Name: Isolatie en karakterisatie van menselijke navelstreng afkomstige mesenchymale stamcellen van vroeggeboorte en termijn zuigelingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Leer de isolatie en karakterisatie van mesenchymale stamcellen uit de navelstreng van vroeggeboren en a terme zuigelingen. Deze methode biedt betrouwbare proliferatie voor celtherapie en regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door de Grants-in-Aid voor Scientific Research (C) (verlenen van nummer: 25461644) en jonge wetenschappers (B) (verlenen van nummers: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) van JSPS KAKENHI.

Het gebruik van menselijke specimens voor deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van Kobe University Graduate School of Medicine (goedkeuring nr. 1370 en 1694) en uitgevoerd in overeenstemming met de goedgekeurde richtsnoeren.
1. isolatie en de cultuur van UC-MSCs
Opmerking: UC-MSCs werden met succes geïsoleerd, gekweekt, en uitgebreide (meer dan passage nummer 4) van meer dan 200 UCs onderworpen aan dit protocol. Onder meer dan 200 UCs, 100% gebleken succesvolle UC-MSC isolatie, minder dan 5% is gebleken dat accidentele verontreiniging, minder dan 15% groei arrestatie hebben aangetoond, en meer dan 80% succesvolle UC-MSC expansie gebleken.
<ol><li>
Verzamelen van UC.
	<ol>
<li>Bereiden van een plastic buis van 50 mL, een aseptische scissor, en een fles van 500 mL voor alpha gemodificeerde Eagle's minimale essentiële medium (alpha MEM) bij 4 ° C.</li>
		<li>Aseptisch UC uitgesneden met een chirurgische scissor op ongeveer 5-10 cm in lengte en verzamel het kort na de geboorte van de pasgeboren door keizersnede.</li>
		<li>Onmiddellijk plaats van de UC in een plastic buis van 50 mL en Voeg 20-30 mL voor alpha MEM in de buis.</li>
		<li>Bewaar de UC bij kamertemperatuur (RT) totdat het wordt vervoerd naar het laboratorium. Opmerking: Aseptische UC kan worden opgeslagen in serumvrij medium bij RT voor tot 2 dagen. UC verkregen uit naburige ziekenhuizen kan daarom worden verzameld indien het binnen 2 dagen naar het lab is uitgebracht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ontleden van UC.
	<ol>
<li>Bereiden van een kunststof dienblad, gesteriliseerde schaar en pincet, 10 mL pipetten, 25 mL pipetten, twee 60 mm weefselkweek gerechten, met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), gezuiverde enzym past (Zie Tabel van materialen, gereconstitueerd met steriel PBS in een concentratie van 13 Wünsch eenheden/mL en opgeslagen bij-80 ° C), en een verminderde serum medium fles 500 mL (Zie Tabel van materialen).</li>
		<li>Warming-up de PBS, gezuiverde enzym combineert, serum medium, en kweekmedium [alpha MEM met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% antibioticum-antimycotic-oplossing (AA) opgeslagen bij 4 ° C] teruggebracht tot RT.</li>
		<li>Neem de UC uit de buis en plaatst u deze in een plastic lade.</li>
		<li>Wegen en ontleden van 5 g van UC met een gesteriliseerde schaar.</li>
		<li>Giet de UC voor sterilisatie met behulp van een precisiepipet 10 mL 10 mL 70% ethanol.</li>
		<li>Wassen van de UC met 10 mL PBS tweemaal met behulp van een pipet 10 mL.</li>
		<li>De UC in een gesteriliseerde 60 mm weefselkweek schotel plaatsen (Zie Figuur 1, stap 1).</li>
		<li>Voeg 10 mL van verminderde serum medium in de schotel.</li>
		<li>Voeg 0,5 mL van gezuiverde enzym mengsels te bereiken een eindconcentratie van ongeveer 0.62 Wünsch eenheden/mL. Opmerking: Het gebruik van gezuiverde enzym mengsels in plaats van traditionele collagenase is aangetoond dat het verbeteren van het rendement en levensvatbaarheid van UC-MSCs geïsoleerd van UC.</li>
		<li>Snijd de UC in stukken van 2-3 mm met een gesteriliseerde schaar en pincet (Zie Figuur 1, stap 2). Opmerking: Dit proces duurt ongeveer 30 min.</li>
		<li>Incubeer de UC-stukken bij 37 ° C gedurende 30 minuten in een 5% CO2 incubator.</li>
		<li>Snij de stukken UC gedeeltelijk verteerd in kleinere stukken die gemakkelijk doorstromen naar een precisiepipet 25 mL. Opmerking: Dit proces duurt ongeveer 30 min.</li>
		<li>Incubeer de kleinere UC stukken bij 37 ° C gedurende 15-45 min. in een 5% CO2 incubator. Opmerking: Incubatie moet blijven totdat de homogenates viskeuze geworden. De totale spijsvertering tijd is ongeveer 120 min. In het geval van het gebruik van UCs van te vroeg geboren baby, echter kan de spijsvertering-tijd worden verkort omdat die gemakkelijk kunnen worden gesneden en verteerd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
