Name: Bepaling van regelgevende T cel Subsets in lymfkliertest Thymus, alvleesklier aftappen lymfeklier en milt met behulp van Stroom Cytometry (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Leer hoe je regulerende T-cel subsets identificeert in thymus, alvleesklierafvoerende lymfeklier en milt van muizen met behulp van flowcytometrie. Deze kosteneffectieve handmatige methode maakt gedetailleerde immunologische analyse toegankelijk voor onderzoekers.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De huidige studie werd financieel ondersteund door de Zweedse Onderzoeksraad, EXODIAB, de Zweedse Diabetes Foundation, de Zweedse kind Diabetes Fonds, SEB Diabetesfonden en O.E. och Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. Auteurs wil ook bedankt Per-Ola Carlsson en Stellan Sandler voor hun ondersteunt en discussies.

Het Comité van de lokale dierlijke ethiek aan de Universiteit van Uppsala goedgekeurd de dierproeven.
1. het oogsten van organen van dieren
<ol><li>Offeren de muizen door cervicale dislocatie.</li>
	<li>Plaats serie klieren en milt in 20 mL Scintillatie flesjes of 15 mL conische buizen gevuld met 5 mL Hanks´ evenwichtig zoutoplossing (HBSS). Plaats PDLNs in 1,5 mL micro buizen gevuld met 1 mL RPMI 1640. Gebruik de hele zwezerik en milt, en alle van de PDLNs. Opmerking: Organen moeten worden gehouden op het ijs gedurende de hele procedure en de onderzoeker moet proberen om snel bij de voorbereiding van eencellige schorsingen, vooral bij het verwerken van serie weefsel aangezien serie immune cellen kunnen snel worden afgebroken bij hoge temperaturen.</li>
</ol>2. enkele cel los van zwezerik en milt
<ol><li>Knijp de zwezerik en milt grondig met een pincet om de immune cellen vrij te geven. Gooi de resterende serie en milt capsule.</li>
	<li>De celsuspensie overbrengen in een conische tube van 15 mL en centrifugeer bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C tot het vormen van een pellet. Verwijder het supernatant.</li>
	<li>Om lyse van de rode bloedcellen, resuspendeer de celsuspensie in 5 mL 0,2 M NH4Cl en Incubeer bij kamertemperatuur voor 10 min. omkeren de buizen ondersteboven zachtjes elke 2 min. Voeg 5 mL van HBSS aan het eind van de incubatie om te stoppen met de lysis.</li>
	<li>Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet cel in ongeveer 5 mL HBSS. Vul de buizen met HBSS.</li>
	<li>Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet cel in ongeveer 5 mL HBSS. Vul de buizen met HBSS.</li>
	<li>Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet cel in in HBSS voor thymus 5 mL en 10 mL voor de milt.</li>
	<li>1 mL van de serie celsuspensie overdracht en 500 µL van de milt celsuspensie tot 5 mL ronde onderkant buizen met de kappen van de zeef van de cel. De celsuspensie toepassen op de cel zeef caps. Opmerking: Een 35 µm nylon gaas is opgenomen in het GLB. Ongeveer 5-10 miljoen cellen werden verzameld in elke buis.</li>
</ol>3. enkele cel los van PDLN
<ol><li>Plaats een steriele 250 µm metalen gaas over een conische tube van 15 mL in een rack. Spoel de Maas met 1 mL RPMI.</li>
	<li>De lymfklieren overbrengen in de metalen gaas en vermalen hen via de Maas met behulp van een pincet. 1 mL van de RPMI van toepassing op de metalen gaas voor het spoelen van de cellen in de buis. Herhaal 3 keer en verwijderen van de Maas.</li>
	<li>Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet cel in ongeveer 5 mL RPMI. Vul de buizen met RPMI.</li>
	<li>Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet cel in ongeveer 5 mL RPMI. Vul de buizen met RPMI.</li>
	<li>Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet cel in 2 mL zuiver RPMI. Overdracht de celsuspensie 2 mL tot 5 mL ronde onderkant buizen met de kappen van de zeef van de cel. De celsuspensie toepassen op de cel zeef caps.</li>
</ol>4. Stroom Cytometry
<ol><li>Centrifugeer de cel schorsingen van zwezerik, PDLN en milt bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.</li>
	<li>De cellen met de volgende oppervlakte antilichamen in 100 µL van stroom cytometry buffer (FACS buffer) kleuring vlekken: 0,75 µg/100 µL CD4 FITC-geconjugeerd antilichaam, 0.60 µg/100 µL CD8 APC-H7-geconjugeerde antilichaam, 0,30 µg/100 µL CD25 PE-geconjugeerde antilichaam, 5 µL (1:20) APC-geconjugeerde antilichaam Nrp1. Incubeer de buizen op ijs voor 40 min.</li>
	<li>Voeg 200 µL van FACS buffer toe aan elke buis. Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant. Herhaal nog een keer.</li>
	<li>Lossen en permeabilize van de cellen door het resuspending van de cel pellet in 500 µL van Permeabilization fixatie Buffer (PFB). Opmerking: PFB is bereid door mengen 1 deel van fixatie/Permeabilization concentreren met 3 delen van fixatie/Permeabilization verdunningsmiddel.</li>
	<li>De buizen in de koelkast bewaren bij 4 ° C's nachts. Opmerking: Een 1 uur incubatie werkt ook.</li>
	<li>Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet cel in 500 µL van Permeabilization wassen Buffer (PWB). Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant. Opmerking: PWB wordt bereid door verdunning van Permeabilization Buffer (10 x) 1:10 in gedestilleerd water.</li>
	<li>Vlekken van de cellen met de volgende intracellulaire antilichamen in 100 µL van PWB: 0,30 µg/100 µL Foxp3 PE-Cy7-geconjugeerde antilichaam, 4 µL (1:25) Helios PacificBlue-geconjugeerd antilichaam. Incubeer de buizen op het ijs gedurende 1 uur.</li>
	<li>Voeg 500 µL van PWB aan elke buis. Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet cel in 500 µL van PWB. Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet cel in 300 µL van FACS buffer.</li>
	<li>Het analyseren van de cellen in een flow-cytometer.</li>
	<li>Poort van de enkele cellen op basis van kant Scatter-gebied, hoogte en breedte, en vooruit Scatter-gebied, hoogte en breedte. Voert een miljoen gebeurtenissen voor analyse.</li>
	<li>Exporteer de FCS-bestanden van experimenten en analyseren met behulp van een stroom cytometry analyzer software.</li>
</ol>

