde flexibiliteit voor het uitdrukken van deze hulpmiddelen van de optogenetic in de hersenen. Ten opzichte van transgene dieren, zijn virussen veel gemakkelijker te produceren, transporteren en opslaan, waardoor snelle implementatie van de nieuwste optogenetic hulpmiddelen. Expressie kan op verschillende neuronale populaties genetisch worden gericht, en virussen ontworpen voor de retrograde vervoer kunnen zelfs gebruikt worden om expressie gebaseerd op neuronal connectiviteit2.
Virussen komen meestal met stereotaxic injecties, die tijdrovend en uitdagend kunnen. Juist gericht op kleine regio's kunnen moeilijk, terwijl veel injecties expressie rijden over grote gebieden vaak vereist. Bovendien, wanneer een optisch instrument vervolgens geïmplanteerde in de hersenen is te leveren licht in vivo, het implantaat moet correct wordt uitgelijnd met de virale injectie. Hier beschrijven we een gemakkelijk geïmplementeerde methode voor het leveren van virale vectoren aan het weefsel rond een geïmplanteerde apparaat met behulp van zijde fibroin films3. Zijde fibroin is commercieel beschikbaar, goed verdragen door zenuwweefsel, en kan worden gebruikt voor de productie van materialen met diverse eigenschappen. Zijde films kunnen worden toegepast op implantaten met behulp van gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur zoals microinjection pipetten of hand pipetten. Zijde/AAV films de eis voor twee chirurgische procedures elimineren en ervoor zorgen dat virus-gemedieerde expressie correct wordt uitgelijnd met het optische implantaat. De resulterende expressie is beperkt tot het puntje van de vezels en resultaten in minder ongewenste expressie langs het spoor van de vezels dan stereotaxic injecties.
Naast het produceren van gerichte expressie op het puntje van kleine vezels, zijde/AAV films kunnen worden gebruikt om grootschalige rijden (> 3 mm doorsnede) corticale expressie onder craniale windows. In vivo 2-foton beeldvorming van fluorescerende activiteit sensoren is uitgegroeid tot een onmisbaar instrument voor de beoordeling van de rol van neuronale activiteit in het rijden van zintuiglijke en cognitieve verwerking. Echter om uniforme uitdrukking over de brede corticale gebieden, onderzoekers vaak uitvoeren meerdere injecties. Deze injecties kunnen zeer tijdrovend en kunnen leiden tot inconsistente expressie het gezichtsveld. Daarentegen zijn zijde/AAV-gecoate craniale ramen zeer eenvoudig te fabriceren, sterk verminderen de tijd die nodig is voor operaties en meest opmerkelijk drive expressie honderden van micron onder de corticale oppervlak.

<table><tbody><tr><td>Aqueous silk fibroin</td><td>Sigma</td><td>5154-20ML</td><td>Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) voor het maken van films</td></tr><tr><td>Microinjector om silk/AAV af te zetten</td><td>Drummond</td><td>3-000-207</td><td>Nanoject III nanoliter injector</td></tr><tr><td>Manipulator om implantaten vast te houden</td><td>Narashige</td><td>MM-33</td><td>Micromanipulator</td></tr><tr><td>Stereoscoop om silk afzettingen te visualiseren</td><td>AmScope</td><td>SM-6TX-FRL</td><td>3.5X-45X Trinoculair articulerend zoommicroscoop met ringlicht</td></tr><tr><td>Vacuumkamer om implantaten op te slaan</td><td>Ablaze</td><td>N/A</td><td>3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber</td></tr><tr><td>Optioneel, implantaathouder voor opslag</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Om voorgemaakte optische vezels op te slaan, boor een raster van ~4 mm diepe gaten met een diameter net iets groter dan de ferrule diameter in een plastic blok.</td></tr><tr><td>Optische vezels</td><td>Thorlabs</td><td>FT200EMT</td><td>&Oslash;200 &micro;m Core Multimode Optische Vezel voor vezelimplantaten</td></tr><tr><td>Ferrules</td><td>Kientec</td><td>FZI-LC-230</td><td>LC Zirconia Ferrule voor vezelimplantaten</td></tr><tr><td>Diverse materialen voor het vervaardigen van chronische vezelimplantaten</td><td>Diverse</td><td>N/A</td><td>Voor gedetailleerde procedure, zie Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantatie voor chronische optogenetische stimulatie van hersenweefsel. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68).</td></tr><tr><td>Taperende vezelimplantaten</td><td>Optogenix</td><td>Lambda-B</td><td>Taperende vezelimplantaten</td></tr><tr><td>GRIN lenzen</td><td>GoFoton</td><td>CLH-100-WD002-002-SSI-GF3</td><td>GRIN lenzen</td></tr><tr><td>Kleine glazen craniale vensters</td><td>Warner</td><td>64-0726 (CS-3R-0)</td><td>Klein rond dekglas, #0 dikte</td></tr><tr><td>Grote glazen craniale vensters</td><td>Warner</td><td>64-0731 (CS-5R-0)</td><td>Klein rond dekglas, #0 dikte</td></tr><tr><td>Diverse materialen voor het vervaardigen van craniale vensters</td><td>Diverse</td><td>N/A</td><td>Voor gedetailleerde procedure, zie Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515.</td></tr></tbody></table>

