Name: Een onpartijdige benadering van bemonstering TEM secties in de neurowetenschappen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Leer een onpartijdige TEM-bemonsteringsmethode voor hersenweefselanalyse in de neurowetenschappen. Deze techniek automatiseert elektronenmicroscopie met minimale gebruikersinterventie voor kwantitatieve synapsmetingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gefinancierd door de Oostenrijkse wetenschap Fonds, FWF, projectnummer P 29370 B27

<ol><li>Howard, V., Reed, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoward%2C+V+%22Unbiased+Stereology%3A+Three-Dimensional+Measurement+in+Microscopy%22">Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy</a>. , BIOS Scientific Publishers. Oxford. (1998).</li>
<li>Nakamura, H., Kobayashi, S., Ohashi, Y., Ando, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-changes+of+brain+synapses+and+synaptic+plasticity+in+response+to+an+enriched+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Age-changes of brain synapses and synaptic plasticity in response to an enriched environment.</a> Journal of Neuroscience Research. 56 (3), 307-315 (1999).</li>
<li>Landers, M. S., Knott, G. W., Lipp, H. P., Poletaeva, I., Welker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+formation+in+adult+barrel+cortex+following+naturalistic+environmental+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synapse formation in adult barrel cortex following naturalistic environmental enrichment.</a> Neuroscience. 199, 143-152 (2011).</li>
<li>Reichmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+unbiased+counting+method+for+the+quantification+of+synapses+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel unbiased counting method for the quantification of synapses in the mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 240, 13-21 (2015).</li>
<li>Reichmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+enrichment+induces+behavioural+disturbances+in+neuropeptide+Y+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Report%22%5BJournal%5D)">Environmental enrichment induces behavioural disturbances in neuropeptide Y knockout mice.</a> Scientific Report. 6, 28182(2016).</li>
<li>Mayhew, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+Tissue+Samples+from+the+Placenta%3A+An+Illustration+of+Principles+and+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Taking Tissue Samples from the Placenta: An Illustration of Principles and Strategies.</a> Placenta. 29, 1-14 (2008).</li>
<li>Ferguson, S., Steyer, A. M., Mayhew, T. M., Schwab, Y., Lucocq, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Golgi+structure+using+EM%3A+combing+volume-SEM+and+stereology+for+higher+throughput%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying Golgi structure using EM: combing volume-SEM and stereology for higher throughput.</a> Histochemistry and Cell Biology. 147, 653-669 (2017).</li>
<li>Sterio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unbiased+estimation+of+number+and+sizes+of+arbitrary+particles+using+the+disector%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector.</a> Journal of Microscopy. 134 (2), 127-136 (1984).</li>
<li>Gundersen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+stereological+tools%3A+disector%2C+fractionator%2C+nucleator+and+point+sampled+intercepts+and+their+use+in+pathological+research+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis.</a> APMIS. 96 (10), 857-881 (1988).</li>
<li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+KBJ+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Elsevier/Academic Press. (2008).</li>
<li>Lewis, P. R., Knight, D. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLewis%2C+PR+%22Staining+Methods+for+Sectioned+Material%22">Staining Methods for Sectioned Material</a>. , Elsevier/North-Holland Biomedical Press. (1988).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> J Struct Biol. 152 (1), can be downloaded from http://bio3d.colorado.edu/SerialEM 36-51 (2005).</li>
<li>Rampon, C., Tang, Y. P., Goodhouse, J., Shimizu, E., Kyin, M., Tsien, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+induces+structural+changes+and+recovery+from+nonspatial+memory+deficits+in+CA1+NMDAR1-knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enrichment induces structural changes and recovery from nonspatial memory deficits in CA1 NMDAR1-knockout mice.</a> Nature Neuroscience. 3 (3), 238-244 (2000).</li>
<li>Xu, X., Ye, L., Ruan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+enrichment+induces+synaptic+structural+modification+after+transient+focal+cerebral+ischemia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Environmental enrichment induces synaptic structural modification after transient focal cerebral ischemia in rats.</a> Experimental Biology and Medicine. 234 (3), 296-305 (2009).</li>
<li>Lonetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+environmental+enrichment+moderates+the+behavioral+and+synaptic+phenotype+of+MeCP2+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Early environmental enrichment moderates the behavioral and synaptic phenotype of MeCP2 null mice.</a> Biological Psychiatry. 67 (7), 657-665 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier gepresenteerde werkstroom kan de onderzoeker om gegevens over ultrastructurele kenmerken op onpartijdige wijze. Dit is veel minder tijdrovend dan volume onderzoeken van seriële secties. Verschillende toepassingen worden gebruikt om dit doel te bereiken. In eerste instantie onze op maat gemaakte RPS -software (voor gegevens over de beschikbaarheid, neem contact op met de overeenkomstige auteur), wordt gebruikt om een willekeurige fase-verschuiving Schakel de bemonstering gebied coördinaten. Hierdoor is een systematische uniforme aselecte steekproef van de ROI. Vervolgens voor het tellen van specifieke structuren, aangepast we de disector methode, waar 2 opeenvolgende secties met bekende afstand worden vergeleken, in een nieuwe manier in vergelijking met eerdere studies13,14,15 , zoals we plachten onze op maat gemaakte RPS software voor systematische uniforme steekproeven. Dit bespaart tijd in vergelijking met 3D-reconstructie van gehele volumes van seriële secties. De op maat gemaakte RPS-software is speciaal ontwikkeld voor een bepaald type van Microscoop die een beperkende factor is voor het reproduceren van de werkstroom. Een alternatief van deze specifieke software zou een toepassing waarmee scripts en is compatibel met andere Microscoop modellen.
