Name: Bio-energetica onderzoek naar Candida albicans met behulp van Real-time extracellulaire Flux Analysis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Leer bio-energetisch onderzoek naar Candida albicans met real-time extracellulaire fluxanalyse. Deze methode meet mitochondriale ademhaling en glycolyse zonder zuivering van mitochondriën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onderzoek in NC lab is gesteund door een subsidie van de National Institutes of Health (NIH) R01AI24499 en een New Jersey Health Foundation (NJHF)-grant, #PC40-18.

Opmerking: De gedetailleerde stapsgewijze protocol van de test is hieronder beschreven, en het schematisch protocol is afgebeeld in Figuur 1.
1. C. albicans spanningen en groei-omstandigheden
<ol><li>Groeien de C. albicans stammen in vloeibare gist Extract-pepton-Dextrose (YPD) medium bij 30 °C in een broedstoof shaker's nachts. Opmerking: Candida stammen als bevroren voorraden te handhaven en te groeien op YPD agar (gistextract 1%, 2% pepton, dextrose van 2% en 2% agar).</li>
</ol>2. bereiding van reagentia
<ol><li>Het medium assay als volgt voorbereiden:<ol>
<li>Voor mitochondriale functie assay, los 1.04 g Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) 1640 poeder en 2 g glucose (2%) in 90 mL steriel water en warm de media tot 37 ° C. Breng de pH op 7.4 met 5 M NaOH en make-up van het volume met steriel water tot 100 mL.</li>
		<li>Voor glycolytic stress assay, los 1.04 g RPMI 1640 poeder alleen in 90 mL steriel water, warm de media tot 37 ° C en breng de pH op 7.4. Waaruit het volume met steriel water tot 100 mL. RPMI 1640 poeder heeft geen bicarbonaat, die essentieel zijn voor het controleren van de pH-verandering als een maatregel van glycolyse tijdens de test.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injectie verbindingen.<ol>
<li>Bereiden van 1 M glucose stock in steriel water en winkel bij-20 ° C.</li>
		<li>Bereiden van 100 mM oligomycin voorraad in dimethylsulfoxide (DMSO), aliquoot in kleine volumes en opgeslagen bij-20 ° C.</li>
		<li>100 mM antimycin A voorraad in DMSO, aliquoot in kleine hoeveelheden voor te bereiden en op te slaan bij-20 ° C.</li>
		<li>100 mM SHAM (salicylhydroxamic zuur) voorraad in ethanol voorbereiden op de dag van de test.</li>
		<li>Bereiden 1 M KCN op in de steriel water op de dag van de test.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. coating van de plaat assay met Poly-D-Lysine (PDL)
Opmerking: Alle uitvoeren de onderstaande stappen in een laminaire kap.
<ol><li>Poly-D-Lysine in weefselkweek rang water zodat 50 µg Mo/mL eindconcentratie ontbinden. Meng het goed en aliquoot in een 1,5 mL microcentrifuge buizen en opgeslagen bij-20 ° C voor de lange termijn. Opmerking: 50 µL per putje nodig is, en voor 24 putten, 1,2 mL is vereist. Daarom aliquot ten minste 1,3 mL per microcentrifuge buis.</li>
	<li>Voeg 50 µL per putje en Incubeer bij kamertemperatuur met het deksel gedekt voor 1-2 h.</li>
	<li>De oplossing gecombineerd en één keer met 500 µL steriele weefselkweek rang water spoelen.</li>
	<li>Open het deksel en laat de putten in de lucht droog. Gebruik de plaat op de dezelfde dag of bewaren bij 4 ° C voor een maximum van 2-3 dagen.</li>
</ol>4. de hydratatie van sensor cartridge
Opmerking: Deze stap uitvoeren, één dag voor het experiment.
<ol><li>Open de extra flux Assay Kit en verwijder de inhoud. Plaats de sensor cartridge ondersteboven naast de utility plaat (Figuur 2).</li>
	<li>Vul elk goed van de utility plaat met 1 mL kalibrant en plaats de sensor cartridge terug. Zorg ervoor dat de sensoren die fluorophores bevatten (voor het meten van de zuurstof en pH) zijn ondergedompeld in de kalibrant.</li>
	<li>Incubeer de sensor cartridge's nachts in een niet-CO2 -incubator bij 37 ° C.</li>
</ol>5. het kweken en zaaien van de cellen in de PDL-gecoate platen
