Een RVS Protocol voor hoge kwaliteit RNA isolatie van Laser vangen Microdissected Purkinje cellen in het menselijke Post Mortem Cerebellum

Dit protocol is belangrijk, omdat het gebruik maakt van een vlek-vrije visualisatie methode in plaats van kleurstof-gebaseerde visualisatie op post-mortem menselijk hersenweefsel, die helpt behouden RNA integriteit. Het behoud van RNA is een groot voordeel in dit protocol, omdat het nuttig is, niet alleen in postmortem menselijk hersenweefsel, maar ook andere weefseltypen, met een hoge RNase-activiteit. Om te beginnen, verwijder het weefsel uit de vriezer en plaats het op droog ijs voor transport naar de cryostat.

Plaats de schone borstels, de chuck en het weefsel gedurende ten minste 20 minuten in de cryostat, zodat ze de optimale temperatuur kunnen bereiken. Voor cryostats met dubbele kamers en specimen-holding temperaturen, stel de objecttemperatuur op min 16 graden Celsius en de kamertemperatuur op min 18 graden Celsius. Stel de sectiedikte van de cryostat in op 14 micrometer en de trimdikte op 30 micrometer.

Maak vervolgens het podium schoon met een één-op-één mengsel van RNase-ontsmetingsmiddel en 70% ethanol, om bevriezing te voorkomen. Verkrijg een nieuw, wegwerp cryostat mes en maak het schoon met RNase decontaminator. Plaats het gereinigde mes in de bladhouder op het podium.

Maak vervolgens de anti-rolplaat schoon met de RNase-ontsmettingsmiddel. Bevestig de gereinigde plaat aan het podium en wacht minstens 20 minuten tot het mes en de anti-rolplaat op de temperatuur van de cryostat zijn neergeschoten. Snijd eerst een klein stukje weefsel voor doorsnijding, om ervoor te zorgen dat de sectie ongeveer 95% cerebellar cortex is.

Breng het resterende weefsel terug naar droogijs, of een vriezer, bij min 80 graden Celsius. Begin vervolgens langzaam oct op de top van de chuck toe te voegen met een langzame, cirkelvormige beweging. Bouw lagen OTC op totdat er een mount van ongeveer drie millimeter hoog is die de chuck bedekt.

Wanneer de OCT gedeeltelijk bevroren is, maar nog wat vloeistof in het midden heeft, plaats de weefsels bovenop de berg. Laat het weefsel zitten op de top van de OKT voor een tot twee minuten totdat het volledig is bevroren. Breng vervolgens de chuck met de bevroren OKT en weefsel in de cryostat snijarm.

Pas het weefsel zo aan dat het gelijk is met het snijmes en laat het weefsel 20 minuten in de snijarm zitten om zich aan te passen aan de nieuwe temperatuur. De meest kritieke stap is het toestaan van het weefsel om te acclimatiseren in de cryostat snijarm zo lang als nodig is. Als weefsel snippers, purkinje cel visualisatie zal zeer moeilijk zijn.

Ik raad aan om kleinere, dunnere stukjes weefsel te gebruiken, zodat het weefsel sneller kan acclimatiseren. Beweeg hierna het weefsel langzaam dichter bij het mes. Zodra het weefsel het blad heeft bereikt, begint het trimmen proces.

Trim het weefsel twee tot drie keer, totdat de cortex lagen zichtbaar zijn. Plaats en lijn vervolgens de anti-rolplaat net boven het cryostatblad. Snijd vier tot zes secties die 14 micrometer dik zijn, vaststellend dat goed gesneden secties plat onder de anti-roll plaat zal zijn.

Lijn de snijsecties horizontaal over de cryostatfase uit. Hoek een dia op te halen alle van de weefselstukken tegelijk. Direct na het doorsnee van het weefsel, plaats de dia in de schuifhouder met 70% ethanol op ijs gedurende twee minuten.

Breng de glijbaan gedurende 45 seconden met 95% ethanol op ijs naar een schuifhouder. Plaats vervolgens de schuif in de schuifhouder met 100% ethanol bij kamertemperatuur gedurende twee minuten. Dompel de glijbaan drie keer in de schuifhouder met xyleen nummer één bij kamertemperatuur.

