Bio-energetica onderzoek naar Candida albicans met behulp van Real-time extracellulaire Flux Analysis

Dit protocol is belangrijk voor het bepalen van de glycolytische functie en mitochondriale ademhaling in Candida albicans. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt voor mitochondriale functie te meten zonder de noodzaak om mitochondriën te zuiveren van Candida albicans. Deze methode kan worden geoptimaliseerd om de effecten van genetische manipulatie of chemische modulatoren op mitochondriale en glycolytische paden in Candida albicans of andere schimmelpathogenen te onderzoeken.

Deze techniek is relatief eenvoudig. Of afhankelijk van het organisme, het gebruik ervan kan helpen om het celnummer en de concentratie van mitochondriale remmers in hun test te optimaliseren. Los poly-D-Lysine in weefselrasterwater op in een laminaire stroomkap tot een uiteindelijke concentratie van 50 microgram per milliliter.

Meng de oplossing goed en aliquot het in 1,5 milliliter microcentrifuge buizen ervoor te zorgen dat aliquot ten minste 1,3 milliliter per buis. Voeg 50 microliter van dit mengsel toe aan elke put van de testplaat, dek het deksel af en broed een tot twee uur bij kamertemperatuur. Dan aspirate de oplossing.

Spoel de putten van de testplaat één keer af met 500 microliters van steriel weefselkweek water, open het deksel en laat de putten drogen. Als u de plaat niet gebruikt op de dag dat het wordt bereid, bewaar het dan maximaal twee tot drie dagen op vier graden Celsius. De dag voor het experiment, open de extra flux test kit en verwijder de inhoud.

Plaats de sensorcartridge ondersteboven naast de hulpplaat. Vul elke put van de utility plate met een milliliter calibrant en plaats vervolgens de sensor cartridge terug. Zorg ervoor dat de sensoren die fluoroforen bevatten, in de calibrant zijn ondergedompeld.

Incubeer de sensorcartridge bij 37 graden Celsius in een niet-kooldioxide incubator 's nachts. De dag voor de test, inenting van de voorbereide C albicans in de YPD bouillon en groeien 's nachts op 30 graden Celsius in een shaker bij 200 rpm. Verdun op de dag van de test een passend aantal cellen in het testmedium om een uiteindelijke concentratie van 100.000 cellen per 100 microliter op te leveren.

Voeg 100 microliter van de verdunde cellen toe aan elke put van de testplaat, behalve putten A1, B4, C3 en D6. Voeg aan deze putten slechts 100 microliters van testmedium toe voor achtergrondcorrectie. Incubeer de plaat op 37 graden Celsius in een niet-kooldioxide incubator gedurende 60 minuten om de cellen te laten hechten aan het plaatoppervlak. Bereid de verbindingen voor op de mitochondriale functietest bij 10X-concentratie in het overeenkomstige testmedium zoals beschreven in het tekstprotocol.

Voeg 50 microliters SHAM toe aan poort A, 50 microliters oligomycine in poort B, 62 microliters kaliumcyanide in poort C en 68 microliters antimycine A in poort D.Next, bereid de verbindingen voor op de glycolytische stresstest bij 10X-concentratie in het overeenkomstige testmedium zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg 50 microliter glucose toe aan poort A, 55 microliter Oligomycine in poort B, 62 microliters van 2-DG in poort C en 68 microliters antimycine A in poort D.Voordat de test wordt gestart, opent u de extra fluxanalysator en stelt u de testsjabloon in met behulp van het tabblad van de testwizard. Volg de stapsgewijze instructies en vul alle informatie in die tijdens de installatie naar buiten komt.

Een groepsindeling genereren en het protocol instellen zoals beschreven in het tekstprotocol. Sla deze lay-outs op voor de test. Herstel op het moment van de test het opgeslagen protocol door het bijbehorende bestand te openen in de optie geopend bestand op het tabblad van de testwizard.

Laad vervolgens de 10X-verbindingen in de respectievelijke poorten van de gehydrateerde sensorcartridge met de calibrant. Laad de sensorcartridge in de draaglade van de extra flux analyzer. Start de kalibratie door op de startknop op het scherm te klikken.

Voeg vervolgens voorzichtig 350 microliter van het testmedium toe aan de celplaat langs de zijkant van de wanden om celstoring te minimaliseren waardoor het uiteindelijke volume op 450 microliter komt. Vervang de hulpplaat met de remkleur voorziening door de testplaat en zet de test voort. Zodra de test is voltooid, verwijdert u de sensorcartridge en de plaat.

Sla het bestand op in de juiste doelmap. In deze studie worden de bio-energetische functies van de C-albicans beoordeeld door extra flux analyzer. Een mutant die het mitochondriale eiwit mam33 mist, is ook opgenomen, samen met de complementstam om de effecten van de verwijdering van een mitochondriaal eiwit op het zuurstofverbruik en de extracellulaire verzuring te bestuderen.

De C albicans wild type toont een zuurstofverbruik tarief van 145 picomoles per minuut die goed binnen het optimale bereik voor een extracellulaire flux test. Het basale zuurstofverbruik van het wilde type, mam33 mutant en mam33 gevulde stammen vertonen geen verschillen. Evenzo worden er geen significante verschillen gezien in de basale extracellulaire verzuringssnelheden tussen de stammen.

Echter, door het remmen van complex-IV met kaliumcyanide, het wilde type en mam33 mutant, mam33 aangevuld stammen tonen een significante verschuiving in de richting van de glycolyse. De mam33 mutant stam echter niet aan te tonen een compenserende glycolytische verschuiving suggereert dat de compound-IV afhankelijke route is aangetast in deze stam. In de glycolytische stresstest worden cellen gedurende een uur uitgehongerd van glucose en wordt het basale zuurstofverbruik en de extracellulaire verzuring gemeten.

Bij de honger vertoont de mam33 mutant stam een aanzienlijk lager zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring in vergelijking met de andere stammen. Dit suggereert een verminderd gebruik van glucose voor zowel ademhaling als glycolyse wanneer cellen worden gedwongen om de hongertoestand. Na het injecteren van glucose, alle stammen tonen stimulatie van zowel hun zuurstofverbruik tarief en extracellulaire verzuring tarief.

De coating van de testplaat stelt Candida albicans cellen in staat om zich aan de plaat te hechten. Onjuiste aanhankelijkheid van Candida albicans cellen zal invloed hebben op de test resultaat. Na de ontwikkeling van deze techniek is het gebruikt in een breed scala van celtypen en ziekten die aan de manier waarop mitochondriën functioneren tijdens fysiologische en pathologische omstandigheden.

Bijvoorbeeld, met behulp van patiënt-afgeleide en controle cellen in deze test, is het mogelijk om de specifieke vragen van hoe mitochondriale functie wordt gewijzigd te pakken. Zorg moet worden genomen tijdens de voorbereiding van mitochondriale remmers zoals kaliumcyanide en antimycine A, omdat deze verbindingen zijn zeer giftig.