<ol><li>Inoculeer C. albicans in de YPD Bouillon en 's nachts groeien bij 30 ° C in een shaker bij 200 omwentelingen per minuut. Opmerking: Gebaseerd op het ontwerp van de bepaling en de rente, kunnen C. albicans ook worden gekweekt in YPG of minimaal medium.</li>
	<li>Verdun op de dag van de test, een voldoende aantal cellen in de assay middellange tot een uiteindelijke concentratie van 100.000 cellen per 100 µL opleveren.</li>
	<li>Voeg 100 µL van de verdunde cellen in elk putje van de plaat assay behalve putten A1, B4, C3 en D6, waarin slechts 100 µL van het medium assay voor achtergrondcorrectie (Figuur 3) toevoegen.</li>
	<li>De plaat overbrengen in een niet-CO2 -incubator bij 37 ° C en incubeer gedurende 60 min, waarmee de cellen die voldoen aan het oppervlak van de plaat.</li>
</ol>6. assay Protocol
Opmerking: Het protocol hier geschetst is voor de indeling van de 24-well van het instrument. Volumes zal moeten worden aangepast indien een andere indeling wordt gebruikt.
<ol><li>Mitochondriale functie assay<ol>
<li>Voorbereiding van verbindingen<ol>
<li>Verbindingen met 10 x concentratie voor mitochondriale functie assay bereiden: bereiden van 20 mM SHAM, 100 µM Oligomycin, 100 mM KCN, en 20 µM Antimycin A in het overeenkomstige assay-medium.</li>
			<li>Voeg 50 µL SHAM in de A-poort, 55 µL Oligomycin op poort B, 62 µL KCN op poort C en 68 µL Antimycin A op poort D (Figuur 4).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Glycolytic stress test<ol>
<li>Voorbereiding van verbindingen<ol>
<li>Verbindingen met 10 x concentratie voor glycolytic stress assay voor te bereiden. Bereiden van 100 mM glucose, 100 µM Oligomycin, 500 mM 2-Deoxy Glucose (2DG) en 20 µM Antimycin A in het overeenkomstige assay-medium.</li>
			<li>Voeg 50 µL glucose in poort A, 55 µL Oligomycin op poort B, 62 µL 2-DG op poort C en 68 µL Antimycin A op poort overleden</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dienst extra flux analyzer, die zuurstof verbruik rente (OCR) en extracellulaire verzuring (ECAR) van levende cellen in de indeling van een 24-well plaat meet. Het test protocol vooraf instellen.</li>
	<li>Open de extra flux analyzer en de assay sjabloon instellen met behulp van het tabblad assay wizard en volg stap voor stap instructie om alle informatie die uit tijdens de installatie springt in te vullen. Genereren de groep lay-out zoals gelijkaardig aan afgebeeld in Figuur 5. Het protocol instellen zoals weergegeven in tabel 1. Deze indelingen goed vooruit voordat assay instellen en opslaan in de computer. Op het moment van de test, het opgeslagen protocol te herstellen door het bijbehorende bestand te openen in de optie bestand openen op het tabblad wizard assay (Figuur 5).</li>
	<li>De 10 x-verbindingen in de respectieve havens van het patroon van de gehydrateerd sensor met de kalibrant geladen en geladen in de lade van de drager van de extra flux-analyzer. Start de calibratie door te drukken op de knop Start op het scherm.</li>
	<li>350 µL van het medium assay zachtjes aan de plaat van de cel langs de kant van de putten om te minimaliseren van de verstoring van de cel om het eindvolume te 450 µL toevoegen.</li>
	<li>Vervang de hulpprogramma-plaat met de kalibrant met de assay-plaat en blijven.</li>
	<li>Verwijder de cartridge sensor en de plaat zodra de test is voltooid. Sla het bestand in de juiste doelmap.</li>
</ol>7. de gegevensanalyse
<ol><li>Het gebied onder de curve - variantieanalyse (AUC-ANOVA) tabblad analyse in de software gebruiken voor het berekenen van het aanzienlijke verschil tussen de groepen door het selecteren van de respectieve parameters (OCR of ECAR) zoals aangegeven in Figuur 6.</li>
	<li>Selekteer de groepen die moeten worden vergeleken.</li>
	<li>Toevoegen aan de groepen van de analyse voor ANOVA en klik op Ok. Opmerking: Deze AUC ANOVA analyse zal toevoegen een nieuw blad naar het bestand waarin de AUC is berekend voor elke groep en vergeleken tussen hen door ANOVA. Hierdoor wordt een tabel van p-waarden om te laten zien van de betekenis.</li>
</ol>