UC-MSCs isoleren.
	<ol>
<li>Vier 50 mL plastic buizen en een fles 500 mL gestolde voedingsbodem voorbereiden.</li>
		<li>Verdeel de UC homogenaat in twee 50 mL plastic buizen met behulp van een precisiepipet 25 mL met ongeveer 7,5 mL in elke buis.</li>
		<li>Voeg 20 mL gestolde voedingsbodem in elke buis en meng goed.</li>
		<li>Elke UC homogenaat wordt gefiltreerd door een zeef van 100 µm cel geplaatst bovenop een nieuwe 50 mL collectie buis, met behulp van een precisiepipet 25 mL voor het verzamelen van UC-afgeleide cellen. Opmerking: Dit proces duurt ongeveer 15 minuten elk, zoals de verteerd UC-oplossing kleverig is.</li>
		<li>Centrifugeer twee buizen bij 1.000 x g gedurende 5 min.</li>
		<li>Zorgvuldig de bovendrijvende substantie gecombineerd en verwerpen.</li>
		<li>Resuspendeer de cel pellets in twee buizen met 5 mL gestolde voedingsbodem.</li>
		<li>Spoel de celsuspensie in een nieuwe 60 mm plaat en cultuur bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator (Zie Figuur 1, stap 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cultuur UC-MSCs.
	<ol>
<li>Opwarmen van de PBS, trypsine-EDTA (0,25 w/v%), en cultuur medium (alpha MEM met 10% FBS en 1% AA) aan RT.</li>
		<li>Wanneer cellen zijn gekoppeld aan de plaat van een 60 mm, verwijdert u het kweekmedium en wassen met 5 mL PBS tweemaal te verwijderen van puin en rode bloedcellen. Opmerking: Gekoppelde cellen verschijnen meestal 3-5 dagen na de eerste platen (Zie Figuur 1, stap 4).</li>
		<li>Vervang het kweekmedium tweemaal per week en Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator tot 90-100% confluentie. Opmerking: Dit duurt meestal 7-14 dagen na de eerste beplating.</li>
		<li>Cellen met 5 mL PBS tweemaal wassen, Voeg 0,5 mL trypsine-EDTA en Incubeer bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten.</li>
		<li>Wanneer cellen worden afgerond en vrijstaand, voeg 9 mL gestolde voedingsbodem en meng goed tot de inactivering van trypsine.</li>
		<li>Spoel de celsuspensie in een nieuwe 100 mm plaat en cultuur bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator (Zie Figuur 1, stap 5).</li>
		<li>Vervang het kweekmedium tweemaal per week en Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator tot 90-100% confluentie. Opmerking: Dit duurt meestal 4-8 dagen na de eerste beplating.</li>
		<li>Cellen met 10 mL PBS tweemaal wassen, voeg 1 mL trypsine-EDTA en Incubeer bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten.</li>
		<li>Wanneer cellen worden afgerond en vrijstaand, voeg 9 mL gestolde voedingsbodem en meng goed tot de inactivering van trypsine.</li>
		<li>Spoel de celsuspensie in twee nieuwe 100 mm platen en cultuur bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator (Zie Figuur 1, stap 5).</li>
		<li>Herhaal subcultuur (1:2 splits) tot tiende passage (Zie Figuur 1, stap 5). Opmerking: Omdat cellen gekweekt onder minder confluente voorwaarden de neiging om eerdere arrestatie van proliferatie te bereiken, is het belangrijk op passage cellen met een splitsingsverhouding van 1:2.</li>
		<li>Cellen bij vijfde tot achtste passage gebruiken voor de analyse van de oppervlakte marker van de cel, cel differentiatie assay en andere experimenten. Opmerking: Om te houden van de krachtige proliferatie voor zo lang mogelijk, worden de cellen in het algemeen gekweekt onder meer dan 70-80% confluente voorwaarden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. oppervlakte Marker uitdrukking van UC-MSCs
<ol><li>Bereiden van cellen in een 100 mm plaat en distantiëren ze met 1 mL trypsine-EDTA bij 37 ° C gedurende 5-10 min.</li>
	<li>9 mL gestolde voedingsbodem en centrifuge toevoegen bij 1.000 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>De bovendrijvende substantie gecombineerd en verwerpen.</li>
	<li>Resuspendeer de cel pellets met 10 mL PBS en centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 min. Herhaal deze wassen stap tweemaal.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen met stroom cytometry (FCM) buffer (PBS met 2 mM EDTA en 10% blokkerende reagens) ~ 1 × 106 cellen/ml.</li>
	<li>Pipetteer van 50-100 µL celsuspensie in een tube van 1,5 mL; toevoegen van phycoerythrin (PE)-geconjugeerde antilichamen tegen CD14, CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105 of HLA-DR; en uit te broeden op ijs voor 45 min.</li>