<ol><li>Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li>
<li>Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+Scurfin+in+CD4%2BCD25%2B+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).</li>
<li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li>
<li>Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+self-tolerance+maintained+by+activated+T+cells+expressing+IL-2+receptor+alpha-chains+%28CD25%29.+Breakdown+of+a+single+mechanism+of+self-tolerance+causes+various+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases.</a> The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).</li>
<li>Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+regulatory+T+cells+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">How regulatory T cells work.</a> Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).</li>
<li>Thornton, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Helios%2C+an+Ikaros+transcription+factor+family+member%2C+differentiates+thymic-derived+from+peripherally+induced+Foxp3%2B+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells.</a> The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).</li>
<li>Weiss, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin+1+is+expressed+on+thymus-derived+natural+regulatory+T+cells%2C+but+not+mucosa-generated+induced+Foxp3%2B+T+reg+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).</li>
<li>Yadav, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin-1+distinguishes+natural+and+inducible+regulatory+T+cells+among+regulatory+T+cell+subsets+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).</li>
<li>Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concomitant+analysis+of+Helios+and+Neuropilin-1+as+a+marker+to+detect+thymic+derived+regulatory+T+cells+in+naive+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice.</a> Scientific Reports. 5, 7767(2015).</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+spleen+with+the+gentleMACS+Dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+Dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).</li>
<li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-35+administration+counteracts+established+murine+type+1+diabetes--possible+involvement+of+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes--possible involvement of regulatory T cells.</a> Scientific Reports. 5, 12633(2015).</li>
<li>Digre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+heparanase+enhances+T+lymphocyte+activities+and+intensifies+the+inflammatory+response+in+a+model+of+murine+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis.</a> Scientific Reports. 7, 46229(2017).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-tumoral+immune+cell+alterations+in+wild+type+and+Shb-deficient+mice+in+response+to+4T1+breast+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas.</a> Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In deze studie, we geïsoleerd van enkele cellen uit de serie klieren, de PDLNs en de milt van knik muizen, en onderzocht de expressie van Helios en Nrp1 in CD4+CD8-CD25+Foxp3+ Treg cellen met behulp van stroom cytometry. In de huidige studie, werden knik muizen gebruikt, die is een lymfkliertest model van type 1 diabetes. In een eerdere studie, hebben we de wild type muis stammen CD-1 en C57BL/6 muizen gebruikt om te onderzoeken of Helios of Nrp1 een betere marker is voor tTreg...