<ol><li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+killers%3A+human+fungal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).</li>
<li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+bloodstream+infections+in+US+hospitals%3A+analysis+of+24%2C179+cases+from+a+prospective+nationwide+surveillance+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study.</a> Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).</li>
<li>Ascioglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+opportunistic+invasive+fungal+infections+in+immunocompromised+patients+with+cancer+and+hematopoietic+stem+cell+transplants%3A+an+international+consensus%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus.</a> Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).</li>
<li>Stover, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+infection+rates+in+US+children%27s+hospitals%27+neonatal+and+pediatric+intensive+care+units%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Infection+Control%22%5BJournal%5D)">Nosocomial infection rates in US children's hospitals' neonatal and pediatric intensive care units.</a> American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).</li>
<li>Wilson, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+direct+cost+and+incidence+of+systemic+fungal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Value+in+Health%22%5BJournal%5D)">The direct cost and incidence of systemic fungal infections.</a> Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).</li>
<li>Wenzel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+candidemia%3A+risk+factors+and+attributable+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality.</a> Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).</li>
<li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+bloodstream+infections+in+pediatric+patients+in+United+States+hospitals%3A+epidemiology%2C+clinical+features+and+susceptibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Infectious+Disease+Journal%22%5BJournal%5D)">Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities.</a> Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).</li>
<li>Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+death+pathways+in+yeast+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).</li>
<li>Shingu-Vazquez, M., Traven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+fungal+pathogenesis%3A+drug+tolerance%2C+virulence%2C+and+potential+for+antifungal+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy.</a> Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).</li>
<li>Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+impacts+upon+Candida+immunogenicity+and+pathogenicity+at+multiple+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels.</a> Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).</li>
<li>Tucey, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+Homeostasis+Is+Important+for+Immune+Cell+Viability+during+Candida+Challenge+and+Host+Survival+of+Systemic+Fungal+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection.</a> Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).</li>
<li>Barelle, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-specific+regulation+of+central+metabolic+pathways+in+a+fungal+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen.</a> Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).</li>
<li>Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+acetyl+coenzyme+A+synthesis+and+breakdown+in+alternative+carbon+source+utilization+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).</li>
<li>Fradin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocytes+govern+the+transcriptional+response%2C+morphology+and+proliferation+of+Candida+albicans+in+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).</li>
<li>Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+response+of+Candida+albicans+upon+internalization+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages.</a> Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).</li>
<li>Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+alternative+carbon+utilization+pathways+in+Candida+albicans+attenuate+virulence+and+confer+pleiotropic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes.</a> Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).</li>
<li>Bambach, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goa1p+of+Candida+albicans+localizes+to+the+mitochondria+during+stress+and+is+required+for+mitochondrial+function+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+dysfunction+of+mitochondrial+complex+I+of+the+Candida+albicans+goa1+mutant+is+associated+with+increased+reactive+oxidants+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death.</a> Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).</li>
<li>Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+SRR1%2C+a+putative+two-component+response+regulator+gene%2C+is+required+for+stress+adaptation%2C+morphogenesis%2C+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).</li>
<li>Mavrianos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+two-component+signaling+systems+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).</li>
<li>Koch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mitochondrial+GTPase+Gem1+Contributes+to+the+Cell+Wall+Stress+Response+and+Invasive+Growth+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2555(2017).</li>
<li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+sorting+and+assembly+machinery+subunit+Sam37+in+Candida+albicans%3A+insight+into+the+roles+of+mitochondria+in+fitness%2C+cell+wall+integrity%2C+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).</li>
<li>Brandt, M. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrandt%2C+ME+%22Candida+and+Candidiasis%22">Candida and Candidiasis</a>. , American Society for Microbiology Press. book review (2002).</li>
<li>Huh, W. K., Kang, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+functional+expression+of+alternative+oxidase+from+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans.</a> Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).</li>
<li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alternative+oxidase+of+Candida+albicans+causes+reduced+fluconazole+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).</li>
<li>de Moura, M. B., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+analysis+of+intact+mammalian+cells+using+the+Seahorse+XF24+Extracellular+Flux+analyzer+and+a+luciferase+ATP+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

