Effect van fluorescente proteïnen op Fusion Partners Polyglutamine Toxicity Tests met gist

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van fluorescerende eiwitten, zoals hoe fluorescerende eiwitten hun fusiepartners kunnen beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een snelle en gemakkelijk schaalbare beoordeling biedt van de effecten van de fluorescerende eiwitten en hun fusiepartners. Hoewel deze methode inzicht kan geven in fluorescerend eiwitgedrag, kan het ook worden toegepast op andere genetisch gecodeerde tags.

Ook het aantonen van deze procedure zal Sonja Di Gregorio, die een afgestudeerde student aan de Western University. Elk fluorescerend eiwit dat door deze methode wordt getest, wordt eerst gekloond tot een gistexpressievector die codeert voor een galactose inducose inducerende versie van FLAG-tagged HTT exon een die ofwel de niet-toxische 25Q-herhaling herbergt of de ziekte van Huntington geassocieerde giftige 72Q herhaal. Klonen worden geselecteerd en geverifieerd door sequencing en vervolgens omgezet in gist.

Ter voorbereiding van celculturen voor de verschillende tests, streep de gist klonen die 25Q of 72Q tag met een fluorescentie eiwit van belang op een agar plaat met gist selectie medium met glucose als de koolstofbron. Tegelijkertijd, streep gist die 25Q of 72Q gist geoptimaliseerd monomerische superfolder GFP om te dienen als een positieve controle. Broed de platen twee tot drie dagen op 30 graden Celsius.

Selecteer tot de drie enkele kolonies uit elke plaat en inenting vijf milliliter synthetisch compleet medium aangevuld met 2%-glucose als koolstofbron. Broed de culturen op 30 graden Celsius 's nachts. Breng de volgende dag 200 microliter van elke nachtcultuur over naar een microcentrifugebuis en centrifuge om de cellen te pelleteren.

Was ten minste drie keer met steriel gedestilleerd water. Het is belangrijk om de cellen goed te wassen om alle sporen van glucose te elimineren die kunnen bijdragen aan het onderdrukken van de inductie van de GAL1 promotor. Bereid de cellen zoals eerder aangetoond en opnieuw op te schorten in synthetische volledige medium met 2% galactose als de koolstofbron om de expressie van polyQ fusies induceren.

Als een controle, opnieuw opschorten van de cellen in glucose-bevattende media. Incubeer de cellen op 30 graden Celsius in een buis rotator 's nachts. Meet de volgende ochtend de optische dichtheid op 600 nanometer van elke cultuur met behulp van een spectrofotometer.

Egaliseren van de celdichtheden aan een optische dichtheid 600 van 2 in 100 microliter van synthetisch compleet medium in een steriele 96-put plaat. Bereid vier vijfvoudige verdunningen van elk monster door pipet 20 microliter van het monster uit de vorige put in 80 microliter van de media in de volgende put. Gebruik een gist pinning tool om de cellen ter plaatse op selectieve platen en uitbroeden op 30 graden Celsius gedurende twee dagen.

Beeld de platen met een beelddocumentatieapparaat. Bereid de celculturen voor op deze test en meet vervolgens de OD600 van elke cultuur met behulp van een spectrofotometer. Verdun de cellen tot een OD600 van 1 op 300 microliter media in de 96-put plaat.

Bereid elk monster in drievoud. Incubeer de plaat in een plaatlezer incubator met schudden mogelijkheden. Stel het aantal monsters, de temperatuur op 30 graden Celsius, de absorptie op 600 nanometer, de lengte van de experimenten op 24 uur, en de meetintervallen op 15 minuten.

Selecteer de continue schudmodus. Wanneer het experiment wordt uitgevoerd, maakt u de groeicurve en kwantificeert u het gebied onder de curve met behulp van wetenschappelijke grafische software. Plak de gegevens in een XY-tabel met drie repliceerwaarden.

De groeicurve wordt weergegeven onder de grafiekenmap aan de linkerkant. Als u het gebied onder de curve wilt kwantificeren, selecteert u linksboven analyseren en klikt u op het gebied onder curve in XY-analyses. Begin deze procedure door het verdunnen van de bereide cellen 10-voudig in groeimedium.