Regulatoire T (Walter) cellen zijn kritisch voor de homeostase van het immuunsysteem. Treg cellen worden gedefinieerd door de uitdrukking van oppervlakte antigenen CD4 en CD25, en de transcriptie factor forkhead vak P3 (Foxp3)1,2,3. Sakaguchi et al. toonde eerst dat CD25 constitutively op T suppressor cellen in muizen4, die een baanbrekende constatering voor de identificatie van menselijke Treg cellen wordt uitgedrukt. Treg cellen spelen een centrale rol bij immuun tolerantie door uit te oefenen een onderdrukkende mogelijkheid via diverse mechanismen, met inbegrip van cytolysis via de secretie van granzymes voor het opwekken van apoptosis, cytokine consumptie en remming door middel van de expressie van cytotoxische T-lymfocyten antigeen 45. Bovendien kunnen ze remmende cytokines zoals transformeren groeifactor bèta (TGF-β), interleukine-10 (IL-10) en IL-355afscheiden. Treg cellen kunnen natuurlijk worden afgeleid uit de thymus, in welk geval zij serie afgeleide Treg (tTreg)-cellen zijn aangewezen, of ze kunnen in dat geval heten ook geïnduceerde Treg (pTreg) cellen in het perifere organen worden opgewekt.
Helios, een lid van de familie Ikaros transcriptie factor werd gemeld dat een marker voor onderscheid te maken tussen tTreg cellen en pTreg cellen6. Later, twee andere groepen gemeld dat Neuropilin 1 (Nrp1), een semaphorin III-receptor, als een oppervlak marker voor tTreg cellen onder bepaalde voorwaarden7,8 dienen kan. Toch, Singh et al. is gebleken dat Helios een betere marker in dit verband in naïef muizen9.
De deelverzamelingen van Treg cellen spelen een centrale rol in het behoud van de homeostase van het immuunsysteem en de bescherming tegen autoimmuniteit en infectie. Daarom is het belangrijk om de getallen en verhoudingen van deze populaties in zowel de lymfoïde en de niet-lymfoïde weefsels. Om dit te bereiken, moet een eencellige schorsingen van deze organen voor te bereiden. Een aantal protocollen zijn beschreven of gebruikt in eerdere studies. Automatische dissociators werden vooral gebruikt in eerder gepubliceerde rapporten10,11. Met behulp van de automatische dissociators is handig en tijdbesparend, maar het is een dure procedure. Daarom hebben we een handmatige methode gebruikt om te bereiden eencellige schorsingen van lymfkliertest serie klieren, de alvleesklier zuig lymfklieren (PDLNs) en de milt van normoglycemic nietzwaarlijvige diabetesmuizen (NOD) en geïsoleerde afzonderlijke cellen van deze organen. Deze methode is gebruikt in onze eerdere studies en we vonden dat de handmatige methode voor het opstellen van één celsuspensie zo efficiënt als automatische dissociator methode9,12,13,14 is. Bovendien, we stroom cytometry gebruikt om te bepalen van de verhoudingen van CD4+CD8-CD25+Foxp3+ Treg cellen en de subsets van Treg cellen tTreg en pTreg cellen. De tTreg en pTreg cellen werden onderscheiden met behulp van Helios en Nrp1 als markeringen voor tTreg cel. Zo blijkt uit onze resultaten dat de handmatige methode voor het voorbereiden van de afzonderlijke cellen efficiënt werkt en de schorsingen bereid eencellige verder kunnen worden gebruikt voor studies met stroom cytometry.