De Bioenergetica extra flux assay dient als een uitstekend middel om het voorlezen van de mitochondriale functie door het meten van de oxidatieve fosforylatie (OXPHOS)-afhankelijke zuurstofverbruik in real-time. Daarnaast kan ook een glycolytic functie die wordt gemeten als een percentage van de extracellulaire verzuring (estafetteovergave in de extracellulaire pH) tegelijkertijd in real-time analyse te worden onderzocht.
Succesvolle beplating van C. albicans in de assay-plaat is een ...

Invasieve schimmelinfecties doden meer dan 1,5 miljoen mensen per jaar wereldwijd. Dit nummer is op de stijging te wijten aan een toename in het aantal mensen met gecompromitteerde immuniteit, met inbegrip van de bejaarden, premature zuigelingen, transplantatie ontvangers en kanker patiënten1. C. albicans is een opportunistische menselijke schimmel pathogeen die een deel uitmaakt van de menselijke darmflora. Hij bewoont ook mucosal oppervlakken en het maag-darmkanaal als een commensale organisme. C. albicans produceert ernstige systemische ziekte bij mensen met immuun tekortkomingen, die een operatie hebben ondergaan, of die zijn behandeld met lange cursussen van antibiotica. De Candida soorten behoren tot de top drie tot vier oorzaken van nosocomiale infectieziekten (NID) in mens2,3,4,5,6,7. Het jaarlijkse globale aantal Candida bloedbaan infecties wordt geschat op 400.000 ~ gevallen, met bijbehorende sterfte van 46-75%1. De jaarlijkse sterfte vanwege candidiasis is ongeveer 10.000 in de Verenigde Staten alleen. De omvang van NID veroorzaakt door schimmels wordt ook weerspiegeld in astronomische geduldige kosten5. In de Verenigde Staten overtreft de jaarlijkse kosten voor de behandeling van invasieve schimmelinfecties 2 miljard dollar, een enorme spanning toe te voegen aan de toch al overbelaste systeem van de gezondheidszorg. Momenteel zijn beschikbare standaard antischimmel therapieën beperkt vanwege toxiciteit, steeds meer voorkomende resistentie en interactie van de drug-drug. Daarom is er dringend behoefte aan nieuwe antischimmel drug targets die in betere behandelingsopties voor hoog-risico patiënten resulteren zal identificeren. Echter is de ontdekking van nieuwe drugs op schimmel doelstellingen ingewikkeld omdat schimmels, eukaryoten zijn. Dit beperkt aanzienlijk het aantal schimmel-specifieke drug targets.
Recente studies hebben aangegeven dat de mitochondriën zijn een essentiële bijdrage aan de schimmel virulentie en tolerantie tot antischimmel geneesmiddelen Aangezien mitochondriën belangrijk voor cellulaire ademhaling, oxidatieve metabolisme, signaaltransductie en apoptosis8 zijn ,9,10,11. Zowel de glycolytic als de niet-glycolytic metabolisme zijn essentieel voor het voortbestaan van C. albicans in de zoogdieren host12,13,14,15,16. Bovendien is verschillende C. albicans mutanten ontbreekt mitochondriale eiwitten, zoals Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 etc. gebleken dat defect in filamentation, een belangrijke virulentiefactor van C. albicans17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Bovendien deze mutanten waren ook aangetoond worden verzacht voor virulentie in een muismodel van verspreid candidiasis17,18,19,20,21 ,22. Dus, schimmel mitochondriën vertegenwoordigen een aantrekkelijk doelwit voor drugontdekking. Echter, de studie van mitochondriale functie in C. albicans is uitdagend omdat C. albicans petite negatieve23, wat betekent is dat het kan niet zonder het mitochondriaal genoom overleven.
Hier beschrijven we een protocol dat kan worden gebruikt voor het onderzoeken van mitochondriale en glycolytic functie in C. albicans zonder de noodzaak voor het zuiveren van de mitochondriën. Deze methode kan ook worden geoptimaliseerd voor het onderzoek naar het effect van de genetische manipulatie of chemische modulatoren op mitochondriale en glycolytic trajecten in C. albicans.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>MT50020PB</td><td></td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>KCN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mito stress kit</td><td>Agilent</td><td>103015-100</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Calbiochem</td><td>495455</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Accumet</td><td>AR20</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red</td><td>Sigma</td><td>P5530</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D lysine</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Santa cruz</td><td>203242</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF24 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>100850-001</td><td></td></tr><tr><td>SHAM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Amresco&nbsp;</td><td>241</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxie pellets</td><td>J.T Baker</td><td>3722</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture grade water</td><td>Gibco</td><td>1523-0147</td><td></td></tr><tr><td>XF assay calibrant solution</td><td>Agilent</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract Peptone Dextrose</td><td>Fisher scientific,</td><td>BP2469</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract Peptone Dextrose Agar</td><td>Sigma</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract Peptone Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G2025</td><td></td></tr></tbody></table>