	<li>Wash cellen met FCM buffer tweemaal en voeg 50-100 µL van 0,2% levensvatbaarheid kleurstof-oplossing (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Incubeer bij RT gedurende 15 min, wassen cellen met FCM buffer tweemaal en filter cellen door een zeef van de cel 70 µm.</li>
	<li>Cellen doorlopen met de FCM en analyseren van de verkregen resultaten met behulp van FCM software volgens de instructies van de fabrikant.</li>
</ol>3. Trilineage differentiatie van UC-MSCs
<ol><li>
Uitvoeren van adipogenesis.
	<ol>
<li>Bereid een celsuspensie in een kweekvloeistof bij een concentratie van 5 × 10-3 cellen/mL.</li>
		<li>1 mL celsuspensie in een 12-well plaat plaat en Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator voor ~ 24 h.</li>
		<li>Vervang het kweekmedium met adipogenic differentiatie medium (Zie Tabel van materialen) en Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator voor 2-3 weken. Wijzigen adipogenic differentiatie gemiddeld twee keer per week.</li>
		<li>Spoel de cellen met PBS driemaal.</li>
		<li>Incubeer de cellen in 4% formaldehyde oplossing voor 30 min op RT.</li>
		<li>Spoel de cellen met PBS driemaal en met 60% isopropanol driemaal.</li>
		<li>0,5% olie rood O oplossing voor te bereiden door het oplossen van 84 mg olie rood O in 10 mL 100% isopropanol en toevoeging van 6,7 mL gedestilleerd water. Vlek cellen met 1 mL van 0,5% olie rood O oplossing bij RT voor 20 min.</li>
		<li>Spoel de cellen met 60% isopropanol driemaal en visualiseer onder een microscoop.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Osteogenesis uitvoeren
	<ol>
<li>Bereid een celsuspensie in een kweekvloeistof bij een concentratie van 1 × 104 cellen/mL.</li>
		<li>1 mL celsuspensie in een 12-well plaat plaat en Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator voor ~ 24 h.</li>
		<li>Vervang het kweekmedium met osteogeneic differentiatie medium (Zie Tabel van materialen) en Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator voor 1-2 weken. Wijzigen osteogenic differentiatie gemiddeld twee keer per week.</li>
		<li>Spoel de cellen met PBS driemaal.</li>
		<li>Incubeer de cellen in 4% formaldehyde oplossing voor 30 min op RT.</li>
		<li>Spoel de cellen met PBS driemaal.</li>
		<li>Bereiden van 2% Alizarine rode S-oplossing door ontbinding van 200 mg Alizarine rood S met 10 mL gedestilleerd water. Vlek cellen met 1 mL 2% Alizarine rode S-oplossing op RT gedurende 3 minuten.</li>
		<li>Was de putjes met PBS driemaal en visualiseer onder een microscoop.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Uitvoeren van chondrogenesis.
	<ol>
<li>Bereid een celsuspensie in een kweekvloeistof bij een concentratie van 1,6 × 107 cellen/mL.</li>
		<li>Een droplet 5 µL van celsuspensie plaats in het midden van het goed in een 12-well plaat (micromass culturen) en Incubeer bij 37 ° C in een broedstoof 5% CO2 gedurende 2-3 uur.</li>
		<li>Voeg voorzichtig 1 mL van chondrogenic differentiatie medium (Zie Tabel van materialen) en Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator voor 4-7 dagen. Wijzigen chondrogenic differentiatie gemiddeld twee keer per week.</li>
		<li>Spoel de cellen met PBS driemaal.</li>
		<li>Incubeer de cellen in 4% formaldehyde oplossing voor 30 min op RT.</li>
		<li>Spoel de cellen met PBS driemaal.</li>
		<li>Bereid 0.05% toluïdine blauwe oplossing door ontbinding van 250 mg toluïdine blauw met 500 mL 0,1 M natrium acetaat buffer met pH 4.1. Vlek cellen met 1 mL van 0,05% toluïdine blauwe oplossing bij RT voor 30 min.</li>
		<li>Spoel de cellen met PBS driemaal en visualiseer onder een microscoop.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+of+bone+marrow.+Analysis+of+precursor+cells+for+osteogenic+and+hematopoietic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues.</a> Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).</li>
<li>Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells.</a> Journal of Orthopaedic Research. 9 (5), 641-650 (1991).</li>
<li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).</li>
<li>Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Stem+Cells%3A+Revisiting+History%2C+Concepts%2C+and+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays.</a> Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).</li>
<li>Bianco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BMesenchymal%26%2334%3B+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">34;Mesenchymal&#34; stem cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 677-704 (2014).</li>
