Isolatie en karakterisatie van menselijke navelstreng afkomstige mesenchymale stamcellen van vroeggeboorte en termijn zuigelingen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de beraadslaging van UCMSC, zoals de beste bron van USMSC voor celtherapie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een consistente isolatie en krachtige proliferatie van UCMSC van pre-term en term zuigelingen mogelijk maakt. De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot therapie van hardnekkige ziekten.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de beraadslaging van UCMSC, kan het ook worden toegepast op andere MSC-bronnen, zoals vetweefsel, synovium, huid, tandpulp, enzovoort. Over het algemeen zal een individu dat nieuw is bij deze methode worstelen omdat er zoveel variatie is in de stappen van navelstrengdissectie en mesenchymale stamcelisolatie. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang omdat deze stappen moeilijk te leren zijn omdat er verschillende punten zijn die gevoelig zijn om over het hoofd te worden gezien.

Om te beginnen met het ontleden van de navelstreng, eerst een metalen lade, gesteriliseerde schaar, en tangen, tien milliliter pipetten, 25 milliliter pipetten, en twee 60 millimeter weefsel cultuur gerechten. Warm op PBS gezuiverde enzymmengsels, een 500 milliliter verlaagd serum medium en cultuur medium, tot kamertemperatuur. Verwijder eerder geïsoleerde navelstreng uit een buis van 50 milliliter in alfa-MEM en plaats deze in de plastic lade.

Weeg de navelstreng af en gebruik vervolgens een gesteriliseerde schaar om vijf gram van het snoer te ontleden. Om de navelstreng te steriliseren, gebruik tien milliliter pipet om tien milliliter ethanol erover te gieten. Was vervolgens het snoer twee keer door het toevoegen van tien milliliter PBS met tien milliliter pipet.

Plaats de gewassen navelstreng in de gesteriliseerde 60 millimeter weefselkweekschotel en voeg tien milliliter verlaagd serum medium en 0,5 milliliter gezuiverde enzymmengsels toe. Gebruik gesteriliseerde schaar en tangen om het snoer te snijden in twee tot drie millimeter stukken. Plaats de schotel in een vijf procent kooldioxide incubator en incubeer op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.

Snijd vervolgens de gedeeltelijk verteerde stukken in kleinere stukken, en inculbaat ze op 37 graden Celsius in een vijf procent kooldioxide incubator totdat het homogenaat wordt stroperig. Zorg er tot slot voor dat het homogenaat gemakkelijk door een pipet van 25 milliliter stroomt. Bereid eerst vier, 50 milliliter plastic buizen in een 500 milliliter fles cultuurmedium.

Gebruik een pipet van 25 milliliter om het navelstrenghomogenaat te verdelen in twee, 50 milliliter plastic buizen met ongeveer 7,5 milliliter in elke buis. Voeg vervolgens 20 milliliter cultuurmedium toe aan elke buis en meng goed. Verzamel elk homogenaat met 25 milliliter pipet en filter door een 100 micrometer celzeef geplaatst op de top van een nieuwe 50 milliliter collectie buis.

Centrifuge twee buizen met filtrates op 1000g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Na het einde van de centrifugatie, zorgvuldig aanzuigen van de supernatant en gooi het. Voeg vijf milliliter cultuurmedium toe aan elke buis en schort de celpellets opnieuw op.

Breng de celsuspensie over in een nieuwe 60 millimeter plaat en cultuur bij 37 graden Celsius in een vijf procent koolstofdioxide incubator. Om de UCMSC's te cultuuren, verwarm je de PBS, trypsin EDTA en cultuurmedium tot kamertemperatuur. Wanneer cellen zijn bevestigd aan de plaat, verwijder het medium, en was twee keer met vijf milliliter PBS om puin en rode bloedcellen te verwijderen.

Voeg het kweekmedium en de incubaat toe bij 37 graden Celsius in een vijf procent koolstofdioxide incubator. Vervang het medium twee keer per week, en cultuur de cellen totdat ze 90 tot 100 procent samenvloeiing bereiken. Was vervolgens de cellen twee keer met vijf milliliter PBS, voeg 0,5 milliliter trypsin EDTA toe en broed op 37 graden Celsius gedurende vijf tot tien minuten.

Wanneer cellen worden afgerond en losgemaakt, voeg negen milliliter van cultuur medium, en meng goed te activeren trypsine. Voeg de celsuspensie toe aan een nieuwe 100 millimeter plaat. Laat de cellen groeien op 37 graden Celsius in een vijf procent koolstofdioxide incubator tot ze 90 tot 100 procent samenvloeiing bereiken.

Herhaal trypsinisatie en verdelen in twee nieuwe platen, tot de tiende passage. Oppervlaktemarkeringsexpressie van UCMSC's werd gebruikt als criterium voor hun karakterisering. Wanneer ze werden geïncubeerd met de juiste antilichamen en geanalyseerd door stroomcytomemetrie, werden ze positief bevonden voor msc's kenmerkende markers, maar negatief voor monocytenmacrofage, negatief voor hematapoietische stamcel en ephithelial cell, negatief voor B-cel, negatief voor pan leukocyten, en negatief voor grote histocompatibiliteit complexe markers.

Om trilineage differentiatie capaciteit van USCMSC's van premature en term zuigelingen te evalueren, werden de cellen geïnduceerd om te differentiëren in adipocyten, osteocyten, en chondrocyten. UCMSC's met succes gedifferentieerd in alle drie de soorten mesodermale cellen bevestigen hun differentiatiecapaciteit. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat er vier kritieke stappen.

Het snoer in stukken van twee tot drie centimeter snijden, in kleinere stukken snijden, ervoor zorgen dat het homogenaat gemakkelijk door een pipet van 25 milliliter stroomt en het homogenaat door een 100 micrometercelstrainer filtert.