bio-energetica onderzoek naar candida albicans met behulp van real-time extracellulaire flux analysis

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Mitochondriën zijn essentiële organellen voor het cellulaire metabolisme en het voortbestaan. Een aantal belangrijke gebeurtenissen plaatsvinden in de mitochondriën, zoals cellulaire ademhaling, oxidatieve metabolisme, signaaltransductie en apoptosis. Bijgevolg, mitochondriale dysfunctie wordt gemeld dat een belangrijke rol spelen in de antischimmel drug tolerantie en de virulentie van pathogene schimmels. Recente gegevens hebben ook geleid tot de erkenning van het belang van het mitochondrium als een belangrijke bijdrage geleverd aan schimmel pathogenese. Ondanks het belang van de mitochondriën in de schimmel biologie, zijn gestandaardiseerde methoden om haar functie te begrijpen slecht ontwikkeld. Hier presenteren we een procedure om te bestuderen van de basale zuurstof verbruik tarief (OCR), een maatregel van de mitochondriale ademhaling en extracellulaire verzuring tarieven (ECAR), een maatregel van glycolytic functie bij C. albicans stammen. De hier beschreven methode kan worden toegepast op alle stammen Candidaspp. zonder de noodzaak voor het zuiveren van de mitochondriën van de intact schimmel cellen. Bovendien, dit protocol kan ook worden aangepast aan het scherm voor remmers van mitochondriale functie in C. albicans stammen.

De focus van dit protocol is het bepalen van de bio-energetische functies van C. albicans beoordeeld door extra flux analyzer. Een C. albicans mutant ontbreekt mitochondriale eiwit Mam33 is ook opgenomen samen met haar aanvulling stam, mam33Δ/Δ::MAM33 te bestuderen van de gevolgen van de schrapping van een mitochondriale eiwit voor OCR en ECAR. MAM33 codeert voor een eiwit putatief mitochondriale zure matrix en zijn functie bij Candida is niet ...

Hier presenteren we een stapsgewijze protocol om te onderzoeken de mitochondriale ademhaling en de glycolytic functie in Candida Albicans met behulp van een extra flux-analyzer.