<li>Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+proliferative+and+multilineage+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+umbilical+cord+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow.</a> Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).</li>
<li>Manochantr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppressive+properties+of+mesenchymal+stromal+cells+derived+from+amnion%2C+placenta%2C+Wharton%27s+jelly+and+umbilical+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Internal+Medicine+Journal%22%5BJournal%5D)">Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton's jelly and umbilical cord.</a> Internal Medicine Journal. 43 (4), 430-439 (2013).</li>
<li>Arutyunyan, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Umbilical+Cord+as+Prospective+Source+for+Mesenchymal+Stem+Cell-Based+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy.</a> Stem Cells International. 6901286, (2016).</li>
<li>Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+Wharton%27s+Jelly%3A+The+Rich%2C+but+Enigmatic%2C+Source+of+Mesenchymal+Stromal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Concise Review: Wharton's Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (7), 1620-1630 (2017).</li>
<li>Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+therapies+for+the+preterm+infant%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Cell-based therapies for the preterm infant.</a> Cytotherapy. 16 (12), 1614-1628 (2014).</li>
<li>Iwatani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gestational+Age-Dependent+Increase+of+Survival+Motor+Neuron+Protein+in+Umbilical+Cord-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Frontiers in Pediatrics. 5, 194(2017).</li>
<li>Iwatani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+WNT+Signaling+in+the+Regulation+of+Gestational+Age-Dependent+Umbilical+Cord-Derived+Mesenchymal+Stem+Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation.</a> Stem Cells International. , 8749751(2017).</li>
<li>Mennan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterisation+of+mesenchymal+stem+cells+from+different+regions+of+the+human+umbilical+cord%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord.</a> BioMed Research International. 916136, (2013).</li>
<li>Capelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimally+manipulated+whole+human+umbilical+cord+is+a+rich+source+of+clinical-grade+human+mesenchymal+stromal+cells+expanded+in+human+platelet+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate.</a> Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).</li>
<li>Lu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+with+hematopoiesis-supportive+function+and+other+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials.</a> Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).</li>
<li>Tong, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mesenchymal+stem+cell+from+human+umbilical+cord+tissue+using+a+combination+enzymatic+and+mechanical+disassociation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method.</a> Cell Biology International. 35 (3), 221-226 (2011).</li>
<li>Han, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cell+isolation+and+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods.</a> Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).</li>
<li>Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+isolation+protocols+highlights+intrinsic+variability+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Bank%22%5BJournal%5D)">Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells.</a> Cell Tissue Bank. 17 (1), 123-136 (2016).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Mareschi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+pediatric+and+adult+donor+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 97 (4), 744-754 (2006).</li>
<li>Choumerianou, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+stemness+characteristics+of+mesenchymal+cells+from+bone+marrow+of+children+and+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults.</a> Cytotherapy. 12 (7), 881-887 (2010).</li>
<li>Hong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+human+umbilical+cord+perivascular+cells%3A+molecular+and+fate+potential+changes+during+gestation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation.</a> Stem Cells and Development. 22 (17), 2425-2439 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

