Escherichia coli-cel-Free eiwitsynthese gebaseerd: protocollen voor een robuuste, flexibele en toegankelijk platformtechnologie

Dit protocol vereenvoudigt en verduidelijkt de methoden voor de implementatie van zelfhereiïteïnesynthese door niet-deskundigen. Verbeterde toegang tot deze methoden zal helpen bij het ontmarkten van het platform en de brede set van toepassingen die het mogelijk maakt. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de snelheid, kosteneffectiviteit, en het gemak van reactie opgezet in vergelijking met andere zelf re-eiwit synthese platforms.

Ons platform kan een aantal toepassingen mogelijk maken, waaronder functionele genomics, hythopertesting, biosensoren, educatieve kits, en met kleine wijzigingen, metabole manipulatie en genetische code uitbreiding. Hoewel deze techniek alleen basistraining voor laboratorium vereist, moeten nieuwe gebruikers van plan zijn om vertrouwd te raken met technieken zoals sonicatie voor een succesvolle uitvoering van het protocol. Om te beginnen met deze procedure voor te bereiden alle media en cultuur E.coli cellen zoals beschreven in het tekstprotocol.

Plaats een een liter centrifuge fles in een ijswaterbad. Zodra de culturen OD600 bereikt 3.0, giet de cel cultuur in de gekoelde fles. Met behulp van een dubbele bundel balans, voeg water toe aan een tweede een liter centrifuge fles totdat het weegt hetzelfde als de eerste om een evenwicht voor de centrifuge te creëren.

Na het voorkoelen van de centrifuge tot vier graden Celsius, centrifugeren de flessen op 5,000 g en op 10 graden Celsius gedurende 10 minuten om de cellen pellet. Giet hierna langzaam af en gooi de supernatant weg. Plaats de celkorrel op ijs.

Met behulp van een steriele spatel schraap de celpellet uit de centrifugefles en breng deze over naar een koude, 50 milliliter conische buis. Voeg 30 milliliter koude S30 buffer aangevuld met twee millimolar DTT en resuspend de pellet door vortexing in korte uitbarstingen met rustperioden op ijs totdat de pellet volledig is opnieuw opgebouwd met geen brokken. Gebruik hierna nog een conische buis van 50 millimeter gevuld met water als balans om het monster gedurende 10 minuten te centrifugeren bij 5, 000 g en 10 graden Celsius.

Giet af en gooi de supernatant weg. Resuspend de pellet met 20 tot 25 milliliter koude S30 buffer. Centrifuge op 5.000 g en bij 10 graden Celsius gedurende 10 minuten.

Giet uit en gooi de supernatant weg. Voeg vervolgens 30 milliliter S30-buffer toe en versef de pellet met behulp van een vortex zoals eerder beschreven. Zet drie voorgewogen, koude, 50 milliliter conische buizen.

Met behulp van een serologische pipetvuller met een steriele pipet, aliquot tien 10 milliliter pellet suspensie in elke buis. Centrifugeren alle buizen met behulp van de juiste saldi als dat nodig is op 5, 000 g en 10 graden Celsius gedurende 10 minuten. Giet hierna uit en gooi de supernatants weg.

Veeg voorzichtig de binnenkant van elke buis en dop met een schoon weefsel om de toegangsbuffer te verwijderen, terwijl u ervoor zorgt dat u de pellet niet aanraakt. Met behulp van een analytische balans, herwegen de buizen en het verslag van de uiteindelijke pellet gewicht voor elke buis. Om te beginnen, voeg een milliliter koude S30 buffer met 2 millimolar DTT per een gram celmassa aan elke pellet.

Gebruik een vortex om de pellets opnieuw op te lichten zoals eerder beschreven. Breng vervolgens 1,4 milliliter van elke geresuspended pellet over in afzonderlijke 1,5 milliliter Microcentrifugebuizen. Plaats een buis in een ijswaterbad in een beker en plaats de sonicator sonde zodanig dat het niet de bodem of zijkanten van de buis raken.

Soniceer de buis met de amplitude set op 50%gedurende 45 seconden, gevolgd door 59 seconden rust. Zorg ervoor dat de buizen te sluiten en omkeren tijdens de uitperiodes. Direct na de sonicatie, voeg 4,5 microliter van een molaire DTT in het lysaat.

Keer de buis meerdere malen om te mengen en plaats het vervolgens op ijs. Herhaal dit proces, sonicating en het toevoegen van DTT voor elke buis van geresuspended cellen. Centrifugeren de monsters op 18, 000 g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten.