Wij met succes gebruikt deze aanpak voor onze vergelijkende studies4,5. Op uiterst dunne secties van neuronale weefsel, de interessegebied werd geschetst en beelden werden genomen door systematische uniforme steekproeven binnen dit gebied. Het dient te worden opgemerkt dat het gebied van belang, de polymorf laag van het getand gyrus, een vrij klein gebied is te onderzoeken die wellicht nuttig zijn voor onze aanpak. Binnen een willekeurig geplaatste disector, we het aantal DCV geëvalueerd en diverse ultrastructurele kenmerken van synapsen in de DGpl van volwassen muizen gehuisvest in SE en EE evenals volwassen WT muizen versus volwassen NPY knock-out muizen. Met behulp van onze aanpak, de verzamelde data toonde veranderingen in een aantal van de onderzochte parameters. Deze bevindingen bevestigd die van andere soortgelijke studies in jonge dieren2.
Een nadeel van het experimentele gebruik van deze werkstroom kan worden dat deze multi-application-aanpak niet ideaal in termen van gebruiksgemak, is als de gebruikers nodig hebt om comfortabel met verschillende user-interfaces (in ons geval, de gebruikersinterface, TEM seriële sectie de RPS software en SerialEM software). Leren omgaan met alle toepassingen op een efficiënte manier is tijdrovend en rekening moet worden gehouden. Investeren de tijd in het leren gebruiken van deze workflow is echter nog steeds duidelijk gunstige na verloop van de tijd die nodig is voor het analyseren van gehele volumes met seriële sectie TEM. De methode van het gebruik van een disector geplaatst door systematische uniforme aselecte steekproef op het gebied van belang is voldoende om te presenteren betrouwbare gegevens1 zonder de noodzaak te onderzoeken van een hoog bedrag van secties/volume.
Maximaliseren van de uitkomst in onze studies, was het essentieel voor de goede zorgen tijdens de bereiding van de monsters, zoals het behoud van het weefsel en de structuren niet alleen cruciaal is voor de evaluatie van de structurele kenmerken, maar ook voor het terrein van belang ondubbelzinnig te identificeren. Een cruciale factor, en misschien een ander nadeel van deze methode is dat een hoge kwaliteit van de ultra-dunne secties paren vereist: moeten er geen gaten of rimpels die betrekking hebben op het gebied onder onderzoek in een van de secties en de dikte van de sectie moet worden homogene gehandhaafd. De onderzoeker moet goed opgeleide in ultramicrotomie. Zorg moet ook worden genomen bij de beeldvorming van de secties in de TEM, zoals de secties gevoelig voor electron beam schade zijn en kunnen gemakkelijk uit elkaar scheuren. Bovendien is het belangrijk om te kiezen van het juiste aantal bemonstering gebieden in de ROI. Afhankelijk van de experimentele doel moet de vergroting van de electron microfoto zorgvuldig worden ingesteld. Voor onze experimenten specifiek, zijn tellen synapsen in het centrale zenuwstelsel, 20 regio's van de rente over een sectie met de oppervlakte van 30.25 µm2 optimaal. Het is aangeraden om het personeel goed in het herkennen van de functies in kwestie (in ons geval synapsen, synaptic functies en DCV) om betrouwbare resultaten te trainen. Teneinde de synapsen, de synaptische vesikels herkenbaar moeten zijn en dit vereist een resolutie van minstens 10 nm. Hiervoor een vergroting van 5000 X was optimaal, maar er moet worden opgemerkt dat de vergroting hangt af van hardware parameters zoals het type en de positie van de camera's en moeten zou worden aangepast voor andersoortige Microscoop en/of camera. Het heeft ook te worden opgemerkt dat het protocol toepassingen specifiek voor één TEM gebruikt en dat gebruikers met andere modellen moeten overwegen de verschillen in de instellingen.
Wij geloven dat onze workflow kan aangepast worden voor vele andere toepassingen niet alleen in de neurowetenschappen, maar op een breed gebied van biologische wetenschappen en ook Materiaalkunde (wanneer de hoge resolutie van een TEM nodig is) wanneer de onderzoeksvraag vraagt om een systematische uniform steekproeven en de hoeveelheid monsters worden onderzocht vraagt om een tijd-efficiënte manier van analyse. Bijvoorbeeld, zijn wij momenteel ook geïnteresseerd bij het lokaliseren van ijzer winkels in de menselijke hersenen. Hiervoor hebben wij onlangs onze workflow, zodat de elementaire analyse op uiterst dunne secties op willekeurig gekozen gebieden aangepast. Oog op het minimaliseren van het aantal toepassingen die nodig zijn voor de workflow, we gericht toe te passen met behulp van de SerialEM software alleen, omdat het kan worden geprogrammeerd voor het verplaatsen van het werkgebied om vooraf punten die kunnen worden geselecteerd in een willekeurige mode. We aangepaste scripts om te controleren de TEM, met als doel de workflow volledig automatizing gemaakt. Dit bleek mogelijk met uitzondering van de autofocus in gefilterde imaging modus, die deed geen bevredigende resultaten opleveren. We gebruikten dus DM software voor scherpstellen en voor het verkrijgen van de energie-gefilterd beelden.
Kortom presenteren we software-oplossingen die helpen bij het verkrijgen van electron microfoto op een onpartijdige manier.