MSCs kunnen worden geïsoleerd uit een verscheidenheid aan weefsels en heterogene populatie vormen van cellen die niet alle express de dezelfde fenotypische markers doen. We beschreven hier, een protocol dat het verzamelen en de dissectie van UC van vroeggeboorte en termijn zuigelingen begeleidt en maakt isolatie en cultuur van UC-MSCs. Naar aanleiding van dit protocol, hebben we met succes geïsoleerd UC-MSCs die voldoen aan de ISCT criteria19 uit foetussen/zuigelingen op 19-40 weken van de dracht ...

Mesenchymale stamcellen (MSCs) zijn oorspronkelijk geïsoleerd en gekenmerkt uit beenmerg (BM)1,2 , maar kan ook worden verkregen bij een breed scala aan weefsels, met inbegrip van vetweefsel, synovia, huid, tandmerg en foetale aanhangsels 3. MSCs worden erkend als een heterogene celpopulatie die kan vermenigvuldigen en differentiëren in adipocytes, osteocytes en chondrocyten. Daarnaast MSCs beschikken over het vermogen om te migreren naar plaatsen van verwonding, onderdrukken en moduleren immuunresponsen, verbouwen en herstellen van schade. Op dit moment hebben MSCs uit verschillende bronnen groeiende belangstelling aangetrokken als een bron voor celtherapie tegen een aantal hardnekkige ziekten, inclusief graft - versus-klauwzeer host, myocardinfarct en cerebrale infarct4,5 .
Hoewel BM de meest goed gekarakteriseerd bron van MSCs is, beperkt de invasiviteit van BM aspiratie ethisch zijn toegankelijkheid. Capaciteit van de proliferatie en differentiatie van MSCs BM verkregen in het algemeen dalen met de leeftijd van de donor. In tegenstelling, foetale MSCs verkregen foetale aanhangsels zoals de placenta, navelstrengbloed (UCB), en navelstreng (UC) hebben voordelen, waaronder minder ethische bezwaren met betrekking tot bemonstering en robuuste proliferatie en differentiatie capaciteit6 , 7. onder foetale aanhangsels die zijn meestal weggegooid als medisch afval, UCB en UC worden beschouwd als een foetale orgel, terwijl de placenta wordt beschouwd als fetomaternal. Bovendien, moeten placenta en UCB worden bemonsterd en verzameld op het exacte moment van pasgeboren levering, overwegende dat de placenta en UC kan worden verzameld en na de pasgeboren levering verwerkt. Dienovereenkomstig, UC is een veelbelovende MSC-bron voor cel therapie8,9.
Menselijke UC begint te ontwikkelen met geleidelijke uitbreiding van het vruchtwater holte op 4-8 weken van de dracht, blijft tot 50-60 cm in de lengte groeien, en kan worden geïsoleerd gedurende de gehele looptijd van pasgeboren levering10. We gebruiken om inzicht te krijgen in de pathofysiologie van hardnekkige ziekten, UC-afgeleide MSCs (UC-MSCs) van zuigelingen op verschillende zwangerschapsduur leeftijd11,12afgeleverd. In dit protocol beschrijven we hoe u kunt isoleren en karakteriseren van UC-MSCs uit foetussen/zuigelingen op 19-40 weken van de dracht.