Bio-energetica onderzoek naar Candida albicans met behulp van Real-time extracellulaire Flux Analysis

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

Dit protocol is belangrijk voor het bepalen van de glycolytische functie en mitochondriale ademhaling in Candida albicans. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt voor mitochondriale functie te meten zonder de noodzaak om mitochondriën te zuiveren van Candida albicans. Deze methode kan worden geoptimaliseerd om de effecten van genetische manipulatie of chemische modulatoren op mitochondriale en glycolytische paden in Candida albicans of andere schimmelpathogenen te onderzoeken.Deze techniek is relatief eenvoudig. Of afhankelijk van het organisme, het gebruik ervan kan helpen om het celnummer en de concentratie van mitochondriale remmers in hun test te optimaliseren. Los poly-D-Lysine in weefselrasterwater op in een laminaire stroomkap tot een uiteindelijke concentratie van 50 microgram per milliliter.Meng de oplossing goed en aliquot het in 1,5 milliliter microcentrifuge buizen ervoor te zorgen dat aliquot ten minste 1,3 milliliter per buis. Voeg 50 microliter van dit mengsel toe aan elke put van de testplaat, dek het deksel af en broed een tot twee uur bij kamertemperatuur. Dan aspirate de oplossing.Spoel de putten van de testplaat één keer af met 500 microliters van steriel weefselkweek water, open het deksel en laat de putten drogen. Als u de plaat niet gebruikt op de dag dat het wordt bereid, bewaar het dan maximaal twee tot drie dagen op vier graden Celsius. De dag voor het experiment, open de extra flux test kit en verwijder de inhoud.Plaats de sensorcartridge ondersteboven naast de hulpplaat. Vul elke put van de utility plate met een milliliter calibrant en plaats vervolgens de sensor cartridge terug. Zorg ervoor dat de sensoren die fluoroforen bevatten, in de calibrant zijn ondergedompeld.Incubeer de sensorcartridge bij 37 graden Celsius in een niet-kooldioxide incubator 's nachts. De dag voor de test, inenting van de voorbereide C albicans in de YPD bouillon en groeien 's nachts op 30 graden Celsius in een shaker bij 200 rpm. Verdun op de dag van de test een passend aantal cellen in het testmedium om een uiteindelijke concentratie van 100.000 cellen per 100 microliter op te leveren.Voeg 100 microliter van de verdunde cellen toe aan elke put van de testplaat, behalve putten A1, B4, C3 en D6. Voeg aan deze putten slechts 100 microliters van testmedium toe voor achtergrondcorrectie. Incubeer de plaat op 37 graden Celsius in een niet-kooldioxide incubator gedurende 60 minuten om de cellen te laten hechten aan het plaatoppervlak. Bereid de verbindingen voor op de mitochondriale functietest bij 10X-concentratie in het overeenkomstige testmedium zoals beschreven in het tekstprotocol.Voeg 50 microliters SHAM toe aan poort A, 50 microliters oligomycine in poort B, 62 microliters kaliumcyanide in poort C en 68 microliters antimycine A in poort D.Next, bereid de verbindingen voor op de glycolytische stresstest bij 10X-concentratie in het overeenkomstige testmedium zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg 50 microliter glucose toe aan poort A, 55 microliter Oligomycine in poort B, 62 microliters van 2-DG in poort C en 68 microliters antimycine A in poort D.Voordat de test wordt gestart, opent u de extra fluxanalysator en stelt u de testsjabloon in met behulp van het tabblad van de testwizard. Volg de stapsgewijze