in vivo gerichte expressie van optogenetic eiwitten met behulp van silk/aav films

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

De zoektocht om te begrijpen hoe neurale circuits Procesinformatie in volgorde naar station gedrags-uitvoer sterk door de onlangs ontwikkelde optische methoden geholpen heeft voor het manipuleren van en toezicht op de activiteit van neuronen in vivo. Dit soort experimenten is afhankelijk van twee hoofdcomponenten: 1) de implanteerbare hulpmiddelen die optische toegang bieden tot de hersenen, en 2) lichtgevoelige eiwitten die wijzigen van neuronale prikkelbaarheid of leveren een uitlezing van neuronale activiteit. Er zijn een aantal manieren uitspreken lichtgevoelige eiwitten, maar stereotaxic injectie van virale vectoren is momenteel de meest flexibele benadering omdat expressie kan worden gecontroleerd met genetische, anatomische en temporele precisie. Ondanks het grote nut van virale vectoren, het leveren van het virus naar de site van optische implantaten poses tal van uitdagingen. Stereotaxic virus injecties eisen chirurgie, die chirurgische tijd verhogen, verhogen de kosten van studies, en een risico voor de gezondheid van het dier. Het omliggende weefsel kan fysiek worden beschadigd door de injectiespuit en immunogene ontsteking veroorzaakt door de abrupte levering van een bolus van hoge-titer virus. Uitlijnen van injecties met optische implantaten is vooral moeilijk wanneer de doelcomputer kleine regio's diep in de hersenen. Om deze uitdagingen te overwinnen, beschrijven we een methode voor het aanbrengen van meerdere soorten optische implantaten met films samengesteld van zijde fibroin en Adeno-geassocieerde virale (AAV) vectoren. Fibroin, een polymeer dat is afgeleid van de cocon van Bombyx mori, kunt samenvatten en beschermen van biomoleculen en in vormen variërend van oplosbare films tot keramiek kan worden verwerkt. Wanneer de hersenen ingeplant, laat zijde/AAV coatings virus op het raakvlak tussen optische elementen en de omringende hersenen, rijden expressie precies waar dat nodig is. Deze methode is eenvoudig toe te passen en belooft te sterk vergemakkelijken in vivo onderzoeken van neurale functie.

Om te beoordelen van het succes van zijde/AAV films in expressie rijden, we geperfundeerd dieren 2-3 weken na implantatie en bereid hersenen segmenten uit de regio van belang. Fluorescentie beelden van optogenetic fluorophore-gelabelde proteïnen (ChR2-YFP) verstrekt een maatregel van de mate van expressie (Figuur 1 d). Typische optische vezels (230 µm diameter) kunnen gemakkelijk 200 nL van zijde/AAV. Met praktijk kunnen onderzoekers zeer betrouwbare expressi...