Na deze, pipette elk supernatant in een nieuwe 1,5 milliliter Microcentrifuge buis, waardoor sommige supernatant achter om ervoor te zorgen de pellet niet wordt verstoord. Neem de buizen van supernatant naar het schudden platform van een incubator en incubeer ze op 37 graden Celsius met schudden op 250 RPM gedurende 60 minuten. Dit is de reactie.

Vervolgens centrifugeren de monsters op 10,000 g en op vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Verwijder elke supernatant zonder verstoring van de pellet overbrengen ze naar nieuwe buizen. Maak veel 100 microliter aliquots van het extract voor opslag.

Ten eerste dooioplossing A, oplossing B, de DNA-sjabloon, het BL21DE3-extract, T7 RNA Polymerase en een aliquot van moleculair water op ijs. Label vervolgens de benodigde hoeveelheid microcentrifugebuizen die nodig zijn voor de CFPS-reactie. Meng elk reagens door pipetting of vortexing, voeg dan de oplossing aan de gelabelde reactiebuis, zorg ervoor dat niet vortex de cel extract, maar in plaats daarvan omkeren de buis te mengen.

Zorg ervoor dat de uiteindelijke reactie goed wordt gemengd en combineer tot een enkele 15 microliter kraal aan de onderkant van elke buis. Broed elke reactie zonder te schudden op 37 graden Celsius voor vier uur, of op 30 graden Celsius 's nachts. Om te beginnen, het verkrijgen van een 96 put plaat en belasting 48 microliters van 0,05 molaire HEPES op pH 8 in elk goed nodig voor kwantificering.

Verwijder vervolgens de reactiebuizen uit de couveuse. Meng elke reactie door pipetting op en neer en breng twee microliters van elke reactie in de putten met HEPES. Meng elk goed door pipetting op en neer.

Nadat alle reacties zijn geladen en gemengd, laadt u de plaat in een fluorometer en meet u de SFGFP-eindpuntfluorescerende tl met behulp van een excitatiegolflengte van 485 nanometer en een emissiegolflengte van 510 nanometer. Gebruik een eerder gegenereerde standaardcurve om de concentratie van superfoldered GFP te bepalen uit de verkregen fluorescerende metingen. In deze studie wordt een op sonicatie gebaseerd e.coli extractpreparaat onderzocht.

Celpellets en celextract zijn stabiel bij negatieve 80 graden Celsius gedurende ten minste een jaar. Bovendien kan het celextract ten minste vijf vriesdooicycli ondergaan zonder een aanzienlijk verlies van productiviteit. Sommige stappen binnen dit protocol kunnen worden gevarieerd zonder afbreuk te doen aan de algehele productiviteit van het systeem.

Het meest in het bijzonder kunnen cellen worden geoogst binnen het bereik van 2,7 tot 4,0 optische dichtheid op 600 nanometer zonder een significant effect op de productiviteit van het celextract. De kwaliteit van sjabloon-DNA is echter een bron van batch-to-batch variabiliteit die van invloed is op de volumetrische opbrengsten van de CFPS-reactie. Dit wordt opgelost door het DNA te zuiveren via een Midi of Maxiprep gevolgd door een extra DNA-opruimingsstap.

Het reactievat heeft ook invloed op de volumetrische opbrengsten van de CFPS-reactie. Een toename van oppervlakte-volumeverhouding resulteert in hogere volumetrische opbrengsten. Om de volumetrische opbrengsten van de CFPS-reactie te optimaliseren en de variabiliteit van het celextract batch-to-batch te verminderen, moet voor elk nieuw extractpreparaat een magnesiumtitritie worden uitgevoerd.

Voor celextracten bestaande uit 30 milligram per milliliter totaal eiwit, is de optimale magnesiumconcentratie en het extractvolume om het gebruik van reagens te minimaliseren en de volumetrische opbrengst te maximaliseren respectievelijk 10 millimolar en vijf microliter. Door de reactieschaal te variëren, kunnen gebruikers methoden nastreven variërend van hoge doorvoerscreening tot grootschaligere expressies van een doeleiwit. Deze techniek biedt twee belangrijke voordelen, ten eerste het schermen eiwitproducten sneller, en ten tweede, het synthetiseert moeilijk om eiwitten uit te drukken.

Voorbeelden hiervan zijn eiwitten die cytotoxisch zijn of oxiderende omstandigheden vereisen voor hun functie. Zoals bij elke laboratoriumprocedure moeten alle reagentia met de nodige voorzichtigheid worden behandeld. Bovendien moeten centrifuges altijd in balans zijn en moet oorbescherming worden gebruikt tijdens de sonicatie.