<table><tbody><tr><td>NOD muizen</td><td></td><td></td><td>In-house fokken</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Statens veterinärmedicinska anstalt</td><td>991750</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>EMD Millipore</td><td>1011450500</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Foxp3 / Transcriptiefactor Staining Buffer Set</td><td>ThermoFisher</td><td>00-5523-00</td><td>Bevat Fixatie/Permeabilisatie Concentraat, Fixatie/Permeabilisatie Verdunning en Permeabilisatie Buffer (10x)</td></tr><tr><td>eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer</td><td>ThermoFisher</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>CD4 Monoklonaal Antilichaam (RM4-5), FITC, eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>11-0042-85</td><td></td></tr><tr><td>CD25 Monoklonaal Antilichaam (PC61.5), PE, eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>12-0251-83</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen&nbsp;APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>560182</td><td></td></tr><tr><td>Muis Neuropilin-1 APC-geconjugeerd Antilichaam</td><td>R&amp;D Systems</td><td>FAB5994A</td><td></td></tr><tr><td>FOXP3 Monoklonaal Antilichaam (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>25-5773-82</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue anti-muis/mens Helios Antilichaam</td><td>BioLegend</td><td>137220</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL Ronde Bodem Polystyreen Testbuis, met Celfilter Snap Cap</td><td>CORNING</td><td>352235</td><td>Een 35 &micro;m nylon gaas is opgenomen in de dubbel-positie snap cap</td></tr><tr><td>Buis 15 mL, 120 mm x17 mm, PP</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Micro buis 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Weggeef scintillatie flacons</td><td>WHEATON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometry</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometry analyse software</td><td>Inivai Technologies</td><td>Flowlogic</td><td></td></tr></tbody></table>

bepaling van regelgevende t cel subsets in lymfkliertest thymus, alvleesklier aftappen lymfeklier en milt met behulp van stroom cytometry

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Ons immuunsysteem bestaat uit een aantal en de verscheidenheid van immune cellen, met inbegrip van regulatoire T-cellen (Walter) cellen. Treg cellen kunnen worden onderverdeeld in twee subgroepen, serie afgeleide Treg (tTreg)-cellen en ook geïnduceerde Treg (pTreg) cellen. Ze zijn in verschillende organen van ons lichaam aanwezig en kunnen worden onderscheiden door specifieke markers, zoals Helios en Neuropilin 1. Er werd gemeld dat de tTreg cellen functioneel meer onderdrukkende dan pTreg cellen zijn. Het is daarom belangrijk om te bepalen van het aandeel van zowel tTreg als pTreg cellen, bij het onderzoeken van heterogene cel populaties. Hierin, verzameld wij serie klieren, de alvleesklier zuig lymfklieren en de milt van normoglycemic nietzwaarlijvige diabetesmuizen te onderscheiden van de tTreg cellen van pTreg cellen met behulp van stroom cytometry. Wij kunnen handmatig eencellige schorsingen van deze organen. Fluorescerende geconjugeerd oppervlakte CD4, CD8, CD25 en Neuropilin 1 antilichamen werden gebruikt om de cellen vlek. Ze waren 's nachts in de koelkast bewaren. Op de volgende dag waren de cellen gekleurd met fluorescerende geconjugeerd intracellulaire Foxp3 en Helios antilichamen. Deze markeringen werden gebruikt voor het karakteriseren van de twee subsets van Treg cellen. Dit protocol toont een eenvoudige, maar praktische manier voor te bereiden enkele cellen uit lymfkliertest thymus, alvleesklier aftappen lymfeklier en milt en ze gebruiken voor latere flow cytometrische analyse.

Om te onderzoeken de uitdrukking van Nrp1 en Helios op tTreg en pTreg cellen, wij bereid enkele cellen uit de serie klieren, PDLNs en de milt van normoglycemic knik muizen en gekleurd hen met de Treg cel markeringen CD4, CD25, Foxp3, Helios en Nrp1 voor stroom cytometrische analyse. De resultaten werden geanalyseerd zoals aangegeven in de vertegenwoordiger gating strategieën (Figuur 1). We vonden dat het aandeel van Helios+ cellen onder CD4+</...