<table><tbody><tr><td>50 mL plastic tube</td><td>AS One Coporation, Osaka, Japan</td><td>Violamo 1-3500-22</td><td></td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>AGC Techno Glass, Tokyo, Japan</td><td>Iwaki 3815-012</td><td></td></tr><tr><td>60 mm dish</td><td>AGC Techno Glass, Tokyo, Japan</td><td>Iwaki 3010-060</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer (100 μm)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>Falcon 35-2360</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer (70 μm)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>Falcon 35-2350</td><td></td></tr><tr><td>Alpha MEM</td><td>Wako Pure Chemical, Osaka, Japan</td><td>135-15175</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>172012</td><td></td></tr><tr><td>Reduced serum medium</td><td>Thermo Fisher Scientific, waltham, MA</td><td>OPTI-MEM Gibco 31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-antimycotic</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>Gibco 15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Wako Pure Chemical, Osaka, Japan</td><td>209-16941</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Takara BIO, Shiga,Japan</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>Purified enzyme blends</td><td>Roche, Mannheim, Germany</td><td>Liberase DH Research Grade 05401054001</td><td></td></tr><tr><td>PE-conjugated mouse primary antibody against CD14</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>347497</td><td>Lot: 3220644, RRID: AB_400312</td></tr><tr><td>PE-conjugated mouse primary antibody against CD19</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>340364</td><td>Lot: 3198741, RRID: AB_400018</td></tr><tr><td>PE-conjugated mouse primary antibody against CD34</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>555822</td><td>Lot: 3079912, RRID: AB_396151</td></tr><tr><td>PE-conjugated mouse primary antibody against CD45</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>555483</td><td>Lot: 2300520, RRID: AB_395875</td></tr><tr><td>PE-conjugated mouse primary antibody against CD73</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>550257</td><td>Lot: 3057778, RRID: AB_393561</td></tr><tr><td>PE-conjugated mouse primary antibody against CD90</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>555596</td><td>Lot: 3128616, RRID: AB_395970</td></tr><tr><td>PE-conjugated mouse primary antibody against CD105</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>560839</td><td>Lot: 4339624, RRID: AB_2033932</td></tr><tr><td>PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>347367</td><td>Lot: 3219843, RRID: AB_400293</td></tr><tr><td>PE-conjugated mouse IgG1 k isotype</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>555749</td><td>Lot: 3046675, RRID: AB_396091</td></tr><tr><td>PE-conjugated mouse IgG2a k isotype</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>555574</td><td>Lot: 3035934, RRID: AB_395953</td></tr><tr><td>PE-conjugated mouse IgG2b k isotype</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>555743</td><td>Lot: 3098896, RRID: AB_396086</td></tr><tr><td>Viability dye</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>Fixable Viability Stain 450 562247</td><td></td></tr><tr><td>Blocking reagent</td><td>Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan</td><td>Block Ace UKB80</td><td></td></tr><tr><td>FCM</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>BD FACSAria III Cell Sorter</td><td></td></tr><tr><td>FCM software</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ</td><td>BD FACSDiva</td><td></td></tr><tr><td>Adipogenic differentiation medium</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01</td><td></td></tr><tr><td>Osteogenic differentiation medium</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01</td><td></td></tr><tr><td>Chondrogenic differentiation medium</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Polyscience, Warrigton, PA</td><td>16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Arizarin Red S</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>198161</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Keyence, Osaka, Japan</td><td>BZ-X700</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en karakterisatie van menselijke navelstreng afkomstige mesenchymale stamcellen van vroeggeboorte en termijn zuigelingen