Hier presenteren we een methode voor het leveren van Virale expressievectoren in de hersenen met behulp van zijde fibroin films. Met deze methode kunt gerichte levering van expressievectoren met zijde/AAV gecoate optische vezels, taps toelopende optische vezels en craniale windows.

In Vivo Gerichte expressie van Optogenetic eiwitten met behulp van Silk/AAV Films

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van systeemneurowetenschappen. Zoals hoe de activiteit van neuronale ensembles sensorische en cognitieve verwerking in de hersenen ondersteunt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het vergemakkelijkt de nauwkeurige targeting van optogenetische eiwitten zoals Chan rhodopsin en GCaMP naar hersengebieden van belang, zonder dat een aparte virus injectie procedure.Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang, omdat de afzetting van zijde en virus aan kleine optische implantaten enige oefening kan vertwijden om reproduceerbare resultaten te bereiken. Meng eerst ontdooide AAV en vijf tot zeven punt vijf procent waterige zijdefibroin in een één-op-één verhouding in een 200 microliter PCR-buis. Voorzichtig pipette de oplossing in en uit meerdere malen om grondig mengen van de AAV en fibroine.Om de zijde / AAV te deponeren, laad een injectie pipet met de hoeveelheid oplossing die nodig is voor het aantal vezel implantaten worden gemaakt, plus ongeveer 30 procent extra om verliezen als gevolg van pipet verstopping tegemoet te komen. Monteer vervolgens een ferrulehouder in een stereotaxic-apparaat dat is uitgerust met een microinjector. Plaats de ferrulehouder boven de microinjector en breng het zijde/AAV mengsel van onderen aan.Manoeuvreer de injectiepipet totdat het raakt of bijna het raken van het centrum van de optische vezel oppervlak, en uitwerpen 10 tot 20 nanoliter van zijde / AAV oplossing. Trek vervolgens de pipet terug. Bekijk vervolgens de bolus van zijde/AAV op het vlakke oppervlak dat verschijnt als een vloeibare koepel die binnen ongeveer een minuut opdroogt tot een platte film.Herhaal de vorige stappen totdat de gewenste hoeveelheid zijde/AAV is gedeponeerd. Breng bij het bereiden van meerdere implantaten de zijde/AAV-oplossing aan op één implantaat en ga vervolgens verder met het coaten van andere implantaten, voordat u terugkeert naar het eerste. Na een uur drogen plaatst u de gehele ferrulehouder in een vacuümkamer en vacuüm droogt u 's nachts uit bij ongeveer 125 torr en vier graden Celsius.Evalueer de volgende dag de vorm en positie van de resulterende zijdefilm onder een krachtige microscoop. Zorg ervoor dat films zijn beperkt tot het puntje van de optische vezel oppervlak, relatief dun, en symmetrisch. Voor het coaten van taps toelopende optische vezels, plaats de zijde / AAV injectie pipet tegen de zijkant van de optische vezel aan het begin van de taper, ervoor te zorgen dat de pipet is het aanraken van de optische vezel.Uitwerp 20 nanoliter van zijde / AAV om het coatingproces te starten, ervoor te zorgen dat de druppel zich aan de optische vezel houdt en op de interface van de vezel en pipet blijft. Wick de druppel voorzichtig naar het einde van de vezelpunt als de zijde / AAV droogt, en houd de injectie pipet in contact met de drogende druppel om te voorkomen dat verstopping van de pipet tip. Wanneer de eerste bolus bijna volledig is gedroogd, ject dan nog eens 20 nanoliter en blijven wicking de druppel langs de taper.Herhaal de vorige stap door het uitwerpen van kleine hoeveelheden zijde / AAV, en geleidelijk drogen van de oplossing aan de zijkant van de taper. Evalueer na het drogen de vorm en positie van de resulterende zijdefilm onder een krachtige microscoop. Voor het coaten van GRIN lensimplantaten, deponeren zijde / AAV in een enkele injectie op een GRIN lens implantaat.Evalueer na het drogen de vorm en positie van de resulterende zijdefilm onder een krachtige microscoop om ervoor te zorgen dat de film het oppervlak van de lens bedekt. Voor het coaten van glazen schedelramen, handpipet een vijf-microliter druppel van zijde / AAV op het oppervlak van een drie millimeter ronde afdek slip, zodat de druppel verspreidt zich naar het gehele glasoppervlak te dekken. Bewaar na het drogen de met zijde/AAV gecoate optische vezels in een afgekoelde vacuümdesiccator op 125 torr en vier graden Celsius voordat u de apparaten implanteert.Fluorescentie beelden van fluorofofoor-tagged optogenetische eiwitten op voorwaarde dat een maat voor de omvang van de expressie van de zijde / AAV films, en typische optische vezels kunnen gemakkelijk geschikt voor 200 nanoliters van zijde / AAV. Met de praktijk, kunnen onderzoekers bereiken zeer betrouwbare expressie rond het puntje van geïmplanteerde vezels. Twee mogelijke problemen met gecoate craniale ramen zijn onvoldoende expressie, en zijde films die niet op te lossen, en verduisteren het gezichtsveld.Om de expressie te verhogen, kan een dwangctomie worden uitgevoerd voordat het venster wordt geïmplanteerd en/of de hoeveelheid virus in de film wordt verhoogd. De beste uitdrukking werd bereikt met behulp van een een tot vier mengsel van zijde en stock-titer AAV, respectievelijk. De hoeveelheid zijde in gecoate ramen is 10 tot 100 keer meer dan op vezelimplantaten, en de film is minder ingebed in weefsel, en mag dus niet worden blootgesteld aan dezelfde niveaus van proteolytische activiteit die zijdefilms kan oplossen.Echter, de aanwezigheid van een zijde is essentieel voor het bereiken van uw expressie onder ramen, waarschijnlijk omdat een film gemaakt van virus alleen wordt weggespoeld door interstitiële vloeistof tijdens de operatie. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te bereiden en op te slaan zijde-gecoate implantaten op de manier die we beschrijven. Onjuiste opslag kan de eigenschappen van zijdefilms veranderen of de werkzaamheid van virale expressievectoren verminderen.Deze techniek kan van groot nut zijn voor onderzoekers op het gebied van systeemneurowetenschappen om te onderzoeken hoe neurale activiteit zintuiglijke en cognitieve verwerking in de hersenen van zoogdieren zoals muizen, ratten, of zelfs niet-menselijke primaten drijft. Vergeet niet dat het werken met virale expressie vectoren kan gevaarlijk zijn en persoonlijke beschermingsmiddelen, zoals handschoenen, bril, en lab jassen, moet altijd worden gedragen tijdens het werken met Adeno-geassocieerde virus.