Plaats vervolgens de glijbaan in de schuifhouder met xyleen twee op kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Zet de glijbanen in een schone rookkap en laat ze minstens 30 minuten aan de lucht drogen. Als u de glijbanen opslaat, plaatst u elk van beide in een aparte buis van 50 milliliter en plaatst u de buizen maximaal zeven dagen in een vriezer bij min 80 graden Celsius.

Gebruik eerst RNase-ontsmetingsmiddel om het microscooppodium en de cap collection arm schoon te maken. Plaats met gehandschoende handen de glijbaan op de microscoop en een 500 microliter ondoorzichtige dop in de collectiearm. Bij een lage vergroting, lijn de ondoorzichtige dop over de cerebellar weefsel, ervoor te zorgen dat de dop bedekt het hele gebied dat is gevisualiseerd in het oogstuk.

Gebruik een doelstelling van vijf tot 10 keer om de cerebellar-lagen te visualiseren. Plaats de cursor over de sectie waar moleculaire laag en granuale cellaag elkaar kruisen. Ga naar een 40 keer vergroting en visualiseer de purkinjecellen.

Begin ze dan vast te leggen. Om te beginnen RNA collectie na de microdissection, voeg 50 microliter van cel lyse buffer aan de ondoorzichtige dop met de dop naar boven. Sluit de buis voorzichtig over de dop en ga verder met de verzameling zoals beschreven in het tekstprotocol.

In dit protocol wordt vers, bevroren, postmortem, menselijk hersenweefsel voorbereid op UV-laserafvang microdissection. Na cryostat's sectioning in de toegewezen tekentijd, zijn de cellulaire lagen van het cerebellum gemakkelijk zichtbaar met vijf keer en 10 keer objectieve lenzen. Zoals hier te zien, een goede xyleen incubatie zorgt ervoor dat het weefsel donkerder en beter afbakent cellulaire lagen dan ethanol alleen.

Bij het snijden op de laser capture microscoop, de 40 keer objectieve lens is nodig om ervoor te zorgen het vastleggen van alleen purkinje cellen en niet het omliggende weefsel. Zoals hier te zien, een goede incubatie in xyleen produceert een hoge kwaliteit morfologisch intact beeld in vergelijking met ethanol fixatie alleen. De cover slip vermogen van een ondoorzichtige dop wordt vervolgens getest, terwijl andere protocollen gebruik maken van een vloeistof gevulde dop, deze caps kunnen verminderen weefsel visualisatie en veroorzaken het resulterende beeld te worden korrelig en iriserend onder de microscoop.

Visualisatie door middel van een ondoorzichtige dop resulteert echter in het gladgemaakte weefseluiterlijk dat zachter en scherper van vorm is. Representatieve beelden van uitgesneden purkinje cellen op een laag vermogen en op hoog vermogen tonen nauwkeurige verwijdering van alleen de purkinje cel lichaam. Hierna wordt Rnase van hoge kwaliteit verkregen voor latere RNA-sequencing.

Zes representatieve monsters ondergingen RNA-extractie en werden opnieuw opgetrokken in 14 microliter rnase-vrij water en alle zes monsters produceerden RNA-integriteitsnummers van hoge kwaliteit die gelijk zijn aan of groter zijn dan acht. Het belangrijkste om te onthouden is dat weefsel kwaliteit is alles. Zelfs snijden en schuiven zal dit protocol maken of breken.

Na deze procedure kan elke methode die RNA of DNA onderzoekt worden uitgevoerd, met name we onderzoeken ons RNA op differentiële genexpressie, maar ook andere vragen met betrekking tot genregulatie kunnen worden onderzocht. Deze methode kan worden toegepast op elk weefseltype dat specifieke afgebakende morfologie heeft die het gebruik van antigeen of kleurstofspecifieke reagentia niet vereist voor de identificatie van cellen van belang. We hopen dat deze techniek ons zal helpen begrijpen van de genetica van essentiële tremor en andere ziekten die een tremor fenotype hebben.

De gevaarlijkste chemische stof die in dit protocol wordt gebruikt is xyleen. Het moet goed worden behandeld in een rookkap, goed verwijderd, en glijbanen moeten worden toegestaan om voldoende te drogen totdat ze in een open ruimte worden gebruikt. Bovendien, bij het werken met menselijke monsters, biohazardous afval beheer, en veiligheid moet worden gebruikt.