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

Mesenchymale stamcellen (MSCs) hebben aanzienlijke therapeutische mogelijkheden en toenemende belangstelling in de biomedische veld. MSCs zijn oorspronkelijk geïsoleerd en gekenmerkt uit beenmerg (BM), dan verworven weefsel met inbegrip van vetweefsel, synovia, huid, tandmerg en foetale aanhangsels zoals de placenta, navelstrengbloed (UCB), en de navelstreng (UC). MSCs zijn een heterogene celpopulatie met de capaciteit voor (1) naleving van kunststof in standaard kweekomstandigheden, (2) oppervlakte marker uitdrukking van CD73+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19 -/HLA-DR- fenotypen, en (3) trilineage differentiatie in adipocytes, osteocytes en chondrocyten, zoals dat momenteel gedefinieerd door de International Society voor cellulaire therapie (ISCT). Hoewel BM de wijdst gebruikte bron van MSCs is, beperkt het invasieve karakter van BM aspiratie ethisch zijn toegankelijkheid. Capaciteit van de proliferatie en differentiatie van MSCs BM verkregen in het algemeen dalen met de leeftijd van de donor. Daarentegen hebben de foetale MSCs UC verkregen voordelen zoals krachtige proliferatie en differentiatie capaciteit. Er is geen ethische bezorgdheid voor UC bemonstering, zoals het meestal wordt beschouwd als medisch afval. Menselijke UC begint te ontwikkelen met de aanhoudende groei van het vruchtwater spouw op 4-8 weken van de dracht en houdt tot het bereiken van de 50-60 cm in de lengte groeien, en gedurende de hele pasgeboren leveringsperiode geïsoleerd kan worden. Om inzicht te krijgen in de pathofysiologie van hardnekkige ziekten, hebben we de UC-afgeleide MSCs (UC-MSCs) van zuigelingen geleverd op verschillende zwangerschapsduur leeftijd gebruikt. In dit protocol beschrijven we de isolatie en de karakterisering van UC-MSCs uit foetussen/zuigelingen op 19-40 weken van de dracht.

De procedures uit UC collectie aan MSC cultuur worden samengevat in Figuur 1. UC van ongeveer 5-10 cm in lengte kan worden verzameld van alle pasgeborenen geleverd door keizersnede. UC begint te ontwikkelen op 4-8 weken van de dracht en blijft groeien tot 50-60 cm in lengte, zoals weergegeven in Figuur 2. Er zijn twee slagaders (A), één ader (V), snoer voering (CL) en Wharton van Jelly (WJ) in UC, zoals afgebeeld in <strong class...

Menselijke navelstreng (UC) kan worden verkregen in de perinatale periode als gevolg van premature, termijn en postterm levering. In dit protocol beschrijven we de isolatie en de karakterisering van UC-afgeleide mesenchymale stamcellen (UC-MSCs) uit foetussen/zuigelingen op 19-40 weken van de dracht.

Isolatie en karakterisatie van menselijke navelstreng afkomstige mesenchymale stamcellen van vroeggeboorte en termijn zuigelingen

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de beraadslaging van UCMSC, zoals de beste bron van USMSC voor celtherapie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een consistente isolatie en krachtige proliferatie van UCMSC van pre-term en term zuigelingen mogelijk maakt. De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot therapie van hardnekkige ziekten.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de beraadslaging van UCMSC, kan het ook worden toegepast op andere MSC-bronnen, zoals vetweefsel, synovium, huid, tandpulp, enzovoort. Over het algemeen zal een individu dat nieuw is bij deze methode worstelen omdat er zoveel variatie is in de stappen van navelstrengdissectie en mesenchymale stamcelisolatie. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang omdat deze stappen moeilijk te leren zijn omdat er verschillende punten zijn die gevoelig zijn om over het hoofd te worden gezien.Om te beginnen met het ontleden van de navelstreng, eerst een metalen lade, gesteriliseerde schaar, en tangen, tien milliliter pipetten, 25 milliliter pipetten, en twee 60 millimeter weefsel cultuur gerechten. Warm op PBS gezuiverde enzymmengsels, een 500 mi

isolation-characterization-human-umbilical-cord-derived-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit protocol beschrijft de isolatie en de daaropvolgende expansie van mesenchymale stromale cellen en endotheelcellen kolonievormende cellen zonder het gebruik van dierlijke serum op autologe paren te genereren voor experimentele transplantatie doeleinden.

Isolatie en dierlijk serum vrije expansie van de mens navelstreng Afgeleid Mesenchymale stromale cellen (MSC&#39;s) en Endotheliale Colony Forming progenitor cellen (ECFCs)

Mesenchymale stamcellen (MSC's) hebben een differentiatiepotentieel naar de osteoblastische lijn wanneer ze worden gestimuleerd met oplosbare factoren of specifieke biomaterialen. Dit werk presenteert een nieuwe optie voor de aflevering van MSC's uit menselijk amnionmembraan (AM-hMSC's) die de boviene botmatrix Nukbone (NKB) gebruikt als een scaffold.

