Merkel cel Polyomavirus infectie en detectie

We presenteerden het eerste celkweekmodel voor Merkel Cell Polyomavirus infectie. Het protocol omvat isolatie van de huidfibroblasten, voorbereiding van de MCPyV-virusinfectie, immunofluorescente kleuring en de fluorescerende in situ-hybridisatie. Dit protocol maakt het mogelijk om de MCPyV infectieuze cyclus en interacties met gastheercellen te bestuderen, terwijl artefacten in verband met overexpressie van virale genen worden vermeden.

Om te beginnen, gebruik maken van een schaar om het vet en onderhuids weefsel trim off van de menselijke neonatale voorhuid. Snijd het huidmonster in tweeën of kwartjes. Plaats het weefsel in 5 milliliter van 10 milligram per milliliter dis-based II NPBS, aangevuld met antibiotica-antimycotische.

Incubeer op 4 graden Celsius 's nachts. De volgende dag, gebruik microdissection forceps om zorgvuldig te scheiden van de opperhuid van de huidlagen in een 10 centimeter schotel. Breng het resulterende huidweefsel over naar een 15 milliliter conische buis met 5 milliliter van 2 milligram per milliliter collagenase type IV in FBS-vrij medium aangevuld met antibioticum-anitmycoticum.

Incubeer het monster bij 37 graden Celsius in 5%kooldioxide met periodiek schudden gedurende vier tot zes uur, totdat slechts een paar macroscopische weefselaggregaten overblijven. Gebruik hierna een pipet van 10 milliliter om de monsteroplossing 10 keer krachtig op en neer te pipetten, waardoor enkele cellen uit de dermis vrijkomen. Centrifuge vijf minuten op 180 g en gooi de supernatant weg.

Plaat de gescheiden cellen in aangevuld DMEM medium. In de late namiddag of avond, zaad 6 miljoen 293TT28 cellen in een 10 centimeter schotel met aangevuld DMEM medium. Incubeer bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide.

De volgende ochtend, zorg ervoor dat de cellen zijn ongeveer 50%confluent, dan transfect de cellen met 66 microliter van transfection reagens, 12 microgram van re-ligated MCPyV isolaat R17B DNA, 8,4 microgram st expressie plasmid pMtB, en 9,6 microgram van LT expressie plasmid pADL. Incubeer de cellen 's nachts bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide. De volgende dag, wanneer de doorgeïnfecteerde cellen bijna samenvloeiend zijn, trypsinize de cellen en breng ze naar een 15 centimeter schotel voor verdere uitbreiding.

Wanneer dat gerecht bijna confluent wordt, breng de cellen in drie nieuwe schotels van 15 centimeter over. Wanneer die nieuwe gerechten bijna vloeiend worden, oogst je de cellen zoals beschreven in het tekstprotocol. Centrifuge vijf minuten bij kamertemperatuur bij kamertemperatuur.

Verwijder vervolgens de supernatant en voeg een celvolume DPBS magnesium toe. Voeg 25 micromolar ammoniumsulfaat toe, gevolgd door 0,5%Triton X-100, 0,1% benzonase en 0,1% van een ATP-afhankelijke DNAse. Meng goed en incubeer op 37 graden Celsius 's nachts.

De volgende dag koel je het mengsel 15 minuten op ijs. Voeg vervolgens 0,17 volume natriumchloride toe. Meng en broed nog 15 minuten op het ijs.

Centrifuge op 12 duizend g bij 4 graden Celsius gedurende 10 minuten. Als de supernatant niet duidelijk is, kan u de buis voorzichtig omkeren en de centrifugatie herhalen. Breng hierna de supernatant over naar een nieuwe buis.

Resuspend de pellet in 1 volume van DPBS aangevuld met 0,8 moedervlekken natriumchloride. Centrifuge op 12 duizend g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Als de supernatant niet duidelijk is, kan u de buis voorzichtig omkeren en de centrifugatie herhalen.

Combineer de twee supernatants en centrifuge weer op 12 duizend g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Gebruik vervolgens een pipet om gradiënten van iodixanol te deponeren in dunwandige vijf milliliter polyallomerenbuizen zoals beschreven in het tekstprotocol. Laad 3 milliliter van het geklaarde virushoudende supernatant bovenop het voorbereide iodixanolgradiënt.

Centrifuge met een SW 55 Ti rotor op 234 duizend g en bij 16 graden Celsius gedurende 3,5 uur, ervoor te zorgen dat de versnelling en vertraging te vertragen. Nadat de ultracentrifugatie is voltooid, verzamel 12 fracties in siliconen buizen. Na het onderhouden en losmaken van de cellen, op 10 milliliter van aangevulde DMEM en F12 medium aan de schotel.

Breng de celoplossing over naar een buis van 15 milliliter. Centrifuge op 180 g gedurende twee minuten. Gooi de supernatant weg en schort de cellen opnieuw op in het aanvullende DMEM- en F12-medium met een celdichtheid tussen 20 duizend en 40 duizend cellen per milliliter.

Dan, zaad 200 of 400 microliter van de cel suspensie aangevuld met 1 milligram per milliliter collagenase type IV in elke put van een 24 of 96 put plaat, respectievelijk. Haal de MCPyV viron voorraad uit de min 80 graden Celsius vriezer en plaats op ijs te ontdooien. Voeg 1 miljard virale genoomequivalenten van MCPyV virions per microliter iodixanol toe voor elke 2500 tot 5000 cellen die moeten worden geïnfecteerd.