in-vivo-targeted-expression-optogenetic-proteins-using-silkaav

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De recente ontwikkeling van de neurowetenschappen tools die genetica en optica combineren, aangeduid als "optogenetics", stelt de controle over neurale circuit activiteit met een ongekend niveau van ruimtelijke en temporele resolutie. Hier bieden wij een protocol voor de integratie in vivo opnemen met optogenetic manipulatie van genetisch gedefinieerde subsets van de prefrontale cortex en subicular piramidale neuronen.

Een methode voor High Fidelity optogenetic controle van individuele piramidale neuronen<em&gt; In vivo</em

Dit protocol beschrijft de stappen en gegevensanalyse die nodig zijn om optogenetisch functioneel magnetische resonantiebeeldvorming (ofMRI) met succes uit te voeren. ofMRI is een nieuwe techniek die high-field fMRI-uitlezing combineert met optogenetische stimulatie, waardoor het mogelijk wordt om celtype-specifieke kaarten van functionele neurale circuits en hun dynamica in de gehele levende hersenen te maken.

Optogenetische Functionele MRI

Hier demonstreren we magnetische resonantie (MR)-geleide convectie verbeterde levering (CED) van virale vectoren in de cortex als een efficiënte en vereenvoudigde aanpak voor het bereiken van optogenetische expressie in grote corticale gebieden in de makaak hersenen.

Convectie verbeterde levering van Optogenetische adeno-geassocieerde virale vector aan de cortex van rhesus macaque onder begeleiding van online MRI-beelden

Het huidige protocol demonstreert een eenvoudige methode voor het traceren van ventrale tegmentale gebied (VTA) glutamaatprojecties naar de hippocampus. Fotostimulatie van VTA-glutamaatneuronen werd gecombineerd met CA1-opname om aan te tonen hoe VTA-glutamaatterminals ca1-putatieve piramidale vuursnelheid in vivo moduleren.

Gecombineerde In Vivo anatomische en functionele tracing van Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in de Hippocampus

Hier presenteren we een methode voor het onderzoeken van neurietmorfogenese in postnatale muis retinale explantaten door time-lapse confocale microscopie. We beschrijven een aanpak voor schaarse etikettering en acquisitie van retinale celtypen en hun fijne processen met behulp van recombinante adeno-geassocieerde virusvectoren die membraangerichte fluorescerende eiwitten op een Cre-afhankelijke manier tot expressie brengen.

Time-lapse beeldvorming van neuronale arborisatie met behulp van schaarse Adeno-geassocieerde virusetikettering van genetisch gerichte retinale celpopulaties

Zoals momenteel geïmplementeerd, vereist optogenetica bij niet-menselijke primaten injectie van virale vectoren in de hersenen. Een optimale injectiemethode moet betrouwbaar zijn en, voor veel toepassingen, in staat zijn om individuele locaties van willekeurige diepte te targeten die gemakkelijk en ondubbelzinnig worden geïdentificeerd in de postmortale histologie. Een injectiemethode met deze eigenschappen wordt gepresenteerd.

Injecties van AAV-vectoren voor optogenetica in verdoofde en wakkere zich gedragende niet-menselijke primatenhersenen

Dit protocol beschrijft een nieuwe rAAV-gebaseerde transient enhancer-reporter assay. Deze test kan worden gebruikt om enhancer-gedreven expressie in vivo in het muizenbrein te induceren.

AAV-implementatie van enhancer-gebaseerde expressieconstructies in vivo in muizenhersenen

Bioluminescentie - licht uitgezonden door een luciferase-enzym dat een substraat met kleine moleculen oxideert, een luciferine - kan worden gebruikt om fotosensorische eiwitten te activeren, waardoor een andere dimensie wordt toegevoegd aan lichtstimulatie en de manipulatie van een veelheid aan lichtgemedieerde functies in cellen op temporele en ruimtelijke schalen mogelijk wordt.

Bioluminescente optogenetica 2.0: Bioluminescentie benutten om fotosensorische eiwitten in vitro en in vivo te activeren

Hier presenteren we een protocol dat virale transductie van discrete hersengebieden beschrijft met optogenetische constructies om synapsspecifieke elektrofysiologische karakterisering in acute hersenplakken van knaagdieren mogelijk te maken.

Ex Vivo | Optogenetische ondervraging van synaptische transmissie en plasticiteit op lange afstand van mediale prefrontale cortex naar laterale entorhinale cortex

Subretinale injecties zijn een onmisbare techniek voor de preklinische ontwikkeling van therapieën voor fotoreceptor- en RPE-ziekten. We beschrijven een geoptimaliseerde transsclerale subretinale injectietechniek bij muizen die de intraoperatieve slagingspercentages verbetert en schade aan het netvlies minimaliseert.

Geoptimaliseerde minimaal invasieve transsclerale subretinale injectietechniek bij muizen

Leer gerichte expressie van optogenetische eiwitten in de hersenen met behulp van zijde/AAV-films. Deze methode vereenvoudigt virale vectordelivering en ondersteunt onderzoek naar neurale mechanismen in de systemneurowetenschap.

In Vivo Gerichte expressie van Optogenetic eiwitten met behulp van Silk/AAV Films

Meer video's verkennen