Isolatie van menselijke mesenchymale stamcellen en hun kweek op de poreuze botmatrix

Hier presenteren we een protocol voor de ontleding van menselijke navelstreng (UC) en foetale placenta monster in koord bekleding (CL), Wharton's gelei (WJ), cord-placenta junctie (CPJ) en foetale placenta (FP) voor het isoleren en karakterisering van mesenchymale stromale cellen (MSC's) met de explantaatkweek techniek.

Isolatie en karakterisering van mesenchymale stromale cellen uit menselijke navelstreng en foetale Placenta

Het doel van dit protocol is te isoleren van endotheliale voorlopercellen van bloed van de navelstreng. Enkele van de toepassingen zijn het gebruik van deze cellen als een biomarker voor het identificeren van patiënten met cardiovasculaire risico, behandeling van ischemische ziekten, en creëren weefsel-engineered vasculaire en hart ventiel construeert.

Isolatie van endotheliale voorlopercellen van menselijke navelstrengbloed

We beschrijven een protocol voor de isolatie van mesenchymale stamcellen uit menselijk navelstrengweefsel en hun differentiatie in de skeletspierlijn.

Generatie van mesenchymale stamcellen uit menselijk navelstrengweefsel en hun differentiatie in de skeletspierlijn

Deze studie presenteert een unieke stompe dissectieprocedure om de integriteit van Wharton's jelly (WJ) te behouden, wat resulteert in minder beschadigde WJ en een grotere hoeveelheid en levensvatbaarheid van de geoogste mesenchymale stamcellen (MSC's). De methode vertoont een superieure opbrengst en proliferatief vermogen in vergelijking met conventionele methoden voor scherpe dissectie.

Isolatie van van de navelstreng afgeleide mesenchymale stamcellen met hoge opbrengsten en lage schade

De isolatie van BAMBIhogeMFGE8hoge MSC's, een van de drie belangrijkste subgroepen die heterogene menselijke UC-MSC's vormen, is nuttig voor een volledig begrip van de kenmerken en functies van dit subtype voor de toekomstige toepassing ervan om de klinische werkzaamheid bij specifieke ziekten te verbeteren. Hier presenteren we een methode voor het sorteren van BAMBIhogeMFGE8hoge UC-MSC's.

Isolatie van menselijke BAMBIhogeMFGE8hoge navelstreng-afgeleide mesenchymale stromale cellen

De belangrijkste aderente celtypen die zijn afgeleid van menselijk spierweefsel zijn myogene cellen en fibroblasten. Hier worden celpopulaties verrijkt met behulp van magnetisch geactiveerde celsortering op basis van het CD56-antigeen. Daaropvolgende immunolabeling met specifieke antilichamen en het gebruik van beeldanalysetechnieken maakt kwantificering van cytoplasmatische en nucleaire kenmerken in individuele cellen mogelijk.

Isolatie en Kwantitatieve Immunocytochemische karakterisering van primaire Myogene cellen en fibroblasten van Human Skeletal Muscle

Dit protocol beschrijft de isolatie van satelliet-cellen uit branchiomeric hoofd spieren van een 9 weken oude ratten. De spieren komen uit verschillende kieuwbogen. Vervolgens worden de satelliet cellen gekweekt op een plek bekleding millimeter grootte hun differentiatie te bestuderen. Deze aanpak voorkomt de uitbreiding en de passage van satelliet-cellen.

Isolatie en karakterisering van Satellite Cellen van Rat Head Branchiomeric Spieren

Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van enkele cellen uit zebravis-embryo's, het verrijken van cellen van belang, het vastleggen van zebraviscellen in microfluïdische gebaseerde enkelcellige multiplexsystemen en het beoordelen van genexpressie uit enkele cellen.

Isolatie en karakterisering van enkele cellen van zebravis embryo&#39;s

Leer de isolatie en karakterisatie van mesenchymale stamcellen uit de navelstreng van vroeggeboren en a terme zuigelingen. Deze methode biedt betrouwbare proliferatie voor celtherapie en regeneratieve geneeskunde.

Isolatie en karakterisatie van menselijke navelstreng afkomstige mesenchymale stamcellen van vroeggeboorte en termijn zuigelingen (Video) | JoVE Journal

Isolatie en karakterisatie van menselijke navelstreng afkomstige mesenchymale stamcellen van vroeggeboorte en termijn zuigelingen

Meer video's verkennen