instructies en vul alle informatie in die tijdens de installatie naar buiten komt.Een groepsindeling genereren en het protocol instellen zoals beschreven in het tekstprotocol. Sla deze lay-outs op voor de test. Herstel op het moment van de test het opgeslagen protocol door het bijbehorende bestand te openen in de optie geopend bestand op het tabblad van de testwizard.Laad vervolgens de 10X-verbindingen in de respectievelijke poorten van de gehydrateerde sensorcartridge met de calibrant. Laad de sensorcartridge in de draaglade van de extra flux analyzer. Start de kalibratie door op de startknop op het scherm te klikken.Voeg vervolgens voorzichtig 350 microliter van het testmedium toe aan de celplaat langs de zijkant van de wanden om celstoring te minimaliseren waardoor het uiteindelijke volume op 450 microliter komt. Vervang de hulpplaat met de remkleur voorziening door de testplaat en zet de test voort. Zodra de test is voltooid, verwijdert u de sensorcartridge en de plaat.Sla het bestand op in de juiste doelmap. In deze studie worden de bio-energetische functies van de C-albicans beoordeeld door extra flux analyzer. Een mutant die het mitochondriale eiwit mam33 mist, is ook opgenomen, samen met de complementstam om de effecten van de verwijdering van een mitochondriaal eiwit op het zuurstofverbruik en de extracellulaire verzuring te bestuderen.De C albicans wild type toont een zuurstofverbruik tarief van 145 picomoles per minuut die goed binnen het optimale bereik voor een extracellulaire flux test. Het basale zuurstofverbruik van het wilde type, mam33 mutant en mam33 gevulde stammen vertonen geen verschillen. Evenzo worden er geen significante verschillen gezien in de basale extracellulaire verzuringssnelheden tussen de stammen.Echter, door het remmen van complex-IV met kaliumcyanide, het wilde type en mam33 mutant, mam33 aangevuld stammen tonen een significante verschuiving in de richting van de glycolyse. De mam33 mutant stam echter niet aan te tonen een compenserende glycolytische verschuiving suggereert dat de compound-IV afhankelijke route is aangetast in deze stam. In de glycolytische stresstest worden cellen gedurende een uur uitgehongerd van glucose en wordt het basale zuurstofverbruik en de extracellulaire verzuring gemeten.Bij de honger vertoont de mam33 mutant stam een aanzienlijk lager zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring in vergelijking met de andere stammen. Dit suggereert een verminderd gebruik van glucose voor zowel ademhaling als glycolyse wanneer cellen worden gedwongen om de hongertoestand. Na het injecteren van glucose, alle stammen tonen stimulatie van zowel hun zuurstofverbruik tarief en extracellulaire verzuring tarief.De coating van de testplaat stelt Candida albicans cellen in staat om zich aan de plaat te hechten. Onjuiste aanhankelijkheid van Candida albicans cellen zal invloed hebben op de test resultaat. Na de ontwikkeling van deze techniek is het gebruikt in een breed scala van celtypen en ziekten die aan de manier waarop mitochondriën functioneren tijdens fysiologische en pathologische omstandigheden.Bijvoorbeeld, met behulp van patiënt-afgeleide en controle cellen in deze test, is het mogelijk om de specifieke vragen van hoe mitochondriale functie wordt gewijzigd te pakken. Zorg moet worden genomen tijdens de voorbereiding van mitochondriale remmers zoals kaliumcyanide en antimycine A, omdat deze verbindingen zijn zeer giftig.

