Identificatie van muis en menselijk antilichaam Repertoires door Next-Generation Sequencing

In deze video beschrijven we een eenvoudige en efficiënte methode om een antilichaamrepertoire op mondiaal niveau te visualiseren en te analyseren. Het is mogelijk om hele B-celrepertoires bij individuen en hun dynamische veranderingen te beschrijven in reactie op immuunstimulatie. Deze methode kan worden toegepast om pathologische monsters van patiënten van opkomende virale infecties te analyseren en om de gegevens te verkrijgen met ongekend inzicht in de pathogenese van de infectie.

Een van de meest opwindende gebieden voor de toepassing is een vaccin controle. De werkzaamheid van vaccins kan worden geëvalueerd door de dynamiek van het wereldwijde antilichaamrepertoire bij vaccinge toegediende personen te analyseren. Het individu is nieuw voor deze methode kan nodig zijn om de PCR-omstandigheden te optimaliseren, omdat de efficiëntie van antilichaam genversterking afhankelijk is van de soorten uitgangsmaterialen.

Fla-cher voor identificatie van immunoglobuline amplicons. Het is belangrijk om deze acties visueel aan te tonen. Het aantonen van de procedure zal Miss Sayuri Yamaguchi en de heer Hanbing Xue, een technicus en afgestudeerde student van mijn laboratorium.

Om deze procedure te beginnen, ontleed het weefsel van een acht weken oude C57 zwarte zes muis en geef het door een roestvrij stalen gaas met twee milliliter PBS om verspreide cellen te verkrijgen. Breng de celsuspensie over op een microcentrifugebuis van twee milliliter en centrifuge bij 600 g en vijf minuten bij vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg en voeg 800 microliters ACK lysing buffer toe aan de pellet.

Broed twee minuten op ijs om de rode bloedcellen in het weefsel te lyse. Vervolgens was de weefselcellen drie keer met behulp van drie milliliter PBS voor elke wasbeurt. Centrifuge opnieuw op 600 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten.

Gooi het supernatant weg en voeg 800 microliters fenol/guanidine isothiocyanaat reagens toe aan de pellet en vortex grondig. Incubeer op 25 graden Celsius gedurende vijf minuten. Voeg vervolgens 200 microliter chloroform toe en schud 15 seconden handmatig.

Incubeer op 25 graden Celsius gedurende twee minuten. Centrifuge bij 12.000 keer g en bij 25 graden Celsius om de fasen te scheiden. Breng de bovenste waterige fase over op een verse buis.

Voeg een volume van 70% ethanol toe. Vortex kort en breng dit mengsel aan op de silica spin kolom. Elute het RNA met 30 tot 100 microliter water.

Gebruik hierna een fluorometer om de initiële RNA-concentratie te kwantificeren. Bewaar het gezuiverde RNA op min 80 graden Celsius. Ten eerste, synthetiseren de eerste streng cDNA van twee tot 10 microgram van de totale RNA-sjabloon met behulp van de 5'RACE CDS primer en de SMART-PCR oligonucleotide volgens de instructies van de fabrikant.

Voor de muis immunoglobuline, PCR versterken cDNA met high-fidelity DNA polymerase, met behulp van de universele voorwaartse primer en immunoglobuline klasse-specifieke reverse primers, zoals beschreven in het tekstprotocol. Voor de menselijke immunoglobuline voert u de eerste PCR uit met behulp van de universele voorwaartse primer en immunoglobuline klasse-specifieke omgekeerde primers met tagsequenties. Voeg de indexsequenties voor elk voorbeeld per tweede PCR toe met behulp van indexreeksprimers.

Vervolgens elektroforese een van de PCR-producten op een 2%agarose gel. Visualiseer de DNA-banden op een UV-transilluminator en verdeel de gelschijf met de brede band tussen 600 en 800 basisparen. Voeg 10 microliter membraanbindende oplossing toe per 10 milligram gelschijf.

Meng en broed op 50 tot 65 graden Celsius tot de gelplakjes volledig oplossen. Breng vervolgens de geloplossing over op de spinkolom van het silicamembraan. Was de kolom één keer met wasbuffer en ontwijk het DNA met 50 microliter nuclease-vrij water.