Hierin presenteren wij een protocol om te bereiden enkele cellen uit lymfkliertest thymus, alvleesklier aftappen lymfeklier en milt aan verdere studie deze cellen met behulp van stroom cytometry. Bovendien, werd dit protocol gebruikt voor het bepalen van de deelverzamelingen van regulatoire T-cellen met behulp van stroom cytometry.

Bepaling van regelgevende T cel Subsets in lymfkliertest Thymus, alvleesklier aftappen lymfeklier en milt met behulp van Stroom Cytometry

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...

Dit protocol helpt bij het onderzoeken van de rol van immuuncellen in bepaalde organen in gezondheid en pathologie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat dit een kosteneffectieve techniek is omdat het een handmatige techniek is. Het aantonen van de procedure zal Zhengkang Luo, een promovendus uit mijn laboratorium.Om te beginnen, plaats de thymische klieren en milt van eerder geëuthanaseerde muizen in 20 ml scintillatie phials, of 15 ml conische buizen, gevuld met 5 ml van hank's evenwichtige zoutoplossing. Plaats de alvleesklierafvoerende lymfeklieren in 1,5 ml microbuizen gevuld met 1 ml RPMI-1640. Zorg ervoor dat u de hele thymus en milt en alle PDLN's gebruikt.Houd de organen op ijs gedurende de hele procedure. Met behulp van een schaar, grondig knijp de thymus en milt om de immuuncellen vrij te geven. Gooi de resterende thymische en miltcapsules weg.Breng de celsuspensie over op een conische buis van 15 ml. Centrifuge op 433 keer g en bij 4 graden celsius gedurende vijf minuten, en gooi de supernatant. Om de rode bloedcellen te lyse, de celsuspensie opnieuw op te schorten in 5 ml 0,2 Molar ammoniumchloride en tien minuten bij kamertemperatuur in te broeden.Keer de buizen voorzichtig om om de twee minuten. Voeg aan het einde van de incubatie 5 ml HBSS toe om de lyse te stoppen. Centrifugeren de buizen op 433 keer g en bij 4 graden celsius gedurende vijf minuten.Gooi de supernatant weg en schort de cellen opnieuw op in ongeveer 5 ml HBSS. Vul vervolgens de buizen met HBSS. Herhaal dit proces, van het centrifugeren van de monsters tot het vullen van de buis met HBSS, een keer.Centrifuge de buizen nogmaals op 433 keer g en op vier graden celsius gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en hang de pellet opnieuw op in HBSS. Verkrijg 5 ml ronde bodembuizen met cel-zeefdoppen.Breng 1 ml van de thymische celsuspensie en 500 microliter van de splenic celsuspensie naar de buizen door de suspensie op de celsefdoppen aan te brengen. Plaats eerst een conische buis van 15 ml in een rek. Plaats een steriele 250 micrometer metalen gaas over de buis.Spoel het gaas af met 1 ml RPMI. Breng vervolgens de lymfeklieren over op het metalen gaas en gebruik een pincet om ze door het gaas te malen. Breng 1 ml RPMI aan op het gaas om de cellen in de buis te spoelen.Herhaal dit proces van het overbrengen en slijpen van de lymfeklieren drie keer voor elk monster, en verwijder vervolgens het gaas. Centrifugeren de buizen op 433 keer g en op vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en schort de cellen opnieuw op in ongeveer 5 ml RPMI.Vul vervolgens de buizen met RPMI. Herhaal dit proces, van het centrifugeren van de monsters tot het vullen van de buis met RPMI, een keer. Centrifuge de buizen weer op 433 keer g en op vier graden celsius gedurende