bio-energetics-investigation-candida-albicans-using-real-time

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This protocol provides a biochemical approach for measuring extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR) of primary leukemic cells with extracellular flux assay. The assessment of the metabolic profile of these cells helps to characterize their demands, leading to personalized therapy.

Extracellular Flux Assay: A Method for Measuring Metabolic Profile of Cells

This video demonstrates the method to analyze energy metabolism in activated human NK cells using an extracellular flux analyzer. Different inhibitors of the electron transport chain complexes impact ATP synthesis, which is measured through the oxygen consumption rate or OCR, providing insights into cellular metabolism and bioenergetics.

Real-Time Monitoring of Energy Metabolism in Human NK Cells Using an Extracellular Flux Analyzer

Deze techniek wordt beschreven real-time opname van zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring tarieven in het netvlies weefsel transplanteren muis met behulp van een extracellulaire flux-analyzer.

Meting van de energie-stofwisseling in transplanteren retinale weefsel met behulp van extracellulaire Flux-analyse

De hier gepresenteerde methode vat geoptimaliseerde protocollen samen voor het beoordelen van cellulaire bio-energetica in niet-adherente muishematopoietische stam en primitieve voorlopercellen (HSPC's) met behulp van de extracellulaire fluxanalysator om de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) en zuurstofverbruikssnelheid (OCR) van HSPC's in realtime te meten.

Beoordeling van cellulaire bio-energetica in hematopoietische stamcellen van muizen en primitieve voorlopercellen met behulp van de extracellulaire fluxanalysator

Real-time cel metabole flux assay meet het zuurstofverbruik en de extracellulaire verzuringssnelheid, die overeenkomt met mitochondriale en glycolytische adenosinetrifosfaatproductie, met behulp van pH- en zuurstofsensoren. Het manuscript legt een methode uit om de energiestatus van osteoblasten en de karakterisering en interpretatie van de cellulaire bio-energetische status te begrijpen.

Real-time cell metabolic flux analyzer gebruiken om osteoblast bio-energetica te monitoren

Deze protocollen zullen gebruikers helpen bij het onderzoeken van mitochondriaal energiemetabolisme in 3D-kankercellijn-afgeleide sferoïden met behulp van Seahorse extracellulaire fluxanalyse.

Onderzoek naar mitochondriaal energiemetabolisme van enkelvoudige 3D-microtissue-sferoïden met behulp van extracellulaire fluxanalyse

We beschrijven stapsgewijze protocollen die de mitochondriale ademhaling van muis en menselijke neutrofielen en HL60-cellen meten met behulp van de metabole extracellulaire fluxanalysator.

Real-time meting van het mitochondriale bio-energetische profiel van neutrofielen

Alcoholmisbruik schaadt de immuniteit van alveolaire macrofagen (AM) als gevolg van onderdrukte mitochondriale ademhaling en bio-energetica. We hebben onlangs aangetoond dat blootstelling aan ethanol (EtOH) de afhankelijkheid van glutamine voor mitochondriale ademhaling in AM's verhoogt. Hierin worden methoden aangereikt om het gebruik van glutamine voor mitochondriale ademhaling in met EtOH behandelde AM's te bepalen met behulp van een extracellulaire fluxbioanalysator.

Beoordeling van glutamine als brandstofbron voor alveolaire macrofagen blootgesteld aan chronische ethanol met behulp van een extracellulaire fluxbioanalysator

Hier beschrijven we in detail methoden voor het extraheren van macrofagen uit het beenmerg, de milt en het hartinfarct, en vervolgens het beoordelen van de metabole flux in levende cellen.

Analyse van ex vivo metabole flux in milt- en cardiale macrofagen en beenmergmonocyten

Dit protocol maakt gebruik van een bioluminescente reporter, waardoor metingen van transcriptionele activiteit in Saccharomyces eubayanus mogelijk zijn om de overgang van glucose naar maltose te volgen, waardoor real-time analyse van metabole aanpassingen mogelijk is en stamoptimalisatie voor industriële fermentatie onder diverse omstandigheden wordt ondersteund.

In vivo Monitoring van transcriptionele activiteit tijdens metabole overgang met behulp van een bioluminescente reporter in gist

Dit protocol beschrijft een kosteneffectieve manier om een glycolyse-stresstest uit te voeren om metabole herprogrammering in primaire muismicroglia te kwantificeren. Na isolatie en ontstekingsstimulatie wordt de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) gemeten met vers bereide, pH-gecorrigeerde reagentia, gevolgd door eiwitnormalisatie om een nauwkeurige en reproduceerbare beoordeling van glycolytische verschuivingen mogelijk te maken.

Onderzoek naar glycolyse in primaire microglia met behulp van extracellulaire fluxassay

Leer bio-energetisch onderzoek naar Candida albicans met real-time extracellulaire fluxanalyse. Deze methode meet mitochondriale ademhaling en glycolyse zonder zuivering van mitochondriën.

Bio-energetica onderzoek naar Candida albicans met behulp van Real-time extracellulaire Flux Analysis

Meer video's verkennen