Met behulp van een fluorometer kwantificeren de gezuiverde amplicons en de amplicons van elke immunoglobulineklasse in gelijke hoeveelheden voor NGS-sequencing bundelen. Gebruik hierna een elektroforese op basis van microcapillaire met DNA-formaatchip om de grootte en concentratie van de bibliotheken te bepalen. Bewaar de bibliotheken op min 20 graden Celsius.

Genereer eerst een voorbeeldspreadsheet van de sequencing-run zoals beschreven in het tekstprotocol. Ontdooi vervolgens een reagenscartridge en de bibliotheken. Maak een 0.2 normale oplossing van natriumhydroxide en verdun de bibliotheken om de gewenste molaire concentraties te verkrijgen.

Spoel vervolgens af en droog de stroomcel en voeg 600 microliter van de verdunde en gedenatureerde bibliotheekoplossing toe aan de put van de reagenscartridge en start de sequencing run. Een perspectief van een murine antilichaam repertoire als geheel kan worden verkregen uit cellen of weefsels zoals de milt, beenmerg, lymfeklier, of bloed. Representatieve resultaten van de IgM, IgG1, IgG2c, en immunoglobuline lichtketting repertoires uit een naïeve muis milt worden hier getoond.

In het perceel V(D)J per 3D V(D)J-plot geeft de grootte van elke bal het relatieve aantal reads aan. Met andere woorden, het vertegenwoordigt het aantal antilichaam mRNAs in hele B-cellen. Het 3D-gaas bestaat uit 110 immunoglobuline zware keten V genen, 12 immunoglobuline zware keten D genen, en vier immunoglobuline zware keten J genen, die zijn uitgelijnd om hun volgorde op het chromosoom weerspiegelen.

De 2D VJ plot toont het profiel van VJ herschikking in het IGL repertoire. De lengte van elke balk geeft het relatieve aantal reads aan. De X-as vertegenwoordigt 101 immunoglobuline lichtketen V-kappa genen, en drie immunoglobuline lichtketen V-lambda genen, en de Y-as vertegenwoordigt vier immunoglobuline lichtketen J-kappa genen, en drie immunoglobuline lichtketen J-lambda genen.

Een perspectief van een menselijk antilichaamrepertoire als geheel kan worden geanalyseerd uit verschillende weefsels, waaronder perifere bloedmonopoliecellen of pathologische weefsels. De representatieve resultaten van IgM, totale IgG, totale IgA, IgD, IgE, en IgL repertoires van normale perifere bloed mononucleaire cellen worden hier getoond. Net als het murinemodel wordt het repertoireprofiel van V(D)J herschikking getoond op het 3D V(D)J-plot waarin de grootte van elke bal het relatieve aantal reads vertegenwoordigt.

Het 3D-gaas bestaat uit 56 immunoglobuline zware keten V-genen, 27 immunoglobuline zware keten D-genen en zes immunoglobuline-zware keten J-genen, uitgelijnd in de volgorde waarin ze op het chromosoom verschijnen. Het profiel van VJ herschikt in het IgL repertoire is afgebeeld in het 2D VJ plot waarin de lengte van elke balk het relatieve aantal leest vertegenwoordigt. De X-as vertegenwoordigt 41 immunoglobuline lichtketen V-kappa genen, en 32 immunoglobuline lichtketen V-lambda genen, en de Y-as vertegenwoordigt vijf immunoglobuline lichtketen J-kappa genen, en vijf immunoglobuline lichtketen J-lambda genen.

In het studiemateriaal van dit protocol is een klein aantal gesorteerde cellen per stroomcytometrie of zelfs cryosections van pathologische monsters bruikbaar. Echter, zorgvuldige optimalisatie van PCR voorwaarden nodig zal zijn. Omdat de output informatie van dit protocol is enorm, bio-informatica geletterdheid zou helpen bij het vinden van de structuur van het antilichaam netwerk.

Dat zou leiden unpreceded tot diep begrip van het immuunsysteem.