Tik voorzichtig op de zijkant van de plaat en broed op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide. Bevestig eerst de cellen op afdekbonen met 4%PFA in PBS gedurende 10 minuten, was vervolgens de afdekkingslips twee keer met PBS en behandel ze met 70% ethanol bij vier graden Celsius 's nachts om de cellen te doorgronden. De volgende dag, vervang de ethanol met sonde hydratatie buffer en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten om pre-hybridiseren van de monsters.

30 minuten voor het einde van de pre-hybridisatie incubatie, verdun de sondes in sonde hybridisatie oplossing bij een 1:500 verdunning en incubeer bij 45 graden Celsius. Wanneer de incubaties zijn voltooid, pipet ongeveer 10 microliter van de verdunde sonde mengsel op een microscoop schuif voor elke cover slip. Plaats elke cover slip cell kant naar beneden op de respectieve druppel van hybridisatie mix.

Met behulp van een liberale hoeveelheid rubbercement, verzegelen de randen en achterkant van elke cover slip naar de dia. Stel de glijbaan op de vlakke kant van een warmteblok en verwarm ze op 94 graden Celsius gedurende drie minuten. Breng hierna de glijbaan over naar een bevochtigde kamer en broed ze 's nachts uit bij 45 graden Celsius.

De volgende dag, gebruik tangen om zorgvuldig schil weg het rubbercement. Plaats het deksel glijdt cel kant omhoog in de putten van een 24 put plaat en was ze met sonde wassen buffer drie keer op kamertemperatuur. Voeg 200 microliter versterkingsbuffer toe aan elke put met een afdeksel en incubbate bij kamertemperatuur gedurende 30 tot 60 minuten.

Ondertussen, anneal elk van de twee gelabeld oligonucleotide haarspeldbochten herkennen van de sondes in aparte PCR buizen door ze te verwarmen tot 94 graden Celsius voor 90 seconden, en vervolgens koelen ze naar kamertemperatuur voor 30 minuten. Meng de haarspelden door elkaar in de versterkingsbuffer bij een verdunning van 1:50. Vervolgens strek paraffine film over de open aanzijde van een 12 put plaat deksel om een oppervlak te maken voor de versterking reactie.

Pipette 50-100 microliter druppels van het haarspeldmengsel op de paraffinefilm voor elke cover slip. Verwijder met behulp van tangen voorzichtig elke afdeksel uit de pre-versterkingsoplossing en raak de rand aan op een poreus wegwerpdoekje om te drogen. Plaats elke gedroogde cover slip cel kant naar beneden op een versterking druppel.

Breng het plaatdeksel in een bevochtigde kamer en broed 's nachts bij kamertemperatuur en in het donker uit. De volgende dag, terug de cover glijdt naar de putten van de 24 goed plaat. Voeg 5X SSCT met DAPI met een concentratie van 0,5 microgram per milliliter toe aan elke put en broed een uur lang bij kamertemperatuur in.

Daarna was je de monsters twee keer met 5X SSCT bij kamertemperatuur. Monteer de gewassen cover glijdt op microscoop dia's, en gebruik een omgekeerde fluorescentie microscoop om de cellen te analyseren en beeld van de monsters. In deze studie wordt een bijna homogene populatie van menselijke huidfibroblasten geïsoleerd.

Immunofluorescente kleuring blijkt dat bijna 100% van de geïsoleerde menselijke huidcellen positief zijn gekleurd voor huidfibroblasten markers, vimentine, en collageen, maar negatief voor menselijke voorhuid keratinocyte marker K14. MCPyV virions worden vervolgens gegenereerd en na het visualiseren van de band van MCPyV virions geconcentreerd in de kern van het verloop, 500 microliter breuken worden verzameld en MCPyV qPCR wordt uitgevoerd om de piekfracties te identificeren. Immunofluorescente gekleurde beelden van HDFs besmet met MCPyV worden hier getoond, waar cellen die LT-positief, VP1-positief of zowel LT- als VP1-positief zijn, als positief worden beschouwd voor MCPyV-infectie.

Meer dan 30% van de cellen zijn LT-positief, en meer dan 10% zijn VP1 positief. De MCPyV genomen gerepliceerd in de geïnfecteerde cellen worden gedetecteerd met behulp van zowel de HCR-DNA FISH en Immunofluorescent-HCR-DNA FISH. Terwijl de HCR-DNA FISH de lokalisatie van MCPyV DNA in de replicatiefabriek onthult, maken de Immunofluorescent-HCR-DNA FISH-methoden gelijktijdige detectie mogelijk van zowel MCPyV DNA als LT-eiwit co-lokalisatie in de replicatiecentra.

Om de beste virusinfectie efficiëntie te bereiken, is het zeer belangrijk dat MCPyV is geconcentreerd op ten minste 2 x 10 tot 8e virus genoom per microliter, omdat iodoxanol giftig is voor de cellen. Na MCPyV-infectie van de huidfibroblasten kunnen veel moleculaire biologische analyses worden uitgevoerd, waaronder immunofluorescentie, immunoblocking, immunopositivicatie en op qPCR gebaseerde test. Het infectiesysteem dat we hebben beschreven maakt het mogelijk voor onderzoekers om stadia van MCPyV-infectie te bestuderen, zoals nucleaire handel en virale verpakkingen.

MCPyV is een BSL-2 virus, maar er is weinig bekend over het potentieel voor pathologie in de bedragen die in een laboratoriumomgeving worden bereikt. Daarom moeten onderzoekers voorzorgsmaatregelen nemen om blootstelling aan het virus te voorkomen.