vijf minuten.Gooi de supernatant weg en hang de celpellet opnieuw op in 2 ml RPMI. Breng 2 ml van de celsuspensie over in 5 ml ronde bodembuizen met celzeefdoppen. Vercentrifugeren eerst de celsuspensie van de thymus-, milt- en PDLN-monsters bij 433 keer g en vijf minuten bij vier graden Celsius.Gooi de supernatant weg. Bevlek de cellen met oppervlakteantilichamen zoals beschreven in het tekstprotocol en ontcubeer de buizen gedurende 40 minuten op ijs. Voeg vervolgens 200 microliters facs-buffer toe aan elke buis.Centrifuge op 433 keer g en op vier graden Celsius gedurende vijf minuten, en gooi de supernatant. Herhaal dit proces, het toevoegen van de buffer, centrifugeren, en het weggooien van de supernatant, een keer. Schort de celpellet opnieuw op in 500 microliter permeabilisatiefixatiebuffer om de cellen te fixeren en te doordrenabiliseren.Breng de buizen 's nachts op vier graden celsius naar een koelkast. De volgende dag, centrifuge de buizen op 433 keer g en op vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en hang de celpellet opnieuw op in 500 microliter permeabilisatiewasbuffer.Centrifugeren de cellen weer op 433 keer g en op vier graden Celsius gedurende vijf minuten en gooi de supernatant. Bevlek de cellen met intracellulaire antilichamen, zoals beschreven in het tekstprotocol. Broed de buizen 1 uur op ijs.Voeg hierna 500 microliter permeabilisatiewasbuffer toe aan elke buis. Centrifuge op 433 keer g en op vier graden celsius gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en hang de pellet opnieuw op in 500 microliter permeabilisatiewasbuffer.Centrifuge nogmaals op 433 keer g en op vier graden celsius gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en hang de celpellet opnieuw op in 300 microliter facs-buffer. Analyseer vervolgens de cellen op een stroomcytometer, zoals beschreven in het tekstprotocol.In deze studie worden enkele cellen geïsoleerd van thymische klieren, PDLN's en milt van normale glycemische NOD-muizen en zijn ze gekleurd met Treg-celmarkers, CD4, CD25, Foxp3, Helios en neuropilin-1 voor stromingscytometrische analyse. De resultaten worden geanalyseerd en worden hier weergegeven als representatieve gating strategieën. Het aandeel van Helios-positieve cellen onder de CD4-positieve, CD8-negatieve, CD25-positieve, Foxp3-positieve Treg cellen wordt gezien als hoger dan dat van Nrp1-positieve cellen in alle drie de organen.Meer dan 80% van de Treg-cellen in de thymus wordt gezien om Helios uit te drukken, wat hoger is dan in de PDLN, en de milt. Het aandeel van nrp1-positieve cellen onder Helios-positieve Treg cellen wordt gezien om hoger in PDLN te zijn dan die in of de thymus of milt. De meerderheid van de Nrp1-positieve Treg cellen ook uitdrukken Helios, en het aandeel van Helios-positieve cellen onder Nrp1 positieve Treg cellen wordt gezien als hoger in de thymus en milt dan in de PDLN.Samen geven deze resultaten aan dat Helios een betere marker is om T Treg-cellen te detecteren dan Nrp1. Lymfeklieren zijn klein, maar sommige intracellulaire markers vereisen een groot aantal cellen om een goed signaal in flow cytometrie te geven. Andere methoden kunnen niet worden uitgevoerd na deze procedure, omdat de cellen al zijn gekleurd en dood.Maar de vier celmarkers van het dier kunnen worden vervangen om andere soorten immuuncellen te bestuderen.