Breng 200 microliter van elk monster over naar een acht-well beeldkamer. Beeld de cellen met behulp van een standaard breedveld fluorescerende microscoop. Pas de beeldinstellingen aan voor het verwerven van afbeeldingen.

Aangezien de 72Q aggregaten veel helderder zijn dan het diffuus 25Q-signaal, is het vaak nodig om een andere acquisitie-instelling tussen de verschillende plasmiden te gebruiken om verzadiging van het fluorescerende signaal te voorkomen. Verwerk de afbeeldingen met behulp van een geschikte beeldverwerkingssoftware. In dit protocol wordt dot blot gebruikt om eiwitexpressieniveaus te onderzoeken.

Bereid de buffer voor het genereren van eiwitlysaten door vier micromolar fenylmethylsulfonylfluoride en een proteaseremmercocktail toe te voegen aan de lysebuffer. Pellet vijf milliliter van elke nachtelijke cultuur door centrifugatie. Schort de cellen opnieuw op in 200 microliter glazen kralen en 200 microliter lysebuffers.

Vortex gedurende 30 seconden gedurende 12 ronden, kers tussen de rondes. Centrifuge op 12.000 keer G bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten en verzamel de supernatant. Gebruik een microfiltratieapparaat om gelijke hoeveelheden totaal eiwit op een nitrocellulosemembraan te herkennen.

Maak het membraan voor met PBS en monteer het apparaat. Sluit het aan op een vacuümbron en zorg ervoor dat de schroeven worden aangedraaid. Laad de monsters, zet het vacuüm aan en laat het monster door het membraan filteren door de zwaartekracht.

Dep het membraan in PBS 05%Tween 5%vetvrije melk gedurende 30 minuten. Incubeer het membraan met primaire anti-vlag antilichaam op vier graden Celsius 's nachts. Op de volgende dag, was het membraan drie keer gedurende 10 minuten elk met PBS 05%Tween.

Incubeer het membraan met een fluorescerend gelabeld secundair antilichaam in PBS 05%Tween 5%vetvrije melk bij kamertemperatuur gedurende een uur. Was het membraan drie keer gedurende 10 minuten elk met PBS 05%Tween. Vervolgens, beeld het membraan met behulp van een amino blot documentatiesysteem.

Gist uitdrukken van ofwel 25Q of 72Q HTT exon een gesmolten tot gist geoptimaliseerde monomeerne superfolder GFP of gist geoptimaliseerde monomeere tag BFP2 werd gekweekt in glucose of galactose medium 's nachts en ofwel gespot op agar platen of verder geïncubeerd in vloeibare media. Terwijl 72Q gist geoptimaliseerde monomerische superfolder GFP induceert een aanzienlijke groei defect. 72Q gist geoptimaliseerde monomerieke tag BFP2 toont een groei fenotype vergelijkbaar met de niet-toxische 25Q tegenhangers aangeeft dat de aard van de fluorescerende tag kan belemmeren polyQ expansie gedrag in cellen.

Beoordeling van de aggregatie van de fluorescerende polyQ fusies door fluorescerende microscopie toont aan dat 72Q gist geoptimaliseerde monomerische superfolder GFP significante aggregatie weergeeft, terwijl 72Q gist geoptimaliseerde monomerische tag BFP2 een diffuus cytoplasmatisch signaal toont dat vergelijkbaar is met de niet-giftige 25Q tegenhangers. Aangezien expressieniveaus van de verschillende polyQ-fusies de toxiciteit konden beïnvloeden, werden dot-vlekken uitgevoerd om eiwitniveaus te beoordelen. Resultaten van verdunningen van de cellysaten worden weergegeven.

Vergeet niet dat deze techniek zorgt voor een snelle vergelijking van ongekarakteriseerde en fluorescerende eiwitten met de GFP-varianten, maar het kan oligomerisatie niet direct beoordelen. Na deze procedure kunnen andere maatregelen, bijvoorbeeld, de zweertest in zoogdiercellen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de monomeerende status van de fluorescerende eiwitten.