In elektronenmicroscopie is het vaak uitdagend om te proeven van de representatieve regio's binnen de secties. Wij, zijn als waarnemer vaak bevooroordeeld om te kijken naar specifieke regio's die onder onze aandacht gebracht door opvallende kenmerken van het monster, een goed gedistribueerd, onbevooroordeelde bemonstering voorkomen. Bemonstering van vooringenomenheid kan alleen voorkomen worden als elk deel van de regio van belang dezelfde kans krijgt terecht te komen in een elektron opname1. Het is mogelijk om te voorkomen dat bemonstering bias zonder een softwareoplossing, bijvoorbeeld door te drukken op de trackball van de Microscoop handmatig zonder te kijken naar de afbeelding, zodat het selecteren van bemonstering regio's waar de fase stopt. Maar strikt genomen is dit niet een willekeurige procedure, omdat, bewust of onbewust, de gebruiker kan een invloed hebben op het verkeer van het podium, en, bovendien, dit is niet een verfijnde manier van de selectie van de bemonstering regio's. Aselecte steekproef wordt met name belangrijk als paren van secties worden gebruikt voor het beoordelen van het aantal structuren in een bepaald volume, bijvoorbeeld voor stereology1, waarvoor paren van secties, een bekende afstand van elkaar. Het zou ook mogelijk alleen kijken met een enkele sectie en het aantal specifieke structuren2schatten, maar met deze aanpak onderzoekers hebben de neiging te overschatten van de numerieke dichtheid van grotere structuren, tenzij de structuren zeer klein zijn vergelijking met de dikte van de sectie. Alternatieve benaderingen zijn het reconstrueren van de volumes van weefsel van seriële secties en dus krijgt de gewenste gegevens3. Maar dit is zeer tijdrovend en niet een haalbare aanpak voor (grotere) vergelijkende studies.
Om deze problemen te overwinnen, hebben wij een workflow waarmee de onderzoeker om automatisch te selecteren monsters voor het verkrijgen van electron microfoto op regelmatige afstand binnen uiterst dunne secties ontwikkeld. De positie van de electron microfoto is willekeurig, waardoor onbevooroordeelde bemonstering. De aanpak is geschikt zowel voor het bepalen van de numerieke dichtheden van structuren (bijvoorbeeld synapsen binnen een bepaalde neuropil volume4,5), en de afmetingen van structurele kenmerken (bijvoorbeeld de breedte van de synaptische gespleten, of de diameter van het postsynaptisch dichtheid4,-5).
De werkstroom gebruikt een op maat gemaakte willekeurig punt bemonstering (RPS) software (geschreven in de Java-script met behulp van Scripting software geleverd met onze Microscoop) die automatisch grid posities binnen een vooraf gedefinieerde regio van belang in een ultra-dunne sectie berekent. De RPS-software wordt het stadium van de elektronenmicroscoop verplaatst naar deze vooraf gedefinieerde punten, zodat een elektron opname kan worden gemaakt op elk punt. De gebruiker definieert eerst, een regio van belang binnen de dunne sectie. Vervolgens berekent de RPS software grid posities binnen deze regio. De x / y-coördinaten van het eerste standpunt willekeurig worden gemaakt, en de resterende posities worden aan regelmatige raster intervallen met betrekking tot de eerste positie geplaatst. Omdat elk deel van de regio van belang dezelfde kans heeft van onderzocht, hierdoor minimale gegevensverzameling. Deze aanpak van de bemonstering heet ook systematische uniforme aselecte steekproef (zie referenties6,,7 voor meer details).
Voor het bepalen van de numerieke dichtheden van structuren, werken wij met paren van secties die een bekende afstand van elkaar. Na het verkrijgen van de opname van een elektron uit het eerste gedeelte in een van de vooraf bepaalde posities, verhuist TEM seriële sectie software (onderdeel van het softwarepakket geleverd met onze elektronenmicroscoop) naar de overeenkomstige punt in de tweede sectie, ter de opname van een elektron van de bijbehorende locatie te verkrijgen. Dit wordt herhaald voor elke locatie in het vooraf vastgestelde rooster. In onze aanpak, wordt een disector gebruikt om het aantal deeltjes in elk paar van electron microfoto8,9te tellen. Een disector bestaat uit een paar counting frames, één voor elke sectie8,9. De numerieke dichtheid van objecten wordt bepaald door alleen tellen objecten zichtbaar op de eerste sectie (of naslaggedeelte) maar niet op de tweede sectie (of opzoeken sectie). Hierdoor te schatten van de numerieke dichtheden van objecten in een snelle en efficiënte manier8,9. Bovendien op enkele secties, kunnen twee-dimensionale structurele kenmerken worden gemeten.
Wij hebben deze werkstroom met succes om te beoordelen van de verschillen in aantallen van de synaps in de hippocampus van muizen blootgesteld aan verrijkte omgeving (EE) woonomstandigheden in vergelijking met standaard omgeving (SE) huisvesting voorwaarden4,5, toegepast en ook om te evalueren van de ultrastructurele verschillen tussen wild type (WT) muizen en neuropeptide Y (NPY) KO muizen onder SE en EE5gehouden. Ons doel was om te kijken specifiek structurele kenmerken van neuronen, zoals de numerieke synaptic dichtheid, de lengtes van de actieve zone in dwarsdoorsneden en het postsynaptisch dichtheid, de breedte van de synaptische gespleten, en het aantal synaptische vesikels, teneinde veranderingen in neuronal connectiviteit en activering tussen de verschillende experimentele omstandigheden. Bovendien, waren we geïnteresseerd in de numerieke dichtheid van dichte-core blaasjes (DCV) in neuronen te bepalen van de hoeveelheid opgeslagen neuropeptides in een bepaald gebied van de hersenen.
Op basis van het succes van onze aanpak voor de studies die hierboven beschreven, in onze volgende stap, we hebben het aangepast van onze workflow Schakel gebieden voor onbevooroordeelde elemental analyses binnen de menselijke hersenen monsters. Dit werd gedaan om de afbeelding ijzer, dat is opgeslagen in de Ferritine moleculen in zowel zenuwcellen en gliacellen. Hiervoor samengesteld we een script dat ons voor het automatiseren van de meeste bewerkingen voor een willekeurige screening van hersenen secties in een bepaald gebied toegestaan.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital</td><td>SigmaAldrich</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Merck</td><td>1040051000</td><td>1kg</td></tr><tr><td>Glutardialdehyde</td><td>Science Services</td><td>E 16210</td><td>25%; 100ml; EM grade</td></tr><tr><td>cacodylate buffer</td><td>Merck</td><td>C4945</td><td>250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate</td></tr><tr><td>Thionine acetate/Ceristain</td><td>Merck</td><td>861340</td><td></td></tr><tr><td>azijnzuur</td><td>Merck</td><td>1000631000</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Merck</td><td>1064951000</td><td>1 kg, pellets</td></tr><tr><td>osmium tetraoxide</td><td>Science Services</td><td>E 19110</td><td>10x1g</td></tr><tr><td>TAAB inbeddingshars</td><td>Science Services</td><td>TAT001</td><td>500g</td></tr><tr><td>DMP-30</td><td>Science Services</td><td>TAD024</td><td>100g</td></tr><tr><td>DDSA</td><td>Science Services</td><td>TAD025</td><td>500g</td></tr><tr><td>Uranyl acetate dihydrate</td><td>Plano GmbH</td><td>19481</td><td>depleted, 25g</td></tr><tr><td>Ultrastain 2</td><td>Leica</td><td>16707235</td><td>Lead citrate</td></tr><tr><td>Toluidine blauw oplossing</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1727</td><td>10g</td></tr><tr><td>Pioloform</td><td>Plano GmbH</td><td>R1275</td><td>10g Poeder</td></tr><tr><td>Proylenoxide</td><td>SigmaAldrich</td><td>82320-1L</td><td>1L</td></tr><tr><td>DPX inbeddingsmedium</td><td>Plano GmbH</td><td>R1320</td><td>inbeddingsmedium voor semi-dunne secties op glasslide, 50 ml</td></tr><tr><td>Vibratome, Leica VT 1000</td><td>Leica Microsystems, Wenen, Oostenrijk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Ultracut UCT, ultramicrotoom</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai G2 20</td><td>FEI,Eindhoven, Nederland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Megaview wide angle camera</td><td>Olympus Soft Imaging Solution, Münster, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>US 1000 digitale camera</td><td>Gatan, Pleasanton, VS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM Beeldanalyse Software</td><td>FEI,Eindhoven, Nederland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FEI Serieel Sectie Software</td><td>FEI,Eindhoven, Nederland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji, ImageJ 1.52e</td><td>National Institute of Health, VS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPSS 20.0</td><td>SPSS Inc., Chicago, IL, VS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SerialEM</td><td>Regents of the University of Colorado</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPS (willekeurig punten steekproef) software 0.9a</td><td>op maat gemaakt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disector v1.0.2 (ImageJ macro)</td><td>op maat gemaakt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EFTEMSerialEM (SerialEM script)</td><td>op maat gemaakt</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een onpartijdige benadering van bemonstering tem secties in de neurowetenschappen

An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience

Onderzoeken van de ultrastructurele kenmerken van neuronen en hun synapsen zijn alleen mogelijk met elektronenmicroscopie. Vooral voor vergelijkende studies van de veranderingen in dichtheid en distributies van dergelijke functies is een onbevooroordeelde bemonstering protocol essentieel voor betrouwbare resultaten. Hier presenteren we een workflow voor het image aquisition van monsters van de hersenen. De werkstroom kunt systematische uniforme steekproeven binnen een gedefinieerde hersenen-regio, en de beelden kunnen worden geanalyseerd met behulp van een disector. Deze techniek is veel sneller dan uitgebreid onderzoek van seriële secties, maar nog steeds presenteert een haalbare aanpak voor het inschatten van de dichtheden en distributies van ultrastructuur functies. Voor het insluiten, werden gekleurd vibratome secties gebruikt als een verwijzing te identificeren van de regio van de hersenen onderzocht, welke geholpen versnellen de algehele specimen voorbereiding verwerken. Deze aanpak werd gebruikt voor vergelijkende studies onderzoeken van het effect van een verrijkt-huisvesting-omgeving op verschillende ultrastructurele parameters in de hersenen van de muis. Op basis van het succesvolle gebruik van de werkstroom, wij het aangepast met het oog op elementaire analyse van monsters van de hersenen. We geoptimaliseerd het protocol in termen van de tijd van de interactie van de gebruiker. Alle tijdrovende stappen automatiseren door het opstellen van een script voor de open sourcesoftware SerialEM helpt de gebruiker om zich te concentreren op het hoofdwerk van het verwerven van de elemental kaarten. Net als in de oorspronkelijke workflow besteed we aandacht aan de onbevooroordeelde bemonstering aanpak garanderen van betrouwbare resultaten.

Hier beschrijven we een werkstroom om de gebieden te selecteren bij TEM in een automatische en onpartijdige manier. De gebruiker selecteert de interessegebied binnen een ultra-dunne gedeelte onder de TEM en maakt gebruik van verschillende softwareoplossingen voor de werkstroom met inbegrip van onze RPS -software die automatisch de coördinaten van 20 bemonstering gebieden binnen het gebied van berekent belang. Vervolgens wordt de TEM-fase verplaatst naar elk gebied van bemonstering voor fotografie. Dit kan zowel voor het analyseren van enkele secties en voor het analyseren van paren van secties, een bekende afstand van elkaar, waardoor de selectie van gebieden voor imaging zonder de vooringenomenheid van de onderzoeker.
Deze werkstroom bleek waardevol wanneer ultrastructurele functies in muis hersenen secties4,5te documenteren. In deze studies, werd de polymorf cellaag van de getand gyrus (DGpl) onderzocht als een gebied van belang. Onze methode bleek geschikt voor de behandeling van de DG, omdat een coronale deel van de dorsale DG (Bregma −1.3) in een ultra-dunne sectie past en haar contouren zijn gemakkelijk herkend bij lage vergroting. Als andere hersengebieden worden onderzocht moesten, zou het belangrijk om te controleren hun grootte en bijzondere kenmerken voor de planning van de experimenten.
De workflow die hier worden beschreven toe te passen bleek dat EE huisvesting de breedte van de synaptische gespleten aanzienlijk in de DGpl4, met betrekking tot standaard woonomstandigheden verhoogt. Bovendien was het aantal dichte kern blaasjes aanzienlijk gedaald in de EE-gehuisvest dieren4, met vermelding van de wijzigingen in het huishouden van neuropeptides. Wanneer WT en NPY knock-out muizen werden gehouden onder omstandigheden van EE, verhoogd het aantal neuronen/µm³ in de DGpl terwijl de dichtheid van DCV met betrekking tot SE-huisvesting5 daalde. In tegenstelling, resulteerde NPY uitnemen in een aanzienlijke stijging van synaptische vesikels in de reserve pool (losgekoppelde synaptische vesikels) onafhankelijk van de huisvesting van voorwaarden5. Het effect van EE op de breedte van de synaptische gespleten werd omgekeerd in de NPY KO groep wat resulteert in een significant verschil tussen EE-gehuisvest WT en NPY KO muizen5. Samen met behavioral studies van WT en NPY knock-out dieren gehouden onder beide soorten huisvesting, dit geeft een cruciale rol van NPY voor de neurobiologische gevolgen van EE5.
Voor het visualiseren van het ijzer opgeslagen in het menselijk brein, werd een script samengesteld voor SerialEM software willekeurig kiezen de punten van de acquisitie van binnen een hele uiterst dunne sectie, met als doel een energiestelsels gefilterd electron opname op elk van deze punten . Het script uitgevoerd nadat de sectie in de elektronenmicroscoop is geladen, de stabilisatie van de sectie (dwz., de 'specimen-koken' routine) 's nachts. Het script vervolgens willekeurig geselecteerd uit een aantal punten die vooraf door de gebruiker van die voorzien van een rooster in Figuur 3. Door de productie van een test-opname en controleren van de grijsniveaus, het script gecontroleerd als de gekozen punten werden gevestigd op een zichtbare gedeelte van de sectie, afwijzing van de punten die op raster bars landde. De meeste van de workflow werd behandeld door het script met minimale interactie van de gebruiker. Het was echter niet mogelijk om te registreren automatisch energie gefilterd microfoto (met deze setup), omdat er te weinig licht voor de autofocus routine van SerialEM. Dus overstapten we op DM software zodra het script had het werkgebied verplaatst naar elk punt, de focus met de hand aangepast, en maakte een EFTEM beeld van ijzer. Een voorbeeld voor een afbeelding van de ijzeren EFTEM van post mortem menselijk brein is weergegeven in Figuur 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig1.jpg"> Figuur 1. Afbeelding van de werkstroom. (A) de belangrijkste stappen van de bereiding van de monsters worden weergegeven (in de richting van de pijl): vibratome secties (i), embedding(ii), semi-dun en ultra-dunne secties (iii) knippen en vangen van paren van uiterst dunne secties op koperen roosters (iv). (B) gebruik van zowel de software en de software van op maat gemaakte RPS van de leverancier van de Microscoop bemonstering gebied coördinaten die bepalend zijn voor de opname-sites maken. De hoekpunten van de secties worden opgeslagen in de software van de microscopie en de ROI is geschetst (aangeduid met behulp van de semi-dunne secties) (i); een raster van bemonstering gebieden wordt gegenereerd over de ROI, een willekeurige verschuiving (rode pijl) is geïntroduceerd in x en y. De verschuiving is kleiner dan de afstand tussen de gebieden van de bemonstering, (zwarte pijlen), zodat in plaats van de zwarte vierkantjes, die geen verschuiving hebben, de blauwe vierkantjes, die willekeurig worden verschoven, worden gebruikt om te bepalen de opname sites (ii); alleen bemonstering gebieden binnen de grenzen van de ROI (getekend als zwarte en blauwe vierkantjes) worden gebruikt voor de opname. Microfoto bestaan zowel in de bijbehorende locaties in de sectie opzoeken (blauwe vierkantjes) in de sectie van de reference (zwarte vierkantjes) (iii). (C) een opname wordt gemaakt op elk gebied van bemonstering bij een voldoende vergroting; een bestaande uit verschillende samengevoegde afbeeldingen montage geschiedt indien nodig (in dit geval, 2 x 2 beelden waren samengevoegd) (i); een frame counting is gegenereerd en weergegeven als een overlay in het beeld, structuren binnen het frame en op de 'aanvaarding lijnen' (onderbroken frame lijnen) zal worden geteld, maar niet die op de 'verboden lijnen' (solide frame lijnen) (ii). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig2.jpg"> Figuur 2 . Het meten van ultrastructurele parameters op een paar uiterst dunne secties met een onbevooroordeelde counting frame. (A) overzicht van de Vensters van de ImageJ gebruikt voor het tellen en analyseren van cellulaire structuren. Linkerzijde toont het elektron-opname met de counting frame als een overlay. Aan de rechterkant: de ImageJ user interface (blauwe rechthoek) met het drop-down menu (boven) en de werkbalk (zie hieronder); de object-editor ObjectJ (groene rechthoek); het scherm (oranje rechthoek) van de ObjectJ extra waar de instrumenten voor het meten van kunnen worden geselecteerd en het venster met resultaten van de ObjectJ (zwarte rechthoek) waar alle metingen zijn gedocumenteerd. (B) Detail van het een het tonen van de gemarkeerde synapsen op de opname van de elektron (synapsen op beide afdelingen - pijlen; synapse alleen op de lookup sectie-pijlpunten). Die zijn gemarkeerd met het Multipoint-gereedschap (rode cirkel) vanaf de werkbalk in ImageJ. (C) de namen en meten parameters van de synaptische functies worden gedefinieerd met behulp van de Tools van ObjectJ. Het Marker-Tool en de functie van belang zijn geselecteerd en de omtrek die in de afbeelding links-muis-kliks langs de structuur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig3.jpg"> Figuur 3. Bemonstering van gebieden voor elementaire toewijzing binnen een ROI voor energie gefilterd transmissie-elektronenmicroscopie selecteren. SerialEM wordt gebruikt om een gebied van belang te selecteren en voor te stellen een groot aantal gebieden van de bemonstering op een regelmatige afstand (roze kruisen in de beelden A en B). Een script selecteert vervolgens willekeurig bemonstering gebieden (van deze vooraf gedefinieerde coördinaten) voor overname. Bemonstering gebieden met slechte verlichting worden verworpen om te voorkomen dat raster bars en het script stopt zodra 20 goed verlichte bemonstering gebieden zijn geselecteerd binnen de ROI. (A) overzicht van het hele gebied van belang, geschetst door een veelhoek, met een groot aantal mogelijke bemonstering gebieden gemarkeerd met X. (B) Detail van A tonen de bemonstering gebieden voor willekeurige selectie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig4.jpg"> Figuur 4. Voorbeeld van de verwerving van de elementaire kaart (EFTEM). (A) helder veld TEM-opname van gebied rond overname punt. Een willekeurig geselecteerd gebied werd gebruikt voor het verkrijgen van een elementaire kaart en wordt gekenmerkt door een zwarte rechthoek. (B) de EFTEM vooraf kant venster afbeelding gemaakt in de willekeurig geselecteerde gebied. (C) EFTEM de post kant venster afbeelding gemaakt op hetzelfde gebied. (D) elementaire kaart van ijzer van hetzelfde gebied (M-edge). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

We introduceren een nieuwe workflow voor elektronenmicroscopie onderzoek van hersenweefsel. De methode kan de gebruiker te onderzoeken van neuronale functies op onpartijdige wijze. Voor elementair-analyse presenteren wij ook een script dat de meeste van de workflow voor gerandomiseerde steekproeven automatizes.

Een onpartijdige benadering van bemonstering TEM secties in de neurowetenschappen

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative ...

Een onpartijdig bemonsteringsprotocol is van vitaal belang voor elektronenmicroscopie. Als u wilt kwantificeren op numerieke dichtheid van synapsen of andere structuren in een bepaald hersengebied, het belangrijkste voordeel van onze techniek is dat het onbevooroordeeld is, en maakt het mogelijk om automatisch elektronenmicrografen te produceren met minimale tussenkomst van de gebruiker. Deze techniek is ook waardevol in andere onderzoeksgebieden, zoals neurowetenschappen, waar het kan worden gebruikt bij het beoordelen van de sterkte van een neuraal netwerk.Om ons protocol toe te passen, is het noodzakelijk om ervaring te hebben in elektronenmicroscopische technieken, zoals monstervoorbereiding en het bedienen van een overgangselektronmicroscoop. Het aantonen van onze procedure zal Dr. Stefan Wernitznig zijn, een post-doc van mijn laboratorium. Dit protocol bestaat uit het voorbereiden van hersenmonsters voor elektronenmicroscopie, snijden paren van dunne secties.Vervolgens wordt beschreven hoe u automatisch een bepaald aantal elektronenmicrografen in een gebied van belang produceren. Vervolgens zal het gebruik maken van een tellen frame om de numerieke dichtheid van structurele functies te beoordelen. Om te beginnen ontleden, fixen, repareren en insluiten van voorbeelden van belang in het insluiten van hars door het volgen van het bijbehorende tekstprotocol.Plaats het monster vervolgens op een ultramicrotome en produceer 55 nanometer ultradunne seriële secties. Plaats de secties op een sleuf raster met de afmetingen van een millimeter bij twee millimeter, bekleed met piola vorm. Dan, counterstain de ultra dunne secties op de sleuf roosters met behulp van 2%uranyl acetaat gedurende 30 minuten, gevolgd door lood citraat gedurende 30 seconden op kamertemperatuur.Plaats het raster in de TEM en bekijk de secties op het raster met de TEM met behulp van een lage vergroting om de kwaliteit van de secties te oriënteren en te evalueren. Start vervolgens de TEM-seriesectiesoftware, selecteer Sectie en kies Invoegen om de hoekpunten voor de sectie referentie- en opzoeksectie toe te voegen. Volg de instructies van het pop-upvenster.Begin met de referentiesectie en ga vervolgens verder met de opzoeksectie. Zorg ervoor dat de randen van de sectie parallel zijn aan de volgende sectie, omdat de punten één en twee worden ingevoerd. Visualiseer vervolgens de referentiesectie onder lage vergroting om het interessegebied te identificeren.Verplaats de microscoopfase met behulp van TEM-beeldanalyse op de referentiesectie naar meerdere hoekpunten van de ROI om een overzicht van de ROI te maken. Neem de coördinaten van de resulterende veelhoek op met behulp van Random Point Sampling-software. Druk hiervoor op Coördinaten toevoegen in het dialoogvenster van de Random Point Sampling-software op elk punt van de veelhoek dat nodig is om de ROI in de sectie te schetsen.Definieer en voer vervolgens een geschikte grootte in voor de bemonsteringsgebieden en afstanden tussen de gebieden in de Random Point Sampling-software. Druk vervolgens op Raster berekenen om coördinaten te genereren op een systematische, uniforme, willekeurige manier voor de posities van de micrograaf binnen de veelhoek. Sla de bemonsteringspunten op de referentie- en opzoeksecties op met behulp van de Random Point Sampling-software en de TEM-seriesectiesoftware.Dit zijn de coördinaten van de montages die achteraf worden geregistreerd. Druk in de Random Point Sampling-software op de volgende positie om de microscoopfase naar de x- en y-coördinaten van elk bemonsteringsgebied in de referentiesectie te verplaatsen. Selecteer vervolgens Locatie en kies Invoegen om deze coördinaten te importeren in de TEM-seriesectiesoftware in de referentiesectie.Herhaal dit voor alle coördinaten. Als u de coördinaten van de referentiesectie wilt spiegelen op de opzoeksectie, selecteert u Sectie en kiest u Ga naar sectie. Voer het nummer van de opzoeksectie in het dialoogvenster in.Voor de registratie van de montages schakelt u tussen de referentie- en opzoeksectie, zoals eerder beschreven, en wijzigt u de positie op de referentiesectie met locatie en gaat u naar het nummer. Kies de volgende coördinaat in het dialoogvenster. Voor de SerialEM-montages gaat u bij elke sampling-coördinaat naar Bestand en kies nieuwe montage in het vervolgkeuzemenu.Selecteer het juiste aantal tegels en het percentage overlappingen in het dialoogvenster. Voor deze studie is een vergroting van 5000 voldoende om de synaptische kenmerken van de studie te herkennen. Maar het beperkte gezichtsveld van de CCD-camera vereiste het maken van montages van twee door twee beelden.De montages zijn gemaakt naar SerialEM. Voordat u elke montage opneemt, moet u de focus aanpassen of de optie autofocus in de opnamesoftware activeren. Kies de map om het montagebestand op te slaan en start de opname van de montage door op Start in het submenu montage te drukken, aan de linkerkant in SerialEM.Start de microdissector en bepaal de grootte van het telframe en het aantal segmenten indien nodig. Tel de synapsdichtheid met behulp van de dissector macro. Met behulp van de multi-point tool gelegen in de werkbalk, beperken die synapsen die kruisen met de twee verboden lijnen van de dissector, maar tellen synapsen op de tegenovergestelde acceptatie lijnen.Markeer elke synaps binnen het telkader dat zichtbaar is in de referentiesectie, maar niet zichtbaar is in de opzoeksectie, met een ovale selectie. Voor het meten van synapsparameters selecteert u alleen de synapsen met een synaptische gespleten georiënteerd in doorsnede die zich op het referentiegedeelte bevindt. Dit moet binnen dezelfde beeldframes worden gebruikt voor de dissector.Ga vervolgens naar Plug-ins en start vervolgens de plug-in ObjectJ vanuit het vervolgkeuzemenu. Open een nieuw project vanuit het vervolgkeuzedialoogvenster objectJ, waarmee een venster wordt geopend waarmee de gebruiker structuren kan schetsen en markeren met het markeringsgereedschap. Gebruik eerst het markeringsgereedschap om de lengte van het presynaptische membraan en de lengte van de postsynaptische dichtheid te meten door een lijn langs de structuur te tekenen.Verkrijg vervolgens de gemiddelde breedte van de synaptische gespleten door een veelhoek te tekenen, die zowel het pre- als postsynaptische membraan bedekt. Om het aantal gedokte blaasjes te bepalen, telt u alle blaasjes met een maximale afstand tot het presynaptische membraan van één vesiclediameter of minder. Bepaal vervolgens het aantal ongeveerde blaasjes door de blaasjes te tellen met een maximale afstand van één vesiclediameter van aangemeerde of andere ongedockde blaasjes op dezelfde synaps.Een aangepaste versie van het protocol maakt elementaire analyses mogelijk op onbevooroordeelde locaties binnen het ultradunne gedeelte. Start hiervoor in de TEM-beeldmodus SerialEM en open een nieuw project. Open vervolgens de Navigator en controleer de instellingen voor de camera in camera- en scriptbesturingselementen voor weergave en opname en startweergave.Als u een hoekkaart van het ultradunne gedeelte wilt maken, kiest u Punten toevoegen in het venster Navigator. Stel vervolgens de hoekpunten in aan de randen van een ultradun gedeelte. Verplaats het podium naar een hoekpunt door de rechtermuistoets ingedrukt te houden.Wanneer een hoek van de sectie is bereikt, voegt u een hoekpunt toe met een linkermuisklik. Herhaal de procedure om nog drie hoekpunten toe te voegen. Zorg ervoor dat in het navigatorvenster vak C voor hoekpunten is aangevinkt voor de opgeslagen punten.Als u de hoekmontage wilt starten, gaat u naar Navigator in de menubalk SerialEM en kiest u Montaging Grids en Setup Corner Montage in het vervolgkeuzemenu. Kies Veelhoek toevoegen in het venster Navigator en schets het interessegebied met meerdere klikken met de rechtermuisknop. Kies vervolgens Raster van punten toevoegen in het vervolgkeuzemenu Navigator en definieer een afstand tussen de punten.Start het EFTEMSerialEM-script, volg de scriptopdrachten, voer het aantal rasterpunten in zoals weergegeven in de Navigator en voer het aantal acquisitiepunten in. Stel vervolgens de verlichtingsdrempel in, zodat het script rasterbalken kan vermijden. Volg de scriptopdrachten en verplaats het werkgebied handmatig om het gezichtsveld met een kwart van de rasterbalk te bedekken.Voer volgens de weergegeven waarde een drempelwaarde in die hoger is dan de weergegeven waarde. Wacht tot de punten voor de verwerving zijn geselecteerd en de kookroutine is voltooid. Dit duurt lang en kan 's nachts worden gedaan.Nadat u hebt ingesteld voor energiegefilterde TEM-elementaire analyse, verwerft u een elementaire kaart met elementspecifieke instellingen. De onbevooroordeelde bemonsteringsbenadering is nuttig voor het tellen en analyseren van synaptische functies in specifieke hersengebieden. Bovendien, de EFTEMSerialEM script voor de SerialEM software maakt het mogelijk om willekeurig te kiezen van de punten van verwerving uit een hele ultra dunne sectie, met als doel het verkrijgen van een energie-gefilterde elektronenmicrograaf op elk van deze punten.Het script selecteerde willekeurig een aantal punten, vooraf gedefinieerd door de gebruiker uit die gemarkeerd met een indeling. Door het produceren van een testmicrograaf en het controleren van de rangniveaus, controleerde het script of de gekozen punten zich op een zichtbaar deel van de sectie bevonden, waarbij de punten die op rasterbalken zijn geland, werden afgewezen. Het grootste deel van de werkstroom werd behandeld door het script, met minimale interactie van de gebruiker.Echter, met het monster hier getoond, was er te weinig licht voor de autofocus routine van SerialEM. Daarom, zodra het script verplaatst het stadium naar elk punt, de focus werd aangepast en een elementaire kaart werd gemaakt van ijzer. Het is belangrijk om de regio van belang zorgvuldig te selecteren en ervoor te zorgen dat hetzelfde aantal bemonsteringspunten in elk gebied van belang valt.Vergeet niet dat veel van de chemische stoffen die worden gebruikt voor de bereiding van specimen giftig zijn. Dus draag een lab jas en beschermende handschoenen en werk onder een rookhoes.

an-unbiased-approach-of-sampling-tem-sections-in-neuroscience

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Brain bank-en systematische bemonstering van biologisch materiaal vormt de basis voor onpartijdige stereology en maximaliseert de mogelijkheden gegevens van elk exemplaar.

Brain Banking: Het maken van de meeste van uw onderzoek Specimens

De anatomische organisatie van het primaat hersenen kan belangrijke inzichten in normale en pathologische omstandigheden bij de mens. Onpartijdige stereology is een methode voor het nauwkeurig en efficiënt schatting van het totaal aantal neuron (of een ander celtype) in een bepaalde...

Weten wat telt: Unbiased Stereology in de niet-menselijke primaat hersenen

RNA-expressieprofilering van specifieke hersenregio's bij muizen vereist een nauwkeurige en reproduceerbare strategie voor weefselverzameling. Hier wordt een protocol beschreven dat gebruikmaakt van zowel coronale hersensecties als microdissectie met behulp van een weefselpons. De opbrengst en kwaliteit van het totale RNA dat uit de resulterende monsters is verkregen, bevestigen het nut van de beschreven methode.

Niet-Laser Capture Microscopie Aanpak voor de Microdissection van Discrete Mouse Brain Regio&#39;s voor Totaal RNA isolatie en Downstream next-generation sequencing en Gene Expression Profiling

We maken gebruik van magneto-en elektro-encefalografie (MEG / EEG), gecombineerd met anatomische informatie gevangen genomen door magnetische resonantie beeldvorming (MRI), om de dynamiek van het corticale netwerk is verbonden met auditieve aandacht kaart te brengen.

Het in kaart brengen Corticale Dynamics Met Gelijktijdige MEG / EEG en Anatomisch beperkt Minimum-norm Schattingen: een auditieve aandacht Voorbeeld

Dit protocol beschrijft grootschalige reconstructies van selectieve neuronale populaties, het label na retrograde infectie met een gemodificeerde rabiësvirus uiten van fluorescerende markers, en onafhankelijke, onpartijdige cluster analyses waarmee uitgebreide karakterisering van morfologische metrics onder verschillende neuronale subklassen.

Grootschalige Reconstructies en Onafhankelijk, Unbiased Clustering Gebaseerd op morfologische Metrics om neuronen te classificeren in Selective Populaties

Hier presenteren we een stereologische methode, de optische fractionator, gebruikt om de vorming van nieuwe neuronen te kwantificeren, en hun overleving, in de rathippocampus na elektroconvulsieve stimulatie. Bij correcte implementatie zorgt de gevoeligheid en efficiëntie van stereologische methoden voor een nauwkeurige schatting met een vaste en vooraf bepaalde precisie.

De optische fractioneringstechniek om cijfers te berekenen in een ratmodel van elektroconvulsieve therapie

Dit artikel beschrijft een eenvoudige methode ter voorbereiding van kleine dierlijke hersenen van micro-CT beeldvorming, in welke letsels kunnen worden gekwantificeerd en elektroden gelegen met hoge precisie in de context van de hele hersenen.

Een Micro-CT-gebaseerde methode voor het karakteriseren van laesies en vinden van elektroden in kleine dierlijke hersenen

We geven in detail aan hoe we een meta-analyse van op Voxel gebaseerde neuroimaging-onderzoeken kunnen uitvoeren met behulp van op zaad gebaseerde d-mapping met permutatie van Onderwerpafbeeldingen (SDM-PSI).

Meta-analyse van op Voxel gebaseerde neuroimaging-onderzoeken met behulp van op zaad gebaseerde d-mapping met permutatie van Onderwerpafbeeldingen (SDM-PSI)

Hier wordt een stereotactische procedure beschreven die zich kan richten op uitdagende en moeilijk bereikbare hersengebieden (vanwege ruimtelijke beperkingen) met behulp van een schuine coronale benadering. Dit protocol is aanpasbaar aan zowel muis- als rattenmodellen en kan worden toegepast op diverse neurowetenschappelijke toepassingen, waaronder canule-implantatie en micro-injecties van virale constructies.

Aanpasbare schuine stereotactische benadering voor veelzijdige neurowetenschappelijke technieken

We presenteren een hands-on, stap-voor-stap, snel protocol voor het verwijderen en ontleden van discrete gebieden van vers hersenweefsel bij muizen. Het verkrijgen van hersengebieden voor moleculaire analyse is routine geworden in veel neurowetenschappelijke laboratoria. Deze hersengebieden worden onmiddellijk bevroren om transcriptomische gegevens van hoge kwaliteit te verkrijgen voor analyse op systeemniveau.

Microdissectie van muizenhersenen in functioneel en anatomisch verschillende regio's

Het protocol toont herhaalde cerebrospinale vocht- en bloedafname van epileptische ratten die parallel worden uitgevoerd met continue video-elektro-encefalogram (EEG)-monitoring. Deze zijn van groot belang voor het onderzoeken van mogelijke verbanden tussen veranderingen in verschillende lichaamsvloeistofmoleculen en epileptische activiteit.

Bemonstering van hersenvocht en bloed uit laterale staartader bij ratten tijdens EEG-opnames

Leer een onpartijdige TEM-bemonsteringsmethode voor hersenweefselanalyse in de neurowetenschappen. Deze techniek automatiseert elektronenmicroscopie met minimale gebruikersinterventie voor kwantitatieve synapsmetingen.

Een onpartijdige benadering van bemonstering TEM secties in de neurowetenschappen

Meer video's verkennen