determination-regulatory-t-cell-subsets-murine-thymus-pancreatic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit is een snelle en uitgebreide methode van immunofenotypering myeloïde suppressor cellen (MDSC) en het verrijken van...

Voorbereiding van de myeloïde suppressor cellen (MDSC) van naïeve en pancreas tumor-dragende muizen met behulp van flowcytometrie en geautomatiseerde Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

We een flow cytometrie gebaseerde methode om T cel ontwikkeling...

Onderzoek van thymus positieve en negatieve selectie via flowcytometrie

In this video, we describe a protocol for isolating single cells from murine pancreatic draining lymph nodes (PDLNs) and the characterization of regulatory T cells (Tregs) from the single-cell population using flow cytometry. Tregs are identified based on the positive expression of the cell-surface markers CD4, CD25, and Nrp1, along with the nuclear transcription factors Foxp3 and Helios.

Identifying Regulatory T Cell Subsets from Murine Pancreatic Draining Lymph Nodes

Met effector functies te onderscheiden van andere T-cel subsets, zijn Th17 cellen centraal zijn betrokken bij inflammatoire auto-immuniteit. Deze in vitro Th17 differentiatie protocol verschaft een middel om te bepalen of naïeve CD4 + T-lymfocyten kunnen differentiëren in Th17 cellen en hun rol bij auto-immuniteit en gastheerrespons verder te onderzoeken.

Isolatie en Th17 Differentiatie van naïeve CD4 T-lymfocyten

Naïve CD4+ T-cellen polariseren naar verschillende subsets, afhankelijk van de omgeving op het moment van activering.  De differentiatie van naïve CD4+ T-cellen naar verschillende effector-subsets kan in vitro worden bereikt door de toevoeging van T-celreceptor-stimuli en specifieke cytokine-signalen.

Muis Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolatie en<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiatie in T cel subsets

Dit artikel beschrijft spectrale cytometry, een nieuwe benadering flowcytometrie dat de vormen van emissiespectra gebruikt om fluorochromen onderscheiden. Een algoritme vervangt vergoedingen en kan de behandeling van auto-fluorescentie als een onafhankelijke parameter. Deze nieuwe aanpak maakt het mogelijk voor een juiste analyse van de cellen geïsoleerd van vaste organen.

Analyse van celsuspensies Geïsoleerd van vaste weefsels door Spectral flowcytometrie

Dit artikel illustreert een krachtige methode om te kwantificeren mitochondriën of lysosomen in levende cellen. De combinatie van lysosoom - of mitochondriën-specifieke kleurstoffen met fluorescently geconjugeerde antilichamen tegen oppervlakte markeringen zorgt ervoor dat de kwantificering van deze organellen in gemengde cel populaties, zoals primaire cellen geoogst van weefselmonsters, met behulp van Multicolor stroom cytometry.

Multicolor Stroom Cytometry gebaseerde kwantificering van Mitochondria en lysosomen in T cellen

Hier presenteren we een stroom cytometrische protocol ter identificatie van CD4+ en CD8+ T cellen en γδ T cellen, B-cellen, NK-cellen, monocyten in perifere bloed met behulp van slechts twee fluorochromes in plaats van zeven. Met deze aanpak, kunnen vijf extra markeringen op de meeste flow cytometers worden opgeslagen.

Discriminatie van zeven immuun cel deelverzamelingen door twee-fluorescerende Stroom Cytometry

Hier beschrijven we een gedetailleerd en reproduceerbaar stroomcytometrieprotocol om monocyten/macrofaag en T-celsubsets te identificeren met behulp van zowel extra- als intracellulaire kleuringstesten in de murine milt, beenmerg, lymfeklieren en synovaal weefsel, gebruikmakend van een gevestigd chirurgisch model van murineartrose.

Flow Cytometrie Analyse van immune cell subsets binnen de Murine Milt, Beenmerg, lymfeklieren en synoviale weefsel in een artrose model

We beschrijven hierin een eenvoudige analyse van de heterogeniteit van het muriene immuun B-celcompartiment in het peritoneum, milt en beenmergweefsel door middel van flowcytometrie. Het protocol kan worden aangepast en uitgebreid naar andere muizenweefsels.

Flowcytometrische karakterisering van de ontwikkeling van murine B-cellen

Dit protocol biedt een in vitro co-kweekstrategie om de effecten van regulerende T-cellen op de proliferatie en differentiatie van effector T-cellen te onderzoeken.

In vitro Functionele analyse van regulerende T-cellen: Focus op proliferatie en differentiatie

Leer hoe je regulerende T-cel subsets identificeert in thymus, alvleesklierafvoerende lymfeklier en milt van muizen met behulp van flowcytometrie. Deze kosteneffectieve handmatige methode maakt gedetailleerde immunologische analyse toegankelijk voor onderzoekers.

Bepaling van regelgevende T cel Subsets in lymfkliertest Thymus, alvleesklier aftappen lymfeklier en milt met behulp van Stroom Cytometry (Video) | JoVE Journal

Bepaling van regelgevende T cel Subsets in lymfkliertest Thymus, alvleesklier aftappen lymfeklier en milt met behulp van Stroom Cytometry

Meer video's verkennen