Stabiele DNA motieven, 1D en 2D nanostructuren opgebouwd uit kleine cirkelvormige DNA-moleculen

Deze methode breidt DNA nanotechnologie van de bronmaterialen van lineaire oligonucleotide, DAS, in wat meer cirkelvormige DAS uit. De belangrijkste voordelen van deze technische zijn dat het een eenvoudige, robuuste en betaalbare voor de meeste laboratoria. Voor circulaire DNA-zuivering voegt u 20 microliter formamide toe aan een oplossing van vers bereid, intact circulair DNA, tot een eindvolume van 140 microliter met mengen.

Laad 16 tot 20 microliter van circulaire DNA-oplossing op elk van de zeven tot negen denaturering PAGE gel putten. Meng twee microliter van lading kleurstof met acht microliters van de overeenkomstige voorloper lineaire DNA, en injecteren van het mengsel in een aparte referentie goed. Dan lopen de gel voor ongeveer twee uur op 10 volt per centimeter, het stoppen van de run wanneer de xylene cyanol FF kan worden waargenomen ongeveer twee derde van de gel.

Het dragen van rubberen handschoenen en bril, breng de gel op een fluorescerende dunne laag chromatografie plaat, en gebruik een scheermesje af te snijden van de doelgel banden, zoals geschaduwd door de UV-bestraling. Plaats de gel banden in een twee milliliter microcentrifuge buis voor het drogen, dan pureer de gedroogde gels in een pasta, en voeg gedeïoniseerd water op twee keer het volume van de gel, voor 's nachts schudden bij kamertemperatuur. De volgende ochtend, filter het mengsel in een twee milliliter microcentrifuge buis, spoelen de zijkanten van de eerste buis met een klein volume van gedeïoniseerd water om eventuele resterende DNA terug te vorderen, en filteren weer om de supernates te combineren.

Zuiver vervolgens het circulaire DNA via ethanolneerslag en bewaar het DNA bij min 20 graden Celsius. Voor een pot annealing, meng twee microliter van 10-voudige Tris acetaat EDTA magnesium buffer, een microliter van elke 10 micromolar DNA voorraad oplossing van een set van lineaire en cirkelvormige strengen in gelijke molaire verhoudingen, en extra Tris EDTA buffer in een 200 microliter PCR testbuis, tot een uiteindelijk volume van 20 microliter. Dan anneal de montage oplossing in een thermische fles van 95 tot 25 graden Celsius, meer dan 48 uur.

Voor tweestaps annealing van oneindige roosters, meng twee microliters van 10-voudig Tris acetaat EDTA magnesium buffer, een microliter van elke 10 micromolar DNA voorraad oplossing van een set van lineaire en cirkelvormige strengen in gelijke molaire verhoudingen, en extra Tris EDTA buffer in een 200 microliter PCR reageerbuis, tot een uiteindelijk volume van 20 microliter. In de eerste sub-tegel annealing stap, anneal elke precursor sub-tegel oplossing in een PCR thermocycler, met behulp van een snelle lineaire koelmethode van 95 tot 25 graden Celsius, meer dan twee en een half uur. Om de assemblageoplossing voor te bereiden, mengt u voor elk van de vier oneindige roosters 10 microliters van elk van de twee corresponderende subtegeloplossingen samen tot een uiteindelijke concentratie van 0,25 micromolar voor elke streng.

In de tweede rooster annealing stap, anneal de 20 microliter mengsel in een PCR thermocycler, met behulp van een langzame koelmethode. Voor twee stap annealing van twee eindige rechthoek roosters, meng een microliter van 10 voudig Tris acetaat EDTA magnesium buffer, 0,5 microliter van elke 10 micromolar DNA voorraad oplossing van een set van lineaire en cirkelvormige strengen in gelijke molar ratio's, en extra Tris EDTA buffer in een 200 microliter PCR testbuis, tot een uiteindelijk volume van 10 microliter. In de eerste annealing stap, anneal elke precursor sub-tegel oplossing in de PCR thermocycler, met behulp van de snelle lineaire koelmethode, zoals aangetoond, van 95 tot 25 graden Celsius, meer dan twee en een half uur, en meng de geannealed 32 sub-tegel oplossingen, elk met 2 microliter, samen in een 200 microliter PCR-reageerbuis, tot een uiteindelijk volume van 64 microliter.

Dan, in de tweede annealing stap, anneal de 64 microliter mengsel in de thermocycler, met behulp van de langzame koeling methode, zoals aangetoond. Voor elektroforese zuivering van de eindige roosters, bereiden een native 2%agarose gel en belasting 20 microliters van de eindige rooster oplossing in elke put, samen met de toevoeging van 5 microliters van een 100 tot 3000 base-pair DNA ladder, in een aparte put. Na het uitvoeren van de gel gedurende twee uur op 5 volt per centimeter in een ijswaterbad, snijd de doelgelbanden op ongeveer het niveau van de 1000 base pair marker onder UV-licht, zoals aangetoond, en snijd de gel banden in fijne stukken.

Plaats de geplette gels in een filterkolom en centrifuge de kolom om de roosters te extraheren. Verzamel vervolgens de oplossing voor microscopiebeeldvorming met atoomkracht. Voor eindige roosterzuivering door polyethalene glycol, of PEG, meng 50 microliters van de eindige roosteroplossing met een gelijk volume van 15%PEG 8000 buffer, centrifuge de oplossing, en opnieuw opschorten de pellet in 100 microliters van PEG buffer, voor een extra centrifugatie.

Na de tweede centrifugatie, opnieuw opschorten de pellet in Tris acetaat EDTA magnesium buffer, voor atomaire kracht microscopie imaging. Voor oneindige 2D rooster atoomkracht microbeeldvorming, klijp een verse laag mica, en deponeren twee microliters van de geannealed monster op het schone oppervlak. Laat de DNA-roosters twee minuten absorberen op het mica-oppervlak, voordat u het oppervlak twee keer wast, met 100 microliters gedeïoniseerd water per wasbeurt, waardoor het oppervlak na de tweede wasbeurt met perslucht wordt droogt.

Om atomaire krachtmicroscoopbeelden van de oneindige DNA-roosters in de lucht te verkrijgen, opent u de tikmodus in de beeldsoftware en stelt u de scangrootte in op 0,5 tot vijf micrometer, de scanresolutie op 512-lijnen en de scansnelheid tussen één tot 3,5 Hertz. Scan vervolgens het micaoppervlak met driehoekige atoomkrachtmicroscoopsondes. Voor eindige DNA roosters imaging, klampen uit een verse laag van mica, zoals aangetoond, en deponeren 80 microliters van een vouw Tris acetaat EDTA magnesium buffer op de schone mica oppervlak.

Voeg vervolgens vijf microliter eindige monsters toe aan de buffer en laat de DNA-roosters twee minuten opnemen op het mica-oppervlak, voordat u nog eens 50 microliters tris-acetaat EDTA magnesiumbuffer aan de sonde toevoegt. Stel vervolgens de scangrootte in op 0,5 op één micrometer, de scanresolutie op 256 lijnen en de scansnelheid op 1,5 Hertz, voordat u het oppervlak scant met de driehoekige sondes, zoals aangetoond. Het cirkelvormige DNA beweegt iets langzamer dan het voorloper lineair DNA in de denatureringsPAGINA, omdat de porie in het cirkelvormige DNA wordt gepenetreerd en vertraagd door de gelvezels.

De ronde 64 nucleotide assemblage families hebben slechts een duidelijke en schone band voor elke assemblage, bevestiging van de stabiliteit van hun monomeer motieven. De cirkelvormige 84 nucleotide assemblage families van tegels, echter, hebben uitstrijkjes rond hun belangrijkste banden, die de aanwezigheid van kleine bijproducten aangeeft. Ongeacht de minor door producten van onjuiste medewerkers, kunnen uitstekende roosters met hoge opbrengsten worden samengesteld uit de doelmonomeermotieven.

Elke assemblage heeft zijn eigen morfologische kenmerken in de micrometer schaal, zoals nanodraden, nanobuisjes, nanospiralen, nanoribbons, en nanorectangles. Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om te voorkomen dat, met name, vuil verontreiniging tijdens of uit de stappen. Na de ontwikkeling, deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoek op het gebied van DNA nanotechnologie om nieuwe familieleden van een aantal meer circulaire DNA